溫 賀，肖鳳艷，段翠翠，高 磊，趙玉娟，牛春華，趙 權(quán)，李盛鈺,*

（1.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，吉林 長春 130033；2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院中藥學(xué)院，吉林 吉林 132109；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118）

益生菌是一類對宿主健康有促進作用的活性微生態(tài)制劑[1]，其中乳桿菌和雙歧桿菌是主要的益生菌種類。研究發(fā)現(xiàn)益生菌具有改善腸道、提高免疫力、抗氧化、調(diào)節(jié)血脂代謝、降低過敏反應(yīng)等生理功能[2-5]，其良好的功能特性和健康促進作用已被廣泛接受和認可。益生菌是發(fā)酵食品中普遍存在的微生物，研究人員已經(jīng)從發(fā)酵食品中分離鑒定出眾多不同功能特性的益生菌[6-8]，并不斷被應(yīng)用于健康食品和功能食品中[9]，益生菌對提高食品安全性、豐富營養(yǎng)成分、賦予產(chǎn)品功能特性和改善產(chǎn)品風(fēng)味等起到重要作用[10]。而優(yōu)良益生特性和發(fā)酵特性的益生菌，須經(jīng)嚴格的體外實驗、動物體內(nèi)實驗和人體實驗等篩選獲得。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）Sc52是分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜中的益生菌新菌株，該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏登記號為CGMCC NO.11027。本實驗室前期研究證明植物乳桿菌Sc52是一株具有輔助降血糖作用的益生菌。該菌株通過調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進腸道益生菌生長，降低血清血脂水平，降低機體內(nèi)毒素及炎癥因子水平和改善腸道屏障功能等機制發(fā)揮降血糖作用[11]。而有效活菌株到達腸道并定植是植物乳桿菌Sc52改善腸道功能、輔助降糖的基礎(chǔ)和前提，因此本研究分析了植物乳桿菌Sc52耐受、黏附等體外益生特性，并將其與其他益生菌菌株聯(lián)合發(fā)酵藥食同源原料，制成輔助降血糖固體飲料產(chǎn)品，初步評價產(chǎn)品的降血糖作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級健康雄性ICR（institute of cancer research）小鼠 長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） 北京索萊寶科技有限公司；吐溫-80、牛膽鹽 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；小鼠總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒 南京建成生物工程研究所；小鼠低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、胰島素（insulin，INS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒 上海朗頓生物技術(shù)有限公司；葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶法） 上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；人參、山藥、枸杞子、辣木葉、桑葉為中藥飲片 吉林大藥房；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

卓越型血糖儀 德國Roche診斷有限公司；CP12 4S分析天平 德國Sartorius公司；高壓蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo公司；無菌超凈工作臺 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；Cary 300紫外-可見分光光度計美國Varian公司；pH計 德國Sartorius公司；Sorvall Evolotion RC型高速冷凍離心機 美國Thermo公司；ELx800型全自動酶標儀 美國BioTek公司；冷凍干燥機美國Labconco公司；動態(tài)多功能提取罐 上海銳元機械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株處理與培養(yǎng)基組成

植物乳桿菌Sc52分離自傳統(tǒng)發(fā)酵酸菜，植物乳桿菌Q3-4分離自自然發(fā)酵的辣醬，植物乳桿菌CH126分離自咸菜辣蘿卜，植物乳桿菌C88分離自內(nèi)蒙古發(fā)酵奶豆腐，上述菌株由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所實驗室分離鑒定，在含體積分數(shù)20%甘油的MRS（deMan Rogosa and Sharpe）液體培養(yǎng)基中于-80 ℃保存。使用前，菌株在MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)活化傳代培養(yǎng)3 代后，按3%量接種于MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，后置于4 ℃冰箱中備用。

MRS液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母浸粉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，無水乙酸鈉5.0 g，檸檬酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，加三級水至1 000 mL，醋酸調(diào)pH 6.6±0.2，115 ℃高壓滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。

1.3.2 植物乳桿菌Sc52體外益生特性

1.3.2.1 耐酸性實驗

菌株按體積分數(shù)3%的量接種于用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值分別為2.0、3.0、6.6的液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)1 h或3 h，適度倍比稀釋后涂布于MRS瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)，菌落數(shù)用lg（CFU/mL）表示，每個稀釋度做3 個平行。

