微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)便秘、腹瀉人群腸道菌群結(jié)構(gòu)與產(chǎn)短鏈脂肪酸關(guān)鍵菌屬的相關(guān)性

臧凱麗，江 巖，孫 勇*，陳慶森，趙林森，趙 培,*，崔文靜，馬新穎，閆亞麗

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.中國(guó)肉類食品綜合研究中心，北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；3.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800）

腸道菌群的基因組信息被稱為人類的“第二基因組”，編碼了330萬(wàn) 個(gè)非冗余的基因，大約是人類基因編碼能力的150 倍[1]，擁有豐富的遺傳信息，參與人體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，調(diào)控多種代謝途徑和機(jī)體的免疫系統(tǒng)，故與機(jī)體健康息息相關(guān)。近些年來(lái)研究顯示，宿主和微生物基因組共同調(diào)節(jié)并通過(guò)產(chǎn)生短鏈脂肪酸（shortchain fatty acids，SCFAs）、膽汁酸、膽堿以及吲哚等代謝物質(zhì)維持機(jī)體健康[2]，其中乙酸、丙酸、丁酸相對(duì)含量較高，約占SCFAs總量的90%以上[3]，對(duì)人體結(jié)直腸的健康有重要作用[4-6]：丁酸或產(chǎn)丁酸鹽的腸道細(xì)菌具有恢復(fù)宿主免疫功能，保護(hù)屏障完整性和調(diào)節(jié)能量代謝等作用，丁酸鹽會(huì)影響中性粒細(xì)胞的功能和轉(zhuǎn)移，抑制血管細(xì)胞的炎性細(xì)胞因子，增加結(jié)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)，并通過(guò)人體免疫細(xì)胞減少細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)，其他SCFAs如丙酸和乙酸通過(guò)血液作用于各種不同的器官，被用作底物的氧化、脂質(zhì)合成和肝細(xì)胞代謝的能量；此外，SCFAs還具有調(diào)節(jié)組蛋白去乙酰酶抑制劑的功能，刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)從而影響嚙齒動(dòng)物的社會(huì)行為，SCFAs也能刺激腸道蠕動(dòng)和運(yùn)輸，并增加生理誘導(dǎo)濃度，在體外模擬結(jié)腸黏膜系統(tǒng)中5-羥色胺的釋放增加8～10 倍。目前，慢性便秘、腹瀉等胃腸道功能性疾病影響著全球2%～34%的社會(huì)人群，我國(guó)便秘的患病率已高達(dá)15.2%[7-8]。研究表明，飲食結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)的攝入是塑造腸道菌群結(jié)構(gòu)的最主要因素，一方面其會(huì)改變腸道菌群的結(jié)構(gòu)；另一方面食品中難以被人體吸收的成分則通過(guò)腸道菌群的作用發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用[9]。到目前為止，越來(lái)越多的研究表明，微生態(tài)制劑對(duì)人體益生功效已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，這不僅體現(xiàn)在其可與病原體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)和底物，維系宿主腸道微生物區(qū)系的平衡來(lái)促進(jìn)機(jī)體腸道健康；還能夠影響腸道內(nèi)微生物和宿主代謝產(chǎn)物的分泌，例如代謝酶類、細(xì)胞因子和SCFAs，從而降低腸道內(nèi)環(huán)境、提供能量、減少細(xì)菌易位和減輕內(nèi)毒素血癥等[10-12]。楊遠(yuǎn)志等[13]研究表明，飼喂抗性淀粉和乳酸菌的混合制品在降低結(jié)腸腫瘤方面的效果要優(yōu)于單獨(dú)使用益生素的效果。郭壯[14]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantity polymerase chain reaction，qPCR）技術(shù)和測(cè)序技術(shù)綜合分析評(píng)價(jià)乳酸菌在受試人群腸道的存活定植以及該菌株對(duì)受試人群腸道菌群多樣性的影響，發(fā)現(xiàn)服用微生態(tài)制劑能夠有效改善人體腸道菌群的組成，促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)，抑制致病菌及條件致病菌的繁殖；同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)受試人群停止服用微生態(tài)制劑后，其腸道菌群又恢復(fù)到服用前的結(jié)構(gòu)[15]。本實(shí)驗(yàn)室自2013年以來(lái)，已利用Ion torrent PGM測(cè)序平臺(tái)分別開(kāi)展了益生菌和益生元對(duì)小鼠菌群結(jié)構(gòu)以及代謝產(chǎn)物的相關(guān)課題，分析了瑞士乳桿菌Lactobacillus helveticus干預(yù)對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響[16]，探討了魔芋葡甘露聚糖對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用[17]。盡管微生態(tài)制劑表現(xiàn)出更好地維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和增強(qiáng)機(jī)體健康的功效，但促進(jìn)腸道關(guān)鍵菌群或菌種的研究工作還需進(jìn)一步深入探究，以便更好地服務(wù)于人類健康。

