大豆生物解離過(guò)程中形成的乳狀液結(jié)構(gòu)特征

江連洲，王立敏，隋曉楠，畢 爽，丁 儉，張 亮，高 宇，扈瑩瑩，李 楊*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030）

生物解離乳狀液是生物解離提油過(guò)程中由于親水、親油的兩性物質(zhì)（磷脂、蛋白質(zhì)）存在而形成的一種復(fù)雜穩(wěn)定體系[1]，也是一種易受外界條件變化而影響其穩(wěn)定性的典型彈性體系[2]。生物解離是近幾年來(lái)新興的一種提油方法，該技術(shù)經(jīng)濟(jì)、安全、綠色環(huán)保，且由于該技術(shù)處理?xiàng)l件溫和，提取的油脂品質(zhì)較高、色澤較好[3]。但是，生物解離提油中乳狀液保留了部分油脂，限制了其油脂提取率，很大程度限制了該技術(shù)的工業(yè)化應(yīng)用。因此，探究限制乳狀液形成或者破除的方法，從而達(dá)到油脂最大提取率是普及該技術(shù)的重要途徑之一。但乳狀液的形成與其組成、界面性質(zhì)、各組分分子的空間構(gòu)象及組分間的分子交互作用等因素息息相關(guān)。僅研究乳狀液的破除技術(shù)并不足以從本質(zhì)上解決現(xiàn)存問(wèn)題。而現(xiàn)今文獻(xiàn)研究大多數(shù)集中對(duì)乳狀液的破除技術(shù)、組分分析及界面性質(zhì)，Chabrand等[4]研究了酶法破乳，獲得了95%的提油率且對(duì)乳狀液中界面蛋白進(jìn)行分析，得出界面蛋白濃度為（11.40±0.35）mg/m2。Lamsal等[5]對(duì)乳狀液進(jìn)行多方面研究，其中包括乳狀液的組分分析，發(fā)現(xiàn)乳狀液中含有約57%油脂、35%水分、5%蛋白質(zhì)、1.3%多糖和0.8%磷脂。de Moura等[6]分析了乳狀液中的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)界面蛋白的疏水性氨基酸殘基與乳狀液的穩(wěn)定性有密切關(guān)系；Chabrand等[7]發(fā)現(xiàn)在乳狀液的油-水界面上存在液晶相，使得乳狀液相當(dāng)穩(wěn)定；王瑛瑤等[8]研究了乳狀液中肽的分子質(zhì)量分布，發(fā)現(xiàn)界面吸附分子質(zhì)量大部分位于3～10 kDa，具有較強(qiáng)的乳化穩(wěn)定性。相關(guān)研究尚未涉及乳狀液結(jié)構(gòu)特征領(lǐng)域，但透徹解析乳狀液結(jié)構(gòu)特征是揭示乳狀液穩(wěn)定機(jī)制的重要途徑。

本研究對(duì)大豆不同酶解時(shí)間（1、2、3 h）生物解離乳狀液的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行解析，從流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布、油脂與蛋白空間分布進(jìn)行分析和表征；通過(guò)乳狀液與對(duì)應(yīng)酶解時(shí)間下大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）之間的對(duì)比，研究乳狀液中二硫鍵、發(fā)色氨基酸及油脂-蛋白之間的相互作用，明確不同酶解時(shí)間乳狀液熒光強(qiáng)度變化機(jī)制。通過(guò)對(duì)乳狀液結(jié)構(gòu)特征解析，以期為探究大豆生物解離乳狀液的穩(wěn)定性機(jī)制、尋求適當(dāng)?shù)钠迫榉椒ㄌ峁├碚撘罁?jù)與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆實(shí)驗(yàn)室自制；擠壓膨化大豆粉（蛋白40%、脂肪19.6%、纖維25.6%，以大豆粉質(zhì)量為基數(shù)計(jì)） 山東高唐藍(lán)山股份有限公司；Protex6L堿性蛋白酶（8 900 U/mL） 諾維信生物技術(shù)有限公司；正己烷 美國(guó)Sigma公司；鹽酸、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；水浴鍋英國(guó)IKA公司；BRAVO手持式拉曼光譜儀 德國(guó)布魯克儀器公司；AIR MP激光掃描共聚焦顯微鏡 日本島津公司；Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 生物解離乳狀液的制備

