張培風(fēng) ，王長(zhǎng)彪 ，趙興華 ，劉 江 ，韓 斌 ，路貴和

（1.山西大學(xué)生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西 太原 030031）

玉米具有遺傳和基因組工程開發(fā)的悠久歷史，被認(rèn)為是21世紀(jì)應(yīng)用較廣泛的高等植物之一[1]。玉米作為我國(guó)種植面積廣泛的第三大糧食作物，在工業(yè)上供可開發(fā)產(chǎn)品數(shù)量多且運(yùn)用較廣[2]。但是近些年來，由于耕地面積減少，環(huán)境日益惡化，選育優(yōu)質(zhì)玉米品種已成為育種界重中之重。近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)玉米單倍體加倍技術(shù)進(jìn)行了大量研究，國(guó)外一些公司已開發(fā)操作簡(jiǎn)單、效率較高的技術(shù)并進(jìn)行大規(guī)模應(yīng)用[3]，而我國(guó)玉米單倍體加倍技術(shù)的研究仍處于起步階段，在一定程度上通過誘導(dǎo)得到的單倍體種子加倍率較低，進(jìn)一步限制了我國(guó)玉米單倍體加倍技術(shù)在育種中的實(shí)施和進(jìn)步。因此，為了獲得操作簡(jiǎn)便、成本較低、加倍率高的加倍技術(shù)方法，我國(guó)研究人員進(jìn)行了大量的研究。目前，我國(guó)主要采用的加倍技術(shù)有自然加倍法、秋水仙堿和除草劑等試劑化學(xué)加倍法。

筆者主要根據(jù)近幾年對(duì)玉米單倍體化學(xué)加倍技術(shù)的研究進(jìn)展進(jìn)行探討，旨在為科研人員探究玉米單倍體加倍技術(shù)提供參考。

1 獲得玉米單倍體的方法

1.1 利用品種間雜交獲得單倍體

利用植物品種間、自交系間進(jìn)行雜交，使植物染色體發(fā)生異常，產(chǎn)生單倍體。染色體異常主要表現(xiàn)在假配生殖，而假配生殖主要是指異源的精子在沒有與卵細(xì)胞融合的條件下，直接在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)發(fā)生解體，未經(jīng)受精的卵細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育形成單倍體。如母本白菜型油菜與父本甘藍(lán)型油菜雜交，可誘導(dǎo)父本染色體組通過孤雌生殖產(chǎn)生單倍體[4]；黃茄和龍葵之間雜交也可發(fā)生假配生殖產(chǎn)生龍葵單倍體[5]。但有研究表明，這種利用品種間雜交獲得單倍體的發(fā)生頻率較低，難以滿足科研和育種的需要。

1.2 花藥離體培養(yǎng)單倍體

依靠花藥離體培養(yǎng)單倍體的一般過程是：取孕穗期的玉米雄穗，在無菌條件下剝?nèi)』ㄋ幹糜谡T導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待獲得胚狀體后，再轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基上，得到新的植物。該方法便于染色體加倍，但整個(gè)過程通過組織培養(yǎng)進(jìn)行，主要原因是：第一，愈傷組織誘導(dǎo)率在基因型之間差異大；第二，愈傷組織分化的不確定性；第三，愈傷組織培養(yǎng)過程中容易發(fā)生體細(xì)胞變異，如基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異、倍性和異倍體變異等；第四，通過組織培養(yǎng)獲得的單倍體，由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，操作較為復(fù)雜，花藥離體培養(yǎng)在單倍體育種中運(yùn)用受到限制[6]。因此，探究更完善的花藥離體培養(yǎng)技術(shù)成為育種工作者研究的課題。