基于微生態(tài)制劑具有通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)來(lái)維持機(jī)體與腸道菌群動(dòng)態(tài)平衡的作用，加之一些學(xué)者開(kāi)展了水蘇糖（stachyose tetrahydrate，Sta）、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、兩歧雙歧桿菌功效的研究[18-21]；因此，本研究以便秘和腹瀉人群為對(duì)象，在不同微生態(tài)制劑的干預(yù)下，通過(guò)對(duì)受試者糞便DNA提取，利用Ion torrent PGM測(cè)序平臺(tái)探究受試者腸道菌群結(jié)構(gòu)信息的變化，同時(shí)利用氣相色譜檢測(cè)糞便中的SCFAs表達(dá)水平，解析微生態(tài)制劑干預(yù)前后腸道菌群多樣性的變化及其與SCFAs代謝相關(guān)的關(guān)鍵菌屬的相關(guān)性，比較Sta、益生菌純粉（probiotics power，PP）以及益生菌劑（probotic preparations，PPrs）在調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝SCFAs產(chǎn)物方面的能力，研究結(jié)果將為鑒定并闡述微生態(tài)制劑解決便秘和腹瀉相關(guān)的腸道關(guān)鍵菌屬的關(guān)系提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為通過(guò)微生態(tài)制劑以腸道菌群為靶點(diǎn)來(lái)調(diào)整、治療便秘和腹瀉提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料、菌株與試劑

Sta（含85%水蘇糖、麥芽糊精約10%～15%）、PP（含植物乳桿菌LP45（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌La28（Lactobacillus acidophilus）、麥芽糊精，LP45與La28活菌數(shù)比例為3∶1，活菌數(shù)3×1010CFU/g）、PPrs（含抗性糊精、菊粉、水蘇糖、麥芽糊精、植物乳桿菌LP45（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌La28（Lactobacillus acidophilus）、干酪乳桿菌YMC1069（Lactobacillus casei）、兩歧雙歧桿菌TMC3115（Bifidobacterium bifidum），活菌數(shù)2×1010CFU/g）河北一然生物科技有限公司。

Ion Xpress? Barcode Adapters Kit、Ion PGM?Template OT2 200 Kit、Ion PGM? Sequencing 200 Kit v2、Ion Plus Fragment Library Kit、Ion Library TaqMan?Quantitation Kit、Pfu DNA聚合酶 美國(guó)Life-Thermo Scientific公司；Qubit?dsDNA HS Assay Kit 美國(guó)Invitrogen公司；High Sensitivity DNA Kit 美國(guó)Agilent公司；QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 德國(guó)QIAGEN公司；MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit 寶生物工程（大連）有限公司；SCFAs（乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸（均為色譜純）） 天津光復(fù)研究所；其他試劑均為化學(xué)純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K18高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；DYY-2C電泳儀 北京六一儀器廠；508-U001 Ion torrent測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Invitrogen公司；1005527 Ion One TouchTM2INS模板制備系統(tǒng)、8441-21 Ion One Touch? ES模板富集系統(tǒng)、900 SERIES超低溫冰箱、磁力架、2.0 Qubit熒光定量?jī)x 美國(guó)Life-Thermo Scientific公司；2 1 0 0 生化分析儀、7 8 9 0 A氣相色譜儀 美國(guó)Agilent公司；N8050200 GeneAmp PCR系統(tǒng)7900 美國(guó)ABI公司；II-3 Biowave DNA紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)英國(guó)柏諾公司。

1.3 方法

1.3.1 受試人群的分組及樣本采集

研究中所有樣本均采集自河北省石家莊市正定縣，受試人群年齡為18～35 歲；便秘、腹瀉受試人群的臨床癥狀確定：通過(guò)詢問(wèn)受試者和其自身表述，按照臨床醫(yī)學(xué)給定的便秘、腹瀉等癥狀確定。要求受試人群在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)星期內(nèi)未發(fā)生任何疾病，實(shí)驗(yàn)期間無(wú)使用抗生素等藥物或接受治療的情況；3 個(gè)月內(nèi)未參與其他實(shí)驗(yàn)研究。

在2014年8～11月期間，共38 名受試人員，其中男性13 名，女性25 名。受試人群保持飲食及睡眠正常且無(wú)限制，每日早晚各服用微生態(tài)制劑一次，2 g/次（活菌數(shù)約3×1010CFU/g）；干預(yù)期間記錄飲酒、服藥等特殊情況。在服用微生態(tài)菌劑之前統(tǒng)一采集糞便一次，干預(yù)中受試人群糞便樣本每周采集2次，共采集4 周，在停止服用制劑后，采集志愿人員糞便樣本2 次。除去3 個(gè)異常人員外，對(duì)其余受試人員進(jìn)行樣本采集，并將樣本統(tǒng)一放置于液氮罐中保存，共采集糞便樣本280 個(gè)。用QIAamp DNA Stool Mini Kit提取35 個(gè)人的約220 個(gè)樣糞便細(xì)菌基因組DNA。用1%瓊脂糖膠檢測(cè)后，又根據(jù)細(xì)菌基因組完整性以及濃度等判斷，約有180 個(gè)樣本符合要求，保存?zhèn)溆?。最后選擇不同生理狀態(tài)：健康（1男2女）、便秘（3女）、腹瀉（2男4女）以及服用不同微生態(tài)制劑：對(duì)照組（Ctro，1男2女共3 人均為健康者）、水蘇糖組（Sta，1男2女共3 人均為腹瀉者）、益生菌純粉組（PP，2女為便秘者，1女為腹瀉者，共3 人）、益生菌劑組（PPrs，1男1女為腹瀉者，1女為便秘者，共3 人）的12 個(gè)人共104 個(gè)樣本進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.2 糞便中微生物總DNA的提取