參考李楊等[9]的方法，稱取一定量的擠壓膨化大豆粉，加入2%（以大豆粉質(zhì)量為基數(shù)計(jì)）Protex6L酶制劑，按照料液比1∶6（m/V）加入水，用玻璃棒攪拌均勻，在55 ℃水浴鍋中保持恒溫，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH值保持在9.0，邊攪拌邊酶解，酶解1、2、3 h后，用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)水溶液的pH值至7.0，之后在100 ℃沸水中滅酶5 min。酶解結(jié)束后進(jìn)行離心操作（4 500 r/min、20 min），離心后除去殘?jiān)?，將游離油、乳狀液和水解液倒入分液漏斗中，分離得到乳狀液。

1.3.2 SPI及酶解物的制備

參考Wolf等[10]的方法。大豆磨粉后與正己烷以1∶6（m/V）的比例混合，在常溫下攪拌脫脂3 次，每次2 h。將脫脂豆粉按1∶10（m/V）的比例與水混合，然后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，45 ℃攪拌2 h后，將其懸浮液在4 ℃、10 000×g條件下離心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。靜置后在4 ℃、6 000×g條件下離心20 min，所得蛋白沉淀水洗2 次，最后用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)pH值至7.0。將此蛋白溶液冷凍干燥后研磨即得粉末狀SPI。將得到的SPI在與制備乳狀液相同的條件下酶解1、2、3 h得到酶解物。

1.3.3 拉曼光譜分析

實(shí)驗(yàn)所用的拉曼光譜儀為BRAVO手持式拉曼光譜儀。掃描波長(zhǎng)785 nm，功率為300 mW，掃描范圍400～2 000 cm-1，掃描時(shí)間每次60 s，積分10 次，4 次掃描進(jìn)行累加。以苯丙氨酸（（1 003±1）cm-1）作為歸一化因子，得到乳狀液、SPI及其酶解物的拉曼光譜圖。譜圖基線校正、譜峰歸屬查找采用ACD Labs V12軟件進(jìn)行。

1.3.4 激光掃描共聚焦顯微鏡

參考李國(guó)平等[11]的方法將新鮮制備的乳狀液樣品滴在顯微鏡的載玻片上，啟動(dòng)LSC軟件，選擇光路參數(shù)（Bean）：掃描模式為xyz；掃描形式為512×512或1 024×1 024；掃描速率為400 Hz；Bean Exp為6；Pinhole為1；掃描方向?yàn)閁ni。偽彩色均采用綠色，調(diào)整P-T、Zoom及Position大小，直至獲取高質(zhì)量的圖像。通過(guò)單次掃描和連續(xù)掃描方式進(jìn)行圖像采集。由于乳狀液中蛋白熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，因此無(wú)需染色，在對(duì)乳狀液分層掃描后得到的“光學(xué)切片”經(jīng)過(guò)三維重建后，得到不同酶解時(shí)間下乳狀液的空間分布。

1.3.5 流體動(dòng)力學(xué)半徑及其分布

參考Tang等[12]的測(cè)定方法。采用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)，利用Mastersize 2000激光粒度分析儀測(cè)定乳狀液的粒度分布，對(duì)新鮮的乳狀液樣品進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)置為：顆粒折射率1.520，顆粒吸收率0.001，以水為分散劑，折射率為1.330。實(shí)驗(yàn)采用D4,3，即體積平均直徑表征液滴粒度的大小，乳狀液樣品制備出后立即測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin8.0軟件作圖。采用SPSS V17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysis of variance，ANOVA）及相關(guān)性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶解時(shí)間對(duì)乳液流體動(dòng)力學(xué)半徑及分布的影響

圖1 不同酶解時(shí)間下乳狀液的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of emulsions at different hydrolysis times

圖2 不同酶解時(shí)間下乳狀液體積平均粒徑D4,3Fig.2 Average particle diameters (D4,3) of emulsions at different hydrolysis times