1.3 輻射誘變或化學(xué)誘導(dǎo)單倍體

輻射誘變主要是將輻射處理后的花粉對(duì)去雄的母本進(jìn)行授粉，產(chǎn)生單倍體。在小麥、玉米等作物上均有利用物理和化學(xué)因素誘導(dǎo)單倍體的報(bào)道[7]。例如，PETOLINO[8]用X射線照射小麥花粉授粉，后代中獲得了17.58%的單倍體植株；RANDOLPH[9]采用5個(gè)不同玉米材料，經(jīng)X射線處理花粉授粉，產(chǎn)生的孤雌生殖單倍體頻率平均可達(dá)0.096%，比相應(yīng)對(duì)照平均提高50%。然而，通過物理和化學(xué)產(chǎn)生誘變的劑量和濃度都需要研究，而且利用輻射和化學(xué)方法需要在嚴(yán)格隔離的環(huán)境下進(jìn)行操作。因此，輻射和誘變誘導(dǎo)單倍體的方法具有較大的局限性。

1.4 誘導(dǎo)系誘導(dǎo)單倍體

目前，獲得單倍體最常用的方法是利用誘導(dǎo)系誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體。1959年，COE[10]以Stock6為父本，與其他雜交系誘導(dǎo)及授粉產(chǎn)出1%～2%的母本。KERMICLE[11]研究表明，以 W23（ig）系母本參照物發(fā)生雜交可產(chǎn)出0～2%的父本單倍體。由于利用誘導(dǎo)系產(chǎn)生單倍體具有誘變頻率低和與另一親本雜交容易受限制的缺點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外很多育種家對(duì)其進(jìn)行了研究和改良。法國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院[12]從W23和Stock6雜交品種中選育出了3.5%的誘導(dǎo)孤雌生殖株；CHALYK 等[13-14]使用 ZMS 改良出的 MHI，KMS，可引起超過3%的胚胎誘導(dǎo)。在我國(guó)，吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院才卓等[15]通過M278對(duì)Stock6進(jìn)行不斷改良，選育出了吉高誘3號(hào)；吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)相關(guān)研究人員通過利用吉高誘3號(hào)、Stock6等誘導(dǎo)系改良出了一系列高誘導(dǎo)率誘導(dǎo)系[16]，這些誘導(dǎo)系的成功選育，加速了玉米單倍體育種技術(shù)在我國(guó)的應(yīng)用。

除此以外，獲得玉米單倍體的方式還包括植物自發(fā)產(chǎn)生法、遠(yuǎn)緣雜交法、X射線和紫外線法等[17-18]。

2 單倍體的鑒定

2.1 田間形態(tài)觀察法

該方法是在田間對(duì)單倍體形態(tài)進(jìn)行鑒定。總體上，玉米單倍體植株生長(zhǎng)緩慢，葉片直立，葉窄，葉色較淺，株高和穗高顯著低于非單倍體。非單倍體是由誘導(dǎo)物產(chǎn)生的二倍體種子，具有一定的雜種優(yōu)勢(shì)和旺盛的生命力，與雜交種植株存在著明顯的差異，因此，在6葉期左右就能區(qū)分單倍體和非單倍體。這也是鑒定玉米單倍體的重要依據(jù)。

2.2 利用分子標(biāo)記鑒定

該方法是利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)雜交組籽?；蛐瓦M(jìn)行鑒定，在操作過程中雖然不受外界條件和植株發(fā)育階段的限制，但成本較高。因此，生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用比較困難。

2.3 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)

利用流式細(xì)胞儀對(duì)玉米植株細(xì)胞處于分裂間期的DNA含量進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)DNA含量所呈現(xiàn)的峰值圖對(duì)玉米單倍體植株進(jìn)行鑒定，該方法較準(zhǔn)確、快速，但無法對(duì)種子進(jìn)行倍性鑒定。此外，由于儀器昂貴、技術(shù)要求高，因此，在田間育種的廣泛應(yīng)用受到極大限制。