迅速稱量從-20 ℃冰箱取出的糞便樣本0.2 g，利用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit提取糞便中微生物的總DNA，提取方法在試劑說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上做了改良。用Biowave紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行核酸質(zhì)量檢測(cè)，在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量。

1.3.3 腸道菌群16S rRNA V3區(qū)的PCR擴(kuò)增

利用細(xì)菌通用引物擴(kuò)增16S rRNA V3區(qū)片段，上游引物F：5’-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3’和下游引物R：5’-TTA CCG CGG CTG CTG GCA C-3’。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：5 μL 10×buffer（含20 mmol/L MgSO4）、1 μL 10 mmol/L的dNTP（dNTP終濃度為0.2 mmol/L），上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，10～25 ng腸道細(xì)菌基因組DNA，最后加入0.2 μL Pfu DNA聚合酶（2.5 U/μL），加無(wú)菌水至50 μL。為避免非特異性擴(kuò)增采用降落PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 3 min，95 ℃ 1 min，70 ℃ 30 s，開(kāi)始每個(gè)循環(huán)降0.5 ℃，72 ℃ 1 min，共15 個(gè)循環(huán)；95 ℃ 1 min，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共10 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit回收純化，純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物用Qubit?dsDNA HS Assay Kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的定量分析。

1.3.4 Ion torrent PGM測(cè)序

首先，用Ion Plus Fragment Library Kit和Ion Xpress?Barcode Adapters Kit進(jìn)行測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。然后，進(jìn)行測(cè)序模板的制備，Ion One Touch? ES模板富集系統(tǒng)自動(dòng)對(duì)攜帶有測(cè)序模板的Ion Sphere? Particles進(jìn)行富集。最后，在Ion torrent PGM測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.5 測(cè)序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

首先，用FastQC軟件將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，并利用NGStool kits過(guò)濾掉低質(zhì)量序列。將質(zhì)控得到的高質(zhì)量序列根據(jù)樣本Barcode和引物進(jìn)行數(shù)據(jù)的正、反方向分選，進(jìn)入微生物生態(tài)學(xué)定量研究（quantitative insights into microbial ecology，QIIME）[22]后再次質(zhì)控并去除嵌合體，利用usearch方法在97%的相似水平下劃分分類操作單元（operational taxonomic units，OTUs）；選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列為代表序列，再參照樣本的信息，生成以序列數(shù)代表的每個(gè)樣本中每個(gè)OTU豐度的OTU Table。然后，依據(jù)OTU Table數(shù)據(jù)進(jìn)行每個(gè)文庫(kù)多樣性分析，并利用R（版本3.1.3）軟件繪制觀測(cè)物種指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Ace指數(shù)以及反映樣本文庫(kù)庫(kù)容的Good’s coverage指數(shù)等。同樣，以O(shè)TU Table為基礎(chǔ)進(jìn)行物種分類地位的確定，生成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，樣本中各水平相對(duì)豐度劃分并生成堆積圖。最后，為了減少因某些樣本中含有豐度極高的OTU而造成的樣本間距離分布異常和測(cè)序時(shí)帶來(lái)的偏差，研究中對(duì)所有樣本中的OTUs豐度進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)即樣本中各進(jìn)化水平相對(duì)豐度百分比用R（版本3.1.3）繪制后續(xù)的豐度分布熱圖、堆積圖并進(jìn)行加權(quán)和非加權(quán)UniFrac距離矩陣的PCoA分析。

1.3.6 氣相色譜分析糞便SCFAs

取糞樣均質(zhì)液2 mL，在12 000 r/min離心2 min后，取上清液1 mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%硫酸溶液200 μL振蕩混勻15 s；再加入乙醚1 mL，再次渦旋振蕩15 s，靜置2 min進(jìn)行萃??；室溫下12 000×g離心5 min，轉(zhuǎn)移上層有機(jī)相過(guò)濾膜，至一次性樣品瓶中進(jìn)行氣相色譜分析。研究利用6890N氣相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)，配備極性的HP-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）以及氫火焰離子化檢測(cè)器（f l ame ionization ditector，F(xiàn)ID）檢測(cè)器。檢測(cè)的SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸共6 種。升溫程序：初始柱溫為140 ℃，持續(xù)10 min，以5 ℃/min的速率升溫至165 ℃，再以25 ℃/min升至270 ℃，持續(xù)2 min。檢測(cè)器溫度為280 ℃，進(jìn)樣口溫度為250 ℃。SCFAs保留出峰先后順序?yàn)椋阂宜帷⒈?、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群16S rRNA V3區(qū)測(cè)序文庫(kù)的檢測(cè)