流體動(dòng)力學(xué)半徑分布是評(píng)價(jià)乳液穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[13]，同時(shí)可以直觀地展示乳液中油滴的分散狀態(tài)。本研究利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)探究不同酶解時(shí)間下乳液中油滴的分布情況及體積平均粒徑（D4,3）的大小。由圖1可以看出，本實(shí)驗(yàn)得出不同酶解時(shí)間下乳液粒徑分布相似，且與Wu等[1]的研究結(jié)果相似。由圖2可以看出，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，乳狀液D4,3越大，說(shuō)明酶解過(guò)程中乳狀液油滴不斷聚集，這是由于Protex蛋白酶改變了油滴表面的蛋白，油滴表面的靜電作用發(fā)生變化，同時(shí)酶解時(shí)間延長(zhǎng)增加了分子碰撞的機(jī)率，因此油滴分子趨于聚集[14]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解4 h和5 h時(shí)D4,3明顯增大，10～100 μm粒徑區(qū)間相對(duì)體積增大，而0.1～1 μm粒徑區(qū)間相對(duì)體積減小，這說(shuō)明這時(shí)乳狀液油滴開(kāi)始大量聚集，較不穩(wěn)定；Jung等[15]研究指出酶解3 h時(shí)酶解程度已經(jīng)達(dá)到最大、提油率最高，無(wú)需再繼續(xù)酶解，因此后續(xù)研究以酶解1、2、3 h的乳狀液為研究對(duì)象。

2.2 不同酶解時(shí)間對(duì)乳狀液三維空間結(jié)構(gòu)的影響

圖3 不同酶解時(shí)間下乳狀液中蛋白質(zhì)的空間分布Fig.3 Spatial distribution of proteins in emulsions at different hydrolysis times

激光掃描共聚焦顯微鏡，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行斷層掃描、成像、無(wú)損傷觀察，更清晰、直觀地觀察乳狀液中油脂與蛋白的空間分布[16]。圖3為不同酶解時(shí)間下乳狀液中蛋白質(zhì)的空間分布情況。根據(jù)乳狀液中油脂不發(fā)熒光，蛋白具有較強(qiáng)熒光的特點(diǎn)，可知綠色熒光即乳狀液中蛋白分布，黑色為油脂分布。通過(guò)觀察可知，酶解1 h時(shí)，乳狀液中蛋白相和油脂相分離，油滴分布密集，油滴小而多，油滴外面包裹一層蛋白膜起到穩(wěn)定作用，這與之前研究相符合[17]；酶解3 h得到的乳狀液蛋白與油脂相混亂，油滴分散、變大，呈現(xiàn)許多不規(guī)則的形狀。這是由于在酶解過(guò)程中，油滴界面吸附蛋白被酶解成小分子肽，從油滴表明脫落進(jìn)入游離相中，致使相鄰的小油滴發(fā)生聚集合并，呈現(xiàn)出不規(guī)則的狀態(tài)[18]。

此外，還可以看出熒光強(qiáng)度逐漸降低。熒光強(qiáng)度是表征蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，通過(guò)熒光強(qiáng)度的變化，可以得知蛋白質(zhì)的幾種重要的氨基酸殘基所處的微環(huán)境變化，它與蛋白質(zhì)疏水性基團(tuán)有關(guān)[19]。王瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白中產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基多分布于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，酶解處理可以使蛋白球形結(jié)構(gòu)變得松散伸展，深埋在球狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露增多，熒光強(qiáng)度增加。然而在本研究中，由圖3觀察可知，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，乳狀液熒光強(qiáng)度下降明顯。主要是由于酶解降低了乳液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度及分子質(zhì)量，導(dǎo)致乳狀液熒光強(qiáng)度下降；同時(shí)，Yang等[21]研究也指出，蛋白質(zhì)的熒光猝滅與分子內(nèi)芳香族氨基酸殘基、二硫鍵構(gòu)象及蛋白分子疏水相互作用密切相關(guān)。

2.3 不同酶解時(shí)間對(duì)乳狀液蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

拉曼光譜是研究分子相互作用的一種工具，因此常采用拉曼光譜法分析乳狀液蛋白氨基酸及二硫鍵構(gòu)象的變化。乳狀液及SPI拉曼光譜圖中對(duì)應(yīng)的譜峰及譜峰指認(rèn)見(jiàn)表1。

表1 乳狀液及SPI拉曼光譜的特征峰指認(rèn)Table1 Raman band assignment of SPI and emulsion

在拉曼光譜測(cè)定中，譜線強(qiáng)度與散射中心（化學(xué)鍵和基團(tuán)）數(shù)目為正比例關(guān)系[22]。因此，可以根據(jù)樣品的拉曼譜線強(qiáng)度來(lái)判斷乳狀液中某些化學(xué)鍵或基團(tuán)的改變程度，譜線強(qiáng)度變小意味著乳狀液中蛋白或油脂對(duì)應(yīng)的基團(tuán)或化學(xué)鍵受到損傷，譜線的偏移說(shuō)明它所對(duì)應(yīng)的化學(xué)鍵或基團(tuán)在不同的環(huán)境中發(fā)生了變化[19]。