1.3.2.2 耐膽鹽實驗

菌株按體積分數(shù)3%的量分別接種于含有0.3、0.5、1.0 g/100 mL牛膽鹽的液體MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)4 h，以不加膽鹽的MRS為對照。適度倍比稀釋后涂布于MRS瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)，菌落數(shù)用lg（CFU/mL）表示，每個稀釋度做3 個平行。

1.3.2.3 疏水性測定

采用細菌黏著物質(zhì)法（bacterial adhesion substance，BATS）測定植物乳桿菌Sc52疏水性[12]。取培養(yǎng)16 h的菌株離心（5 500 r/min、4 ℃離心5 min），菌體用生理鹽水重懸2 次，再次離心后用0.1 mol/L KNO3溶液重懸至菌數(shù)1×108CFU/mL，600 nm波長處測定吸光度A。取出3 mL0菌懸液分別與1 mL二甲苯、氯仿、乙酸乙酯混合，旋渦振蕩2 min后室溫放置30 min，混合液分為兩相，600 nm波長處測定水相的吸光度A1，實驗重復(fù)3 次，用公式（1）計算菌株的疏水率：

1.3.2.4 自凝聚能力測定

取培養(yǎng)16 h的菌液離心（5 500 r/min、4℃離心5 min），菌體用生理鹽水重懸2 次，離心后調(diào)整600 nm波長處吸光度A0為1.0，以生理鹽水為空白對照。菌液放置試管中靜置1、24、48 h，取1 mL上層菌液測定吸光度，每個菌株每個時間點做3 個平行。用公式（2）計算菌株的自凝聚率：

式中：A0為600 nm波長處測得吸光度；At為不同靜置時間點測得吸光度。

1.3.2.5 抗生素對菌株最低抑菌濃度測定

選取10 種抗生素根據(jù)不同溶劑進行倍比稀釋，終質(zhì)量濃度為1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL，用0.22 μm濾膜過濾除菌。將待測菌液用滅菌的MRS液體培養(yǎng)基稀釋1 000 倍，備用。在96 孔板中依次加入不同質(zhì)量濃度的抗生素和制備好的菌液各70 μL，陽性對照孔加入待測菌液及溶解抗生素所用溶劑，陰性對照孔加入MRS液體培養(yǎng)基。在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，觀察96孔板中菌株的生長情況，明顯無菌株生長的孔所對應(yīng)的抗生素濃度即是對菌株的最低抑菌濃度。

1.3.3 植物乳桿菌Sc52輔助降糖產(chǎn)品的制備

提取液的制備：將人參、山藥、枸杞子、辣木葉、桑葉按不同比例混合，加10 倍水熱回流提取2 次，每次1 h，過濾，濾液濃縮至1/2體積。

固體飲料的制備：提取液中加入低聚果糖10 g/L，葡萄糖20 g/L，調(diào)pH 6.0～6.6，115 ℃高壓滅菌20 min。將培養(yǎng)好的植物乳桿菌Sc52、C88、Q3-4、CH126分別按體積分數(shù)1%的接種量接入滅菌后的提取液中，37 ℃培養(yǎng)16 h后凍干。收獲的發(fā)酵液凍干粉進行復(fù)配，制成固體飲料，具體配方如下：20%發(fā)酵液凍干粉、30%塔格糖、20%燕麥-β-葡聚糖、10%低聚果糖、20%麥芽糊精。

1.3.4 2型糖尿病小鼠模型建立及分組

參考欒暢等[11]方法。SPF級健康雄性ICR小鼠50 只，4～5 周齡，質(zhì)量15～17 g?；A(chǔ)飼料含5%脂肪、53%碳水化合物、23%蛋白質(zhì)；高脂飼料含22%脂肪、48%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)。設(shè)定標準體質(zhì)量為60 kg的人每天服用5 g產(chǎn)品，按黃繼漢等[13]方法換算小鼠的灌胃給藥量。小鼠分組、飼喂及造模方法如表1所示。

表1 小鼠分組、飼喂及造模方法Table 1 Grouping and feeding of mice and diabetic model induction

1.3.5 口服葡萄糖耐量實驗

治療結(jié)束后，禁食不禁水12 h，灌胃葡萄糖溶液（每只按2 g/kg），分別于0、30、60、90、120 min后測定小鼠血糖值，并按照式（3）計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）[14]：