圖1 腸道菌群16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR fi ngerprints of the V3 region of the 16S rRNA of gut bacteria

圖1為腸道菌群16S rRNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)后加上接頭和Barcode的3%瓊脂糖凝膠電泳圖。最終獲得的V3區(qū)測(cè)序文庫(kù)大小集中在260 bp左右，完全符合細(xì)菌16S rRNA基因V3區(qū)平均長(zhǎng)度為180 bp的要求，即測(cè)序長(zhǎng)度可以覆蓋V3區(qū)全長(zhǎng)。

2.2 服用微生態(tài)制劑后腸道微生物α多樣性的分析

2.2.1 多樣性指數(shù)分析

圖2 樣本測(cè)序分析Fig.2 Sequencing analysis of all samples

從圖2中反映樣本物種測(cè)序深度的觀測(cè)物種指數(shù)、反映微生物多樣性和均勻度的Shannon多樣性指數(shù)以及反映測(cè)序覆蓋率的Good’s coverage指數(shù)可以看出，各組樣本的OTU數(shù)目隨著測(cè)序深度的增加基本達(dá)到飽和，具有很高的測(cè)序覆蓋率，說(shuō)明當(dāng)前測(cè)序深度足以發(fā)現(xiàn)各樣本生境中的大部分物種，這與2.1節(jié)的結(jié)果一致。

2.2.2 微生態(tài)制劑干預(yù)下的腸道菌群多樣性的變化

為研究微生態(tài)制劑對(duì)受試人群腸道微生物多樣性的影響，從各樣本腸道菌群的豐富度和均勻度的層面研究腸道微生物的多樣性。首先通過(guò)反映樣本物種豐富度的Ace指數(shù)來(lái)研究幾組受試人群之間菌群多樣性的差異，其次通過(guò)反映微生物多樣性和均勻度的Shannon多樣性指數(shù)來(lái)研究幾組樣本的多樣性和均勻度的差異，發(fā)現(xiàn)微生態(tài)制劑對(duì)腸道微生物α多樣性造成了一定程度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微生態(tài)制劑對(duì)腸道微生物α多樣性指數(shù)的影響Fig.3 Effect of microecologics on α diversity index of gut microbiota

圖3a表示服用不同微生態(tài)制劑后志愿受試人群腸道菌群的Ace指數(shù)的變化，Ace指數(shù)反映了各組受試人群腸道菌群的物種豐富度，從中可看出3 種微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群的影響具有一定差異，其中，Sta和PP組受試人群腸道菌群豐度遠(yuǎn)不及PPrs組，說(shuō)明PPrs對(duì)腸道菌群的多樣性調(diào)節(jié)作用更明顯。圖3b結(jié)果表明PPrs組受試人群服用第1周后，腸道菌群的生物群落結(jié)構(gòu)多樣性明顯好轉(zhuǎn)，隨著服用時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸與Ctro組接近，而且在停止服用后，腸道生物群落結(jié)構(gòu)多樣性也沒(méi)有大幅度降低，說(shuō)明PPrs對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)具有良好的作用。與PPrs不同的是，服用PP的受試人群的腸道菌群的生物群落結(jié)構(gòu)多樣性在第1周沒(méi)有明顯好轉(zhuǎn)，隨著服用時(shí)間的延長(zhǎng)，向Ctro組接近，并且停止服用后，腸道菌群的生物群落結(jié)構(gòu)多樣性恢復(fù)了原有狀態(tài)。而Sta組受試人群腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)多樣性明顯低于其他組，但在服用Sta期間，腸道菌群的生物群落結(jié)構(gòu)多樣性有升高的趨勢(shì)，而且在停止服用Sta后，腸道菌群的生物群落結(jié)構(gòu)多樣性較服用前有所升高，說(shuō)明Sta也具有調(diào)整腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用?？傮w而言，PPrs的干預(yù)效果較其他兩種制劑好，這也與圖3a結(jié)果一致。

2.3 微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的影響

2.3.1 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)各變量之間的進(jìn)化距離和豐度信息，基于加權(quán)UniFrac選取不同微生態(tài)制劑干預(yù)下的各組受試人群腸道菌群在屬水平上的相對(duì)豐度的差異做PCoA分析，并根據(jù)分組的信息得到圖4。

圖4 基于加權(quán)UniFrac PcoA分析Fig.4 UniFrac weighted PcoA analysis

圖4a中根據(jù)服用不同微生態(tài)制劑的關(guān)系進(jìn)行連接，發(fā)現(xiàn)服用微生態(tài)制劑組樣本與Ctro組有交疊的趨勢(shì)，各組樣本并不能完全分開(kāi)，說(shuō)明相比較其他因素，微生態(tài)制劑對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)作用更為明顯。在圖4b中，根據(jù)樣本中相對(duì)豐度的距離自然聚類為兩簇，沿第一主成分也是貢獻(xiàn)率最大的主成分（64.68%）完全分離，根據(jù)數(shù)據(jù)提示這與Prevotella和Bacteroides的相對(duì)豐度相關(guān)。此外，從圖4a中可看出，PP組樣本在X軸上距離較大，說(shuō)明在PP干預(yù)下腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性變化較大；PPrs組人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)逐漸向Ctro組靠近，提示PPrs具有更強(qiáng)的改變腸道菌群失調(diào)的能力。