2.3.1 二硫鍵分析

圖4 酶解時(shí)間對(duì)乳狀液結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析圖Fig.4 Raman spectroscopy analysis of emulsions at different hydrolysis times

由圖4可知，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)乳狀液中二硫鍵含量增多，酶解3 h得到的乳狀液中二硫鍵對(duì)應(yīng)的峰值最高。Howell等[23]發(fā)現(xiàn)乳液體系中油脂的存在可以使蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，推測(cè)酶解過(guò)程中由于油脂蛋白之間的相互作用導(dǎo)致二硫鍵含量增多，二硫鍵連接的聚集體增加，乳狀液中熒光減弱。

在拉曼光譜中，二硫鍵的特征譜帶為500～550 cm-1。在該區(qū)間中拉曼位移與振動(dòng)模式的對(duì)應(yīng)關(guān)系為：500～510 cm-1處為gauche-gauche-gauche（g-g-g）模式，515～525 cm-1處為gauche-gauche-trans（g-g-t）模式，535～545 cm-1處為trans-gauche-trans（t-g-t）模式。由圖5可知，SPI為t-g-t構(gòu)型，即分子間二硫鍵構(gòu)型；乳狀液為g-g-g構(gòu)型，即分子內(nèi)二硫鍵構(gòu)型[22]，說(shuō)明由于油脂-蛋白疏水相互作用改變了乳狀液中二硫鍵構(gòu)象。Yang等[21]研究蛋白質(zhì)的熒光猝滅與二硫鍵構(gòu)象及二硫鍵連接的聚集體有關(guān)。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)SPI及乳狀液結(jié)構(gòu)影響的拉曼光譜分析圖Fig.5 Raman spectroscopy analysis of emulsion and SPI hydrolysate

2.3.2 發(fā)色基團(tuán)的分析

表2 酪氨酸費(fèi)米共振線I850cm－1/I830 cm－1以及色氨酸I760cm－1/I1 003 cm－1Table2 Fermi resonance doublet ratio I850cm-1/I830 cm-1 for tyrosyl andfor tryptophan

表2 酪氨酸費(fèi)米共振線I850cm－1/I830 cm－1以及色氨酸I760cm－1/I1 003 cm－1Table2 Fermi resonance doublet ratio I850cm-1/I830 cm-1 for tyrosyl andfor tryptophan

注：同列肩標(biāo)字母不同表示不同酶解時(shí)間的I850cm-1/I830cm-1及酪氨酸殘基差異顯著（P＜0.05）。**.標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度為拉曼光譜各條帶強(qiáng)度與苯丙氨酸（1 003 cm-1）相對(duì)強(qiáng)度的比值。

?

酪氨酸的費(fèi)米共振會(huì)引起850 cm-1和830 cm-1附近的特征峰隨側(cè)鏈微環(huán)境改變，用這2 條譜線的強(qiáng)度比，可以推測(cè)蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基的暴露與埋藏。I850cm-1/I830cm-1的比值為1.25～1.40時(shí)，表明酪氨酸殘基完全暴露于分子表面（“暴露態(tài)”）；比值為0.3～0.5時(shí)，酪氨酸殘基完全埋藏于分子內(nèi)部（“包埋態(tài)”）[19]。由表2可知，酶解3 h后SPI相對(duì)于未酶解SPI的I850cm-1/I830cm-1比值增大，I850cm-1/I830cm-1＝1.21時(shí)，即酪氨酸完全暴露于分子表面。乳狀液中I850cm-1/I830cm-1隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)越來(lái)越小，酶解3 h時(shí)，乳狀液I850cm-1/I830cm-1＝0.46，酪氨酸由“暴露”變化為“包埋”態(tài)[24]。Herrero等[25]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遇到油脂時(shí)，其疏水基團(tuán)會(huì)傾向于油相內(nèi)，造成?；c蛋白質(zhì)側(cè)鏈之間的疏水基團(tuán)接觸，引起蛋白質(zhì)氨基酸無(wú)序排列，使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)。因此可以推斷乳狀液中由于油脂與蛋白的相互作用使蛋白部分發(fā)生交聯(lián)聚集，導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)被包埋在分子內(nèi)部；另外，乳狀液中蛋白與油脂疏水相互作用也會(huì)屏蔽分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，產(chǎn)生空間位阻，使發(fā)色團(tuán)被掩蓋，導(dǎo)致蛋白熒光減弱[26]?；蛟S乳狀液中小分子的作用也使蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，這一假設(shè)需要以后進(jìn)一步研究。