式中：G0～G120分別為0～120 min時小鼠的血糖值/（mmol/L）；30為測定間隔時間/min。

1.3.6 小鼠血清生理生化指標測定

治療結(jié)束后，各組小鼠經(jīng)眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，-80 ℃凍存，待用。按照試劑盒說明書檢測小鼠血清中TG、TC、LDL、TNF-α、INS、葡萄糖水平。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 耐受能力分析

表2 植物乳桿菌Sc52的耐酸性Table 2 Acid resistance of L. plantarum Sc52

如表2所示，pH 6.6的條件下菌株生長良好，隨著時間的延長活菌數(shù)呈上升趨勢。pH 2.0條件下菌株的存活率明顯低于pH 3.0，培養(yǎng)3 h未檢測到活菌，由此可知低pH值能夠明顯殺死菌株或抑制菌株生長，這與Maragkoudakis等[15]研究的內(nèi)容一致。pH 3.0的條件下，植物乳桿菌Sc52表現(xiàn)出了一定的耐酸性，培養(yǎng)3 h后，存活率仍在55%以上。有研究發(fā)現(xiàn)菌株的耐酸能力大小，與菌株的H+-ATP酶活性有關(guān)，由此推測，植物乳桿菌Sc52的耐酸性也可能與其H+-ATP酶活性有關(guān)[16]。

表3 植物乳桿菌Sc52的耐膽鹽性Table 3 Bile tolerance of L. plantarum Sc52

如表3所示，在0.3 g/100 mL和0.5 g/100 mL膽鹽質(zhì)量濃度下，其存活率分別為61%和54%，隨著膽鹽質(zhì)量濃度的增加，活菌數(shù)在不同程度的降低，但在1 g/100 mL膽鹽質(zhì)量濃度下培養(yǎng)4 h，其存活率仍有32%，表明植物乳桿菌Sc52有較強的膽鹽耐受能力。有報道稱，當乳酸菌受到高膽鹽刺激時，細胞膜外強度的增加、胞外多糖的保護等可能是益生菌耐膽鹽的機理[17-19]。

2.2 疏水性及自凝聚能力

圖1 植物乳桿菌Sc52的有機溶劑疏水性（A）及自凝聚性（B）Fig. 1 Hydrophobicity of L. plantarum Sc52 in organic solvent (A) and aggregation ability at different standing times (B)

圖1 A為Sc52菌株對二甲苯、氯仿和乙酸乙酯3 種有機溶劑疏水能力的結(jié)果，疏水率的評價標準如下[20]：疏水率大于50%為高疏水性，疏水率介于20%和50%為中度疏水，疏水率小于20%為非疏水。植物乳桿菌Sc52在二甲苯溶劑中表現(xiàn)出中度疏水能力，而在乙酸乙酯和氯仿中表現(xiàn)出非疏水能力。通常疏水性高的菌株對細胞有較強的黏附能力，但是在Schillinger等[21]的研究中，一株疏水性只有2%的乳桿菌對細胞的黏附率為40%，同樣條件下LGG的黏附率為25%。在考察自凝聚率方面，選擇了3 個不同時間點進行測定，隨著時間的延長，自凝聚率升高，在48h后，菌懸液上層呈澄清狀態(tài)，自凝聚率達到（89±0.3）%（圖1B）。自凝聚能力由菌株表面疏水性引起，同時與其黏附能力密切相關(guān)，高凝聚能力的菌株一般具有較高的黏附能力[22]。

2.3 抗生素對菌株的最低抑菌濃度

表4 不同抗生素對植物乳桿菌Sc52的最低抑菌濃度Table 4 Minimum inhibitory concentration (MIC) of different antibiotics against L. plantarum Sc52μg/mL

乳酸菌抗生素抗性是益生菌安全性評價中的一項重要環(huán)節(jié)[23]。如表4所示，植物乳桿菌Sc52對甲氧芐胺嘧啶、氯霉素、利福平、青霉素比較敏感，對鏈霉素和卡那霉素的最低抑菌濃度范圍較大，對萬古霉素表現(xiàn)出強耐藥性，最低抑菌濃度大于128 μg/mL。有研究顯示，多數(shù)乳酸菌對糖肽類抗生素萬古霉素會產(chǎn)生耐藥性[24]，這與本實驗結(jié)果相一致。