2.3.2 腸道菌群中不同分類水平相對(duì)豐度的分析

在QIIME中，通過(guò)Usearch在97%相似水平劃分得到1 619 個(gè)OTUs，所有OTUs被劃分進(jìn)化水平，結(jié)果如圖5所示。

圖5 益生菌制劑對(duì)人群腸道菌群門水平上相對(duì)豐度的影響Fig.5 Effect of microecologics on relative abundance of dominant intestinal bacterial phyla in human

在門的水平上，主要有放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）及藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria），其中絕大多數(shù)序列屬于Bacteroidetes和Firmicutes，約占總序列數(shù)的94.37%。Sta組的腸道菌群結(jié)構(gòu)中Firmicutes相對(duì)豐度有一定的增長(zhǎng)，由14.08%升至22.4%，而B(niǎo)acteroidetes和Proteobacteria相對(duì)豐度下降明顯。PP組便秘人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)中Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯增加，而Firmicute、Proteobacterias和Actinobacteria都相應(yīng)減少；而腹瀉人群的Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯減少，只有Firmicutes明顯增加。PPrs組腹瀉人群在干預(yù)期間腸道菌群結(jié)構(gòu)中除Firmicutes有較明顯的減少外，Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacterias都相應(yīng)有所增長(zhǎng)；而便秘組除Bacteroidetes外，Actinobacteria、Proteobacterias和Firmicutes都有明顯有增長(zhǎng)。

另外，通過(guò)Usearch在97%相似水平劃分得到OTUs被劃為科和屬的水平共114 個(gè)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 微生態(tài)制劑對(duì)人群腸道菌群科和屬水平上相對(duì)豐度的影響Fig.6 Effect of microecologics on relative abundance of intestinal bacterial genera

從整體結(jié)構(gòu)中可以看出不同受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)中科和屬水平的差異較明顯，服用微生態(tài)制劑后，屬的相對(duì)豐度明顯增加。健康受試人群的腸道菌群以Bacteroidales為核心菌屬，而便秘和腹瀉受試人群則以Bacteroidales、Prevotellaceae和Ruminococcaceae為主。就腹瀉受試人群的腸道菌群而言，服用Sta和PPrs后，Bacteroidales和Prevotellaceae占相當(dāng)大的比例，而服用PP后的Bacteroidales所占比重較大。便秘受試人群的腸道中以Prevotellaceae和Ruminococcaceae為主，服用PP后Bacteroidales的相對(duì)豐度降低，而服用PPrs的受試人群腸道菌群中這3 種菌屬似乎處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，這需要進(jìn)一步去挖掘；此外，Bifidobacterium、Lactobacillus、Parabacteroides這些常見(jiàn)的外源性益生菌均在受試者腸道菌群有增長(zhǎng)跡象。

圖7 腸道菌群豐度分布熱圖Fig.7 Heat map of relative abundance of gut microbiota

為了更好地體現(xiàn)微生態(tài)制劑作用下的腸道菌群相對(duì)豐度的分布，在屬水平做了菌屬豐度的分布熱圖，并進(jìn)行了聚類，結(jié)果如圖7所示。對(duì)比Sta組、PP組和PPrs組受試人群的腸道菌群，腸道中與產(chǎn)SCFAs相關(guān)的菌屬都屬于相對(duì)豐度較高的菌屬，多屬于Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Lactobacillaceae、Clostridiaceae、Bacteroidetes、Prevotellaceae、Enterobacteriaceae、Desulfovibrionaceae和Rikenellaceae。此外，PPrs中的Bif i dobacteriaceae、Lactobacillus和Parabacteroides有益菌雖然占有的豐度不高，但是在服用微生態(tài)制劑后明顯有增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這與2.3.1節(jié)得出的結(jié)果一致。在受試人群的腸道菌群中Citrobacter等可能性致病菌被檢測(cè)出，隨著服用微生態(tài)制劑時(shí)間的延長(zhǎng)，其相對(duì)豐度降低。為進(jìn)一步得到更多的信息，還需從中選擇差異顯著的菌群進(jìn)行具體分析。

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)中差異顯著的關(guān)鍵菌屬鑒定

2.4.1 腸型分析

Wu等[23]按照腸道菌群的種類和豐度對(duì)樣本進(jìn)行腸型的歸類，Prevotella和Bacteroides在健康成年人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位，與其他細(xì)菌一同為人體提供營(yíng)養(yǎng)并維持腸道的正常生理，參與體內(nèi)的拮抗反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)菌毒素的產(chǎn)生，增強(qiáng)宿主固有的免疫反應(yīng)。