756 cm-1附近的拉曼譜帶歸屬為色氨酸側(cè)鏈，發(fā)色氨基酸中，色氨酸發(fā)色能力最強(qiáng)，已有研究表明，756 cm-1附近的色氨酸拉曼歸屬譜帶強(qiáng)度越低，蛋白質(zhì)的色氨酸趨于“暴露”態(tài)，反之則趨于“包埋”態(tài)[27]。由圖5可知，酶解后的SPI色氨酸峰值與原SPI相比顯著降低，這與上述酪氨酸變化機(jī)制相似。但是在乳狀液中，色氨酸對(duì)應(yīng)的峰值不太明顯，這可能是因?yàn)槿闋钜褐杏椭c蛋白質(zhì)的相互作用或蛋白質(zhì)周圍小分子的影響改變了蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露[23]。

3 結(jié) 論

本研究首先利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、激光掃描共聚焦顯微鏡得到了不同酶解時(shí)間（1、2、3 h）下乳狀液的粒徑分布及蛋白質(zhì)與油脂的空間分布，又通過(guò)SPI與乳狀液對(duì)比，從分子間相互作用出發(fā)，利用拉曼光譜分析了乳狀液中熒光強(qiáng)度變?nèi)鯔C(jī)理，主要結(jié)論如下：

共聚焦顯微鏡及粒徑分布結(jié)果顯示：酶解時(shí)間延長(zhǎng)，乳狀液粒徑變大，油滴數(shù)量減少，并呈現(xiàn)出不規(guī)則的形狀，由于在酶解過(guò)程中，乳狀液中蛋白質(zhì)被酶解成小分子肽，從油滴表面脫落，進(jìn)入游離相中，致使相鄰的小油滴發(fā)生聚集合并。同時(shí)，在乳狀液空間結(jié)構(gòu)中熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)明顯的減弱趨勢(shì)。

拉曼光譜分析乳狀液中熒光強(qiáng)度減弱機(jī)理結(jié)果顯示：與酶解后的SPI相比，乳狀液中二硫鍵發(fā)生了偏移，且隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，乳狀液中二硫鍵含量增多，表明乳狀液中油脂與蛋白質(zhì)之間的相互作用改變了二硫鍵構(gòu)象，同時(shí)導(dǎo)致二硫鍵連接的聚集體含量增加；酶解SPI時(shí)，I850cm-1/I830cm-1＞1.2，酪氨酸完全暴露，但在乳狀液中I850cm-1/I830cm-1＜0.5，酪氨酸由“暴露”變化為“包埋”態(tài)，且隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，I850cm-1/I830cm-1越來(lái)越小，推測(cè)乳狀液中由于油脂與蛋白質(zhì)的相互作用使蛋白質(zhì)部分交聯(lián)聚集，導(dǎo)致發(fā)色基團(tuán)被包埋在分子內(nèi)部；另外，乳狀液中蛋白質(zhì)與油脂疏水相互作用屏蔽分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)，產(chǎn)生空間位阻，使發(fā)色團(tuán)被掩蓋，導(dǎo)致蛋白熒光減弱；酶解SPI時(shí)，色氨酸被暴露，但在乳狀液中沒(méi)有出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的峰，推測(cè)乳狀液中油脂與蛋白質(zhì)的相互作用或蛋白周圍小分子的影響改變蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露的變化。或許乳液中小分子的作用也使乳液中蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這一假設(shè)需要以后進(jìn)一步研究。

上述結(jié)論對(duì)于系統(tǒng)地探討乳狀液復(fù)雜體系內(nèi)分子間作用力、分子組成和空間構(gòu)象提供了一定理論支持，同時(shí)，也為開(kāi)發(fā)新型高效破乳技術(shù)提供理論參考。

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