2.4 植物乳桿菌Sc52等多菌株發(fā)酵產(chǎn)品的降血糖作用

2.4.1 發(fā)酵產(chǎn)品對糖尿病小鼠一般狀態(tài)的影響

實驗通過高脂飲食聯(lián)合STZ誘導(dǎo)2型糖尿病模型，與空白組相比，模型組小鼠毛發(fā)粗糙發(fā)黃，精神萎靡，出現(xiàn)多飲、多食、多尿，體質(zhì)量減輕的“三多一少”癥狀，表明2型糖尿病造模成功。給予發(fā)酵產(chǎn)品治療4 周后，觀察小鼠的一般狀態(tài)，與模型組相比，給藥組小鼠毛發(fā)較之前潤澤，精神狀態(tài)良好，糖尿病癥狀減輕。

2.4.2 產(chǎn)品對2型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量的影響

圖2 發(fā)酵產(chǎn)品對2型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐量及AUC的影響Fig. 2 Effect of fermented product on oral glucose tolerance and area under the curve in type 2 diabetic mice

如圖2所示，各組小鼠在給予葡萄糖（2 g/kg）30 min后，血糖濃度均不同程度升高，達到峰值。但產(chǎn)品組的血糖值顯著低于模型組（P＜0.05），為模型組的78.2%，說明產(chǎn)品改善了糖尿病小鼠的血糖調(diào)控能力。隨著時間的延長，血糖濃度均呈下降趨勢，而模型組仍處在較高的水平上。120min后，空白組的血糖濃度基本回到灌胃前的水平，提示空白組小鼠口服葡萄糖耐量正常。然而模型組小鼠在120 min的血糖濃度高于0 min，說明模型組小鼠由于INS分泌不足基本喪失調(diào)節(jié)血糖的能力。經(jīng)過治療后的產(chǎn)品組在120 min的血糖濃度稍低于0 min時，與模型組相比有極顯著差異（P＜0.01），說明產(chǎn)品可以幫助機體有效改善血糖調(diào)控的能力，減緩餐后血糖升高。

2.4.3 發(fā)酵產(chǎn)品對2型糖尿病小鼠空腹血糖的影響

表5 發(fā)酵產(chǎn)品對2型糖尿病模型小鼠空腹血糖的影響Table 5 Effect of fermented product on fasting blood glucose in type 2 diabetes mellitus mice

如表5所示，第10周時，小鼠空腹血糖與空白組相比明顯升高，10 周以后模型組數(shù)據(jù)穩(wěn)定，與空白組相比有極顯著差異，提示造模成功。在治療期間，產(chǎn)品組小鼠空腹血糖呈下降趨勢，從第11周開始小鼠空腹血糖得到明顯抑制，到第14周時空腹血糖下降到11.00 mmol/L，與模型組相比有極顯著差異（P＜0.01）。結(jié)果表明發(fā)酵產(chǎn)品能明顯降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖值，對高血糖癥有治療作用。

2.4.4 發(fā)酵產(chǎn)品對2型糖尿病小鼠血清血脂水平、INS及TNF-α的影響

表6 發(fā)酵產(chǎn)品對2型糖尿病模型小鼠血脂、INS及TNF-α的影響Table 6 Effect of fermented product on serum lipids, insulin and tumor necrosis factor-α in type 2 diabetes mellitus mice

如表6所示，高脂飲食結(jié)合鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠建立2型糖尿病模型后，小鼠出現(xiàn)高血脂，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL水平明顯升高，TC、LDL水平與空白組相比差異極顯著（P＜0.01），小鼠血清INS水平顯著降低（P＜0.05），炎癥因子TNF-α含量極顯著升高（P＜0.01）。給予發(fā)酵產(chǎn)品治療4 周后，產(chǎn)品組小鼠血清中的TC、TG、LCL水平顯著降低（P＜0.01或P＜0.05），TC降低到6.77 mmol/L，TG降低到0.96 mmol/L，INS水平顯著升高（P＜0.05），升高到15.91 mU/L，TNF-α的水平顯著降低（P＜0.05），降低到87.39 ng/L。結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)品可以降低2型糖尿病小鼠血清中TC、TG、LDL水平，同時對2型糖尿病小鼠的低INS癥狀有明顯的改善，并能有效緩解機體的慢性炎癥。