結(jié)合腸型分析（圖8）：在干預(yù)前，健康人群腸道菌群內(nèi)的Bacteroides相對(duì)豐度較高且穩(wěn)定，便秘和腹瀉人群腸道菌群中Bacteroides的相對(duì)豐度比Prevotella高。經(jīng)過(guò)服用微生態(tài)制劑后，Sta組和PPrs組腹瀉人群中的Bacteroides隨時(shí)間呈下降趨勢(shì)，相對(duì)豐度由高于50%降到低于20%，相應(yīng)的Prevotella隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，腸型由Bacteroides型轉(zhuǎn)換到Prevotella型；而便秘人群的Prevotella和Bacteroides的相對(duì)豐度會(huì)隨著服用微生態(tài)制劑有所改變，變化比例沒(méi)有使腸型改變。

圖8 微生態(tài)制劑對(duì)腸道中Bacteroides（a）和Prevotella （b）相對(duì)豐度的影響Fig.8 Effect of probiotics on relative abundance of Bacteroides (a) and Prevotella (b) in the intestine

2.4.2 關(guān)鍵菌屬鑒定

根據(jù)腸道微生物整體結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，微生態(tài)制劑干預(yù)前后的腸道微生物具有一定程度的差異，進(jìn)一步在屬水平數(shù)據(jù)上進(jìn)行t檢驗(yàn)顯著性差異，發(fā)現(xiàn)服用Sta組受試人群的腸道結(jié)構(gòu)有30 個(gè)屬顯著變化，PP組受試人群的腸道結(jié)構(gòu)有41 個(gè)屬顯著變化，PPrs組受試人群的腸道結(jié)構(gòu)約有68 個(gè)屬顯著變化，又通過(guò)線性判別分析的LEfSe差異分析算法實(shí)現(xiàn)降維評(píng)估差異物種的影響，結(jié)果如圖9所示。總體而言，PPrs對(duì)腸道結(jié)構(gòu)影響較明顯。Sta組、PP組和PPrs組3 組受試人群的腸道菌群與產(chǎn)SCFAs相關(guān)的科、屬都有明顯增長(zhǎng)，相較其他兩種制劑，PP組受試人群產(chǎn)SCFAs相關(guān)菌屬的相對(duì)豐度增長(zhǎng)明顯，尤其是Lachnospiraceae中的Blautia、Lachnospira以及Ruminococcaceae中的Faecalibacterium、Oscillospir等，其中Blautia和Faecalibacterium與SCFAs含量呈顯著正相關(guān)。

此外，我們應(yīng)用環(huán)境因素對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行約束，采用冗余分析（redundancy analysis，RDA）的方法，以健康、便秘與腹瀉分組作為起約束作用的解釋變量，用于預(yù)測(cè)和解釋全部腸道菌屬的相對(duì)豐度數(shù)據(jù)組成的響應(yīng)變量，結(jié)果如圖10所示，相對(duì)豐度數(shù)據(jù)中約有14%的變異度能夠被健康、便秘與腹瀉環(huán)境變量所解釋，能夠代表便秘和腹瀉與健康人群腸道菌群結(jié)構(gòu)差異顯著相關(guān)的關(guān)鍵菌。

在RDA排序圖中可以看到，位于3 種狀態(tài)下的菌均有顯著不同，腹瀉狀態(tài)下的腸道菌群多樣性要明顯低于便秘和健康狀態(tài)。其中健康狀態(tài)豐度較高的菌屬多屬于Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Streptococcaceae、Erysipelotrichaceae等產(chǎn)SCFAs細(xì)菌。腹瀉狀態(tài)下Megamonas的豐度較明顯，可能屬于腹瀉的關(guān)鍵菌，有待進(jìn)一步探究。便秘狀態(tài)下腸道菌群處于較復(fù)雜的狀態(tài)，其中Ruminococcaceae、Rikenellaceae、S24-7、Clostridiales、Prevotella以及Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Erysipelotrichaceae等產(chǎn)SCFAs菌數(shù)量較多。

圖9 腸道菌群中關(guān)鍵菌屬的變化Fig.9 Changes in key bacterial genera in the intestinal fl ora

圖10 冗余分析圖Fig.10 Biplot of redundancy analysis

2.5 微生態(tài)制劑對(duì)糞便中SCFAs表達(dá)水平的影響

為對(duì)腸道菌群特異性菌屬及其代謝產(chǎn)物進(jìn)一步分析，用氣相色譜法檢測(cè)糞便樣本中SCFAs的含量，從表1可看出，在測(cè)定范圍內(nèi)各樣本均具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.998以上。

表1 SCFAs的回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table1 Regression equations with correlation coefficients for SCFAs

圖11 服用微生態(tài)制劑后對(duì)糞便中SCFAs含量的影響Fig.11 Effect of microecologics on SCFAs in feces

腸道菌群微生態(tài)制劑干預(yù)后，糞便中檢測(cè)的SCFAs多為乙酸、丁酸和丙酸，這些SCFAs都能在短時(shí)間內(nèi)被結(jié)腸細(xì)胞吸收。在Sta組、PP組和PPrs組受試人群的腸道菌群中，與產(chǎn)SCFAs相關(guān)的菌屬都有明顯的增長(zhǎng)，其中PP組中產(chǎn)SCFAs相關(guān)菌屬的相對(duì)豐度要比其他兩組增長(zhǎng)明顯。