2.4 利用遺傳標(biāo)記法篩選

Rl-nj基因最早存在于誘導(dǎo)系Stock6中[19]，可根據(jù)該基因在玉米胚乳粉糊層和胚的盾片中是否表達(dá)紫色花青素這一特性將誘導(dǎo)系的后代進(jìn)行區(qū)分。目前，利用這一存在誘導(dǎo)系間的Rl-nj基因，可對(duì)較大量非單倍體進(jìn)行淘汰[20]，但是由于該基因表達(dá)強(qiáng)度會(huì)受很多因素影響[21]，以及在母本受體攜帶Rl-nj基因或抑制基因時(shí)，該方法未得到廣泛應(yīng)用。為使得技術(shù)更完善，育種家在誘導(dǎo)系中通過整合的基因，借助在玉米莖稈和根系等器官表達(dá)的特點(diǎn)，對(duì)非單倍體植株進(jìn)行篩選和淘汰，但某些較特殊的單倍體如黃綠苗基因作為遺傳標(biāo)記對(duì)單倍體進(jìn)行篩選，會(huì)受到材料遺傳背景的極大限制，無法成為主要的鑒定方法。

3 單倍體的自然加倍

單倍體的自然加倍主要是指在沒有人為干預(yù)條件下使植物細(xì)胞的有絲分裂無法正常進(jìn)行。CHASE[22]研究表明，玉米單倍體一代的自然加倍可控制在10%左右。CHALYK等[23]研究發(fā)現(xiàn)，玉米雌穗恢復(fù)二倍化的機(jī)制高于雄穗。此外，玉米基因型、單倍體細(xì)胞的核內(nèi)復(fù)制、分裂等因素都會(huì)影響單倍體自然加倍的產(chǎn)生[24]；種植季節(jié)和地點(diǎn)也會(huì)影響單倍體的自然加倍。有研究表明，由于生長(zhǎng)前期溫度較低、溫差較大，春季播種的玉米較夏季播種更有助于自然加倍的發(fā)生；段民孝等[25]研究發(fā)現(xiàn)，甘肅地區(qū)的春播和海南地區(qū)的冬播較北京春播玉米發(fā)生自然加倍的概率高。蔡泉等[26]研究發(fā)現(xiàn)，海南地區(qū)玉米單倍體的自然加倍率遠(yuǎn)高于黑龍江地區(qū)。

4 單倍體的化學(xué)加倍

4.1 秋水仙素加倍法

玉米單倍體自然加倍法具有操作簡(jiǎn)便、安全無害的特點(diǎn)，但加倍率較低，因此，要想要提高加倍效率，必須人為對(duì)其進(jìn)行處理。其中，最常見的是秋水仙素加倍法，而利用秋水仙素作為最常用的化學(xué)加倍方法主要包括浸種法、浸根法、注射法和浸芽法。

4.1.1 浸種法 先用凈水浸泡種子24 h，再用不同濃度梯度秋水仙素溶液進(jìn)行處理，最后經(jīng)流水沖洗后進(jìn)行播種。1994年，GAYEN等[27]用不同時(shí)間段和不同濃度的秋水仙素對(duì)浸泡過的胚芽切口的單倍體進(jìn)行處理，結(jié)果表明，秋水仙素在濃度為0.06%、處理時(shí)間為12 h時(shí)，加倍率可達(dá)18%，效果最佳。

4.1.2 浸根法 對(duì)處在幼苗期的單倍體根系，用一定比例的秋水仙素配比液浸泡一段時(shí)間，然后再用清水進(jìn)行沖洗，最后將經(jīng)過處理的幼苗移栽至田間，進(jìn)行加倍情況的觀察和統(tǒng)計(jì)。1955年，SEANEY[28]通過觀察浸泡在0.05%秋水仙素溶液中單倍體的幼苗24 h移栽后發(fā)現(xiàn)，18株單倍體中有12株部分雄花能散粉，而12株對(duì)照中只有3株散粉。文科等[29]采用浸根法，將發(fā)芽5～7 cm的單倍體種子固定并浸泡于一定比例的秋水仙素溶液中，結(jié)果表明，秋水仙素溶液濃度為0.02%時(shí)，加倍效果最佳。但該方法進(jìn)行育苗、處理、移栽等工作繁瑣，所需劑量較大，成本高，移栽后不能充分保證苗木成活率。