3 討 論

益生菌進入人體消化道后，必須能夠耐受胃酸及高膽鹽的環(huán)境，以較高的活菌數(shù)到達腸道，并在腸道黏附和定植，才能發(fā)揮有效的益生作用，因此耐受性和黏附性等益生特性是篩選菌株的重要指標。前期已發(fā)表的研究結(jié)果表明，植物乳桿菌Sc52能夠調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，促進腸道益生菌生長，增加腸道短鏈脂肪酸含量，保護腸屏障，降低機體炎癥反應(yīng)等機制調(diào)節(jié)血糖，而這些功能作用的發(fā)揮與活菌能否有效到達腸道密切相關(guān)，因此本研究在前期實驗證明菌株具有輔助降糖作用的基礎(chǔ)上，分析了菌株耐酸、耐膽鹽、黏附等益生特性。結(jié)果表明植物乳桿菌Sc52在低pH值及高膽鹽環(huán)境中的存活率分別為55%及32%，表面疏水性和自凝聚率較高。與已報道的一些益生菌相比較，植物乳桿菌Sc52具有較強耐受和黏附等益生特性，例如，副干酪乳桿菌CD4和胃腸乳桿菌BTM7均能耐受pH 2.0及1%的膽鹽環(huán)境，存活率分別為53.2%和28.6%[25]；4 ℃條件下，干酪乳桿菌在pH 3.8的黃瓜汁中可以存活達2 個月以上，存活率在60%左右[26]；瑞士乳桿菌T159具有較高的自凝聚率及疏水性，并且與人腸癌細胞的黏附率達到50%以上[27]。綜上，植物乳桿菌Sc52是一株能耐受腸道環(huán)境，能在腸道黏附和定植的益生菌，有助于菌株通過調(diào)節(jié)腸道菌群、改善腸道功能發(fā)揮輔助降糖作用。

本研究在發(fā)酵產(chǎn)品配方上，選取具有降血脂功能菌株Q3-4、降血糖作用菌株CH126，抗氧化菌株C88[7]聯(lián)合植物乳桿菌Sc52作為混合發(fā)酵劑，發(fā)酵由人參、桑葉、辣木葉、枸杞子等藥食同源原料組成的降血糖復(fù)方提取物，獲得輔助降糖的固體飲料產(chǎn)品。產(chǎn)品經(jīng)動物體內(nèi)實驗證明具有較好的降糖降脂作用，并能促進胰島細胞分泌。有研究報道利用植物乳桿菌NUC-C1制備發(fā)酵紅參，發(fā)現(xiàn)在口服葡萄糖耐量實驗中，灌胃發(fā)酵紅參組血糖水平顯著降低，TC和TG水平降低，血清中INS水平升高[28]。2型糖尿病受試者服用發(fā)酵紅參粉4 周，有利于改善餐后血清血糖和INS水平[29]。益生菌與中藥聯(lián)合使用，通過發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化，能夠提質(zhì)增效，在預(yù)防和治療各類疾病方面起到積極的作用。研究表明乳酸菌發(fā)酵中藥后，產(chǎn)生的乳酸菌素、乳酸菌胞外多糖和有機酸，能轉(zhuǎn)化產(chǎn)生新的小分子生物活性成分，提高了發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性[30]，例如不同益生菌發(fā)酵當歸提取物的抗氧化活性及酪氨酸酶抑制活性顯著高于未發(fā)酵提取物[31]。山參經(jīng)長岐桿菌發(fā)酵后具有更強的抗氧化及抗炎活性[32]，黃芪經(jīng)發(fā)酵后還可以使黃芪甲苷含量明顯提高[33]。本研究的結(jié)果充分體現(xiàn)了益生菌發(fā)酵藥食同源原料協(xié)同增效和發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化的作用。但其作用機制還有待于深入研究。

綜上所述，本研究通過體外實驗分析，證明了輔助降糖植物乳桿菌Sc52是一株具有較好耐受性和黏附性的益生菌。將其與其他益生菌聯(lián)合發(fā)酵藥食同源原料，開發(fā)的固體飲料產(chǎn)品，具有明顯的降血糖作用，為益生菌發(fā)酵藥食同源原料開發(fā)健康食品提供了新的思路。

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