如圖11所示，與Ctro組相比，服用不同微生態(tài)制劑后，SCFAs含量存在顯著性差異。服用Sta后，丙酸含量顯著增加，乙酸與丁酸也在2周左右有所增加，隨著服用時(shí)間延長(zhǎng)尤其是停止服用后，SCFAs的含量基本有所增加。腹瀉人群腸道菌群結(jié)構(gòu)單一，服用PPrs后腸道菌群多樣性增高。受試人群在服用PP期間，不論是便秘還是腹瀉狀態(tài)，只有乙酸的含量增加，丙酸和丁酸甚至呈現(xiàn)降低的現(xiàn)象。尤其腹瀉人群在停止服用后SCFAs含量有著顯著差異。服用PP的受試人群腸道中Veillonellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae都增長(zhǎng)較快，可能與服用的微生態(tài)制劑內(nèi)包含的菌種有關(guān)。受試人群在服用PPrs后，乙酸和丁酸含量都在明顯增加，而且停止服用后，SCFAs的含量與正常對(duì)照組也沒(méi)有顯著差異。

3 討 論

近年來(lái)，很多研究表明腸道菌群與宿主的健康狀況息息相關(guān)，密切影響著宿主的營(yíng)養(yǎng)吸收、物質(zhì)代謝、免疫以及胃腸道發(fā)育等各個(gè)方面，宿主自身的基因型、年齡和免疫系統(tǒng)等因素在腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中起到了重要作用[24]。微生態(tài)制劑作為一種無(wú)毒、無(wú)污染的環(huán)保產(chǎn)品對(duì)維持腸道菌群與宿主穩(wěn)態(tài)方面起著重要的作用。

本研究中，服用3 種微生態(tài)制劑前后腸道菌群的多樣性及豐度都有著不同程度的變化，并且，服用微生態(tài)制劑組與對(duì)照組有交疊的趨勢(shì)，疾病狀態(tài)下的受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)在微生態(tài)制劑的調(diào)節(jié)下都不同程度地朝著健康狀態(tài)發(fā)展，說(shuō)明微生態(tài)制劑具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用，這與張家超等[25]的研究結(jié)論一致。在門的水平上，測(cè)得主要有放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）及藍(lán)藻細(xì)菌門（Cyanobacteria），其中絕大多數(shù)序列屬于Bacteroidetes和Firmicutes，約占總序列數(shù)的94.37%，這與前人的研究結(jié)果[26]相似，它們對(duì)機(jī)體健康起著關(guān)鍵作用。3 種微生態(tài)制劑中，服用Sta的受試人群腸道菌群豐度依然較低，但是較干預(yù)前還是有一定的積極調(diào)控作用，在Sta的作用下Firmicutes增加，這可能與腹瀉狀態(tài)人群本身菌群多樣性少有關(guān)；PP的作用效果具有時(shí)效性，對(duì)腸道菌群中Bacteroidetes和Firmicutes有明顯影響，減少了便秘人群腸道中Firmicute、Proteobacterias和Actinobacteria，并使Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯增加，而只增加了腹瀉人群腸道中的Firmicutes，這些現(xiàn)象只發(fā)生在服用期間，停止服用后又恢復(fù)了原有狀態(tài)；PPrs作用效果最好，不僅僅具有時(shí)效性，而且在停止服用后腸道菌群不會(huì)恢復(fù)到原有的疾病狀態(tài)，腹瀉組除了Firmicutes有比較明顯的減少外，相應(yīng)Actinobacteria、Bacteroidetes和Proteobacterias都有明顯的增長(zhǎng)；而便秘組除Bacteroidetes外，Actinobacteria、Proteobacterias和Firmicutes有明顯的增長(zhǎng)。說(shuō)明復(fù)合制劑的作用效果優(yōu)于單一制劑，這與曲巍等[27]得出的結(jié)論一致，攝入適量的復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)調(diào)節(jié)腸道菌群的平衡具有一定的幫助，相應(yīng)菌門的消長(zhǎng)與微生態(tài)制劑的成分有很大關(guān)系，并且，腸道菌群的多樣性還與受試人群的健康狀態(tài)有關(guān)，比如，便秘人群較腹瀉人群的多樣性要高。