4.1.3 注射法 注射法需要借助注射器將配好的秋水仙素溶液對(duì)單倍體進(jìn)行注射。1952年，CHASE等[30]利用甘油水溶液和秋水仙素注射玉米單倍體的盾片節(jié)，獲得了一定數(shù)量的結(jié)實(shí)率。此外，魏俊杰等[31]采用高誘1號(hào)為父本，將不同濃度的溶液分別與二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行配比，然后在6葉期時(shí)對(duì)幼苗的莖尖進(jìn)行注射，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，秋水仙素濃度為0.5%時(shí)，效果最顯著。該方法不需育苗和移栽，操作簡(jiǎn)便且用量少，適于大批材料，但由于植株間存在差異較大，注射部位不易辨認(rèn)，因此，對(duì)注射的技術(shù)要求比較高。

4.1.4 浸芽法 該方法是將單倍體幼芽浸泡于秋水仙堿中進(jìn)行處理。EDER[32]用不同濃度的秋水仙素溶液在不同時(shí)期進(jìn)行浸芽處理，可以得到27.3%的結(jié)實(shí)率。蔡泉等[33]通過浸芽法對(duì)單倍體處理發(fā)現(xiàn)，濃度在0.06%時(shí)的平均存活率可達(dá)71.6%，平均加倍率為21.8%。岳堯海等[34]將0.05%秋水仙素、5%二甲基亞砜混合藥劑浸泡9 h，溫度控制在15℃以下，加倍率可達(dá)38.1%，效果最佳。綜合比較，浸芽法的加倍率可達(dá)30%以上，是一種較為有效的加倍方法，但該方法處理程序復(fù)雜、對(duì)田間管理要求比較高，若管理不佳，幼苗的存活率則會(huì)降低。該方法操作過程中所需秋水仙素溶液較多，因此，需要做好充分的防毒工作。

4.2 除草劑加倍法

秋水仙素毒性較大，很容易造成死苗、畸形等情況，因此，科研人員開始尋找其他替代品，篩選出一些具有類似功能的抗微管除草劑。目前，比較常用的抗微管除草劑包括：氟樂靈、拿草特、甲基胺草磷等。WAN等[35]研究表明，甲基胺草磷、拿草特與秋水仙素能用于誘導(dǎo)花粉愈傷組織的加倍，但無法對(duì)體細(xì)胞的突變加以提高。WAN[36]采用除草劑對(duì)玉米花藥愈傷組織實(shí)現(xiàn)加倍處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，幾種除草劑產(chǎn)生了不同的加倍效果。慈佳賓等[37]采用氟樂靈、拿草特2種除草劑對(duì)玉米單倍體進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸種法氟樂靈濃度為80 μmol/L處理20 h時(shí)，加倍率最高（37.6%）；浸芽法拿草特在濃度為6 μmol/L處理24 h時(shí)，加倍率最高（24.8%）；浸根法氟樂靈40 μmol/L加倍率最高（16.9%）。通過不同處理表明，氟樂靈浸種法對(duì)玉米單倍體加倍效果較好。

5 展望

利用單倍體加倍技術(shù)，可以縮短玉米育種年限，加快育種進(jìn)程。單倍體的自然加倍在加倍方法中操作簡(jiǎn)便，但自然加倍的效率較低。因此，在實(shí)際工作中，秋水仙素作為高效加倍劑已被玉米單倍體加倍廣泛使用，但秋水仙素毒性大、加倍后容易產(chǎn)生畸形苗，因此，尋找可代替秋水仙素的試劑成為今后工作的重點(diǎn)?？傊瑢で蟾咝实募颖都夹g(shù)方法，需要更好地完善單倍體誘導(dǎo)體系、發(fā)揮單倍體加倍技術(shù)，從而提升玉米在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的競(jìng)爭(zhēng)力。

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