另外，在屬水平上，本研究劃分所得的114 個(gè)屬中有近30 個(gè)菌屬豐度總和達(dá)到腸道菌群的90%以上。不同受試人群腸道內(nèi)核心菌屬呈現(xiàn)較大的差異性，主要分為Bacteroides和Prevotella兩種腸型，這與Arumugam等[28]劃分結(jié)果一致，也就是說(shuō)，3 種微生態(tài)制劑對(duì)于核心菌屬的改變幾乎無(wú)影響，說(shuō)明相較于短期的微生態(tài)制劑干預(yù)，長(zhǎng)期固定的膳食結(jié)構(gòu)對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成及穩(wěn)定有著深遠(yuǎn)的影響。此外，在微生態(tài)制劑干預(yù)下，Lachnospiraceae中的Blautia、Lachnospira以及Ruminococcaceae中Faecalibacterium、Oscillospir等與產(chǎn)SCFAs相關(guān)的菌屬都有明顯的增長(zhǎng)，其中Blautia和Faecalibacterium與SCFAs含量呈顯著正相關(guān)，并且PP組產(chǎn)SCFAs相關(guān)菌屬的相對(duì)豐度最高，而PPrs組中Bifidobacterium、Lactobacillus、Butyricimonas、Parabacteroides這些常見(jiàn)的外源性益生菌都有明顯的增長(zhǎng)，并且，隨著服用微生態(tài)制劑時(shí)間的延長(zhǎng)，可能性致病菌相對(duì)豐度降低，提示微生態(tài)制劑中的益生菌在促進(jìn)產(chǎn)SCFAs相關(guān)菌增加并升高SCFAs含量的同時(shí)，也能抑制有害菌的增長(zhǎng)，這與益生菌的生理功能[29]密不可分，這也是微生態(tài)制劑有益于人體腸道健康，特別是對(duì)腸道炎癥以及結(jié)直腸癌均具有治療作用[30]的重要原因。

多項(xiàng)研究表明，SCFAs主要包括乙酸、丙酸、丁酸，并且，結(jié)腸厭氧菌發(fā)酵小腸未消化吸收的碳水化合物產(chǎn)生乙酸，丙酸為擬桿菌門發(fā)酵的主要產(chǎn)物，丁酸主要由厚壁菌門代謝產(chǎn)生[31-33]，腸道中產(chǎn)SCFAs的相關(guān)菌屬及其代謝產(chǎn)生的SCFAs對(duì)宿主腸屏障功能的維護(hù)有重要作用[17]。本研究中，服用不同微生態(tài)制劑后，糞便中SCFAs含量存在顯著性差異，這與個(gè)體及采集樣本時(shí)構(gòu)成的差異等因素相關(guān)。由于Sta在體內(nèi)能完整地進(jìn)入結(jié)腸而不會(huì)被人體消化酶水解，可作為雙歧因子被雙歧桿菌利用后產(chǎn)生大量的SCFAs，服用Sta后，丙酸、乙酸與丁酸這3 種SCFAs的含量較干預(yù)前都有所增加，這與趙杰等[34]得出的結(jié)論相似，即Sta給腸道菌群提供發(fā)酵底物，產(chǎn)SCFAs的菌種能快速而且大量增長(zhǎng)，也不會(huì)隨著外源性微生態(tài)制劑的消失快速死亡。服用PPrs的腹瀉人群從服用到終止以后的一段時(shí)間，乙酸和丁酸含量都明顯增加，SCFAs的含量與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著差異；服用PP的人群，不論是便秘還是腹瀉的狀態(tài)，只有乙酸的含量有所增加，丙酸和丁酸甚至呈現(xiàn)降低的現(xiàn)象，尤其腹瀉人群在停止服用后SCFAs含量有顯著差異。此外，服用PP的受試人群腸道中Veillonellaceae、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae都增長(zhǎng)較快，該結(jié)果可能與服用的微生態(tài)制劑的組成成分有關(guān)，微生態(tài)制劑的4 種益生菌均有構(gòu)成生物屏障、降低膽固醇并產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物的作用，如此看來(lái)，如果攝入PP，腸道菌群中關(guān)鍵菌屬會(huì)快速增長(zhǎng)，但是代謝產(chǎn)物含量不會(huì)太高。

4 結(jié) 論

本研究以受試人群健康狀況作為選擇的依據(jù)，探討了不同微生態(tài)制劑干預(yù)后，受試人群腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化與產(chǎn)SCFAs相關(guān)菌屬的相關(guān)性，應(yīng)用Ion torrent PGM二代測(cè)序技術(shù)和多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，獲得的結(jié)論與近些年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究成果具有一致性。研究顯示受試人群尤其PP組和PPrs組中腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性隨干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)而有明顯增加，主要表現(xiàn)為Bacteroidetes和Firmicutes多樣性顯著增加，提示食用微生態(tài)制劑會(huì)改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，也提示腸道中相應(yīng)菌屬的消長(zhǎng)均與微生態(tài)制劑的成分有關(guān)，即PPrs比PP和Sta的作用效果和調(diào)節(jié)能力更突出。研究還表明，微生態(tài)制劑干預(yù)后促進(jìn)了腸道內(nèi)產(chǎn)SCFAs菌屬增長(zhǎng)，提高了外源性益生菌的豐度和抑制了條件致病菌的增長(zhǎng)?？傊?，腸道疾病狀態(tài)下的人群服用微生態(tài)制劑后，具有向健康人群的腸道菌群結(jié)構(gòu)調(diào)整的趨勢(shì)，菌群多樣性和SCFAs表達(dá)水平提高，有利于腸道菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)態(tài)和健康。因此本研究結(jié)論為：微生態(tài)制劑有改變腹瀉、便秘人群腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的功效，證明了與產(chǎn)SCFAs菌屬的豐度提高有關(guān)，進(jìn)一步明確了利用微生態(tài)制劑調(diào)節(jié)和恢復(fù)便秘、腹瀉人群腸道健康的科學(xué)價(jià)值。

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