水飛薊油的體外抗氧化活性及對(duì)氧化損傷小鼠的保護(hù)作用

朱淑云，周 越，肖 香，董 英，朱勝虎

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇恒順集團(tuán)有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212143）

水飛薊（Silybum marianum L. Gaertn.）為菊科水飛薊屬草本植物，原產(chǎn)于地中海沿岸，現(xiàn)亞洲、歐洲、南北美洲等地均有種植。水飛薊是一種優(yōu)良的藥用植物和油料植物。其藥用有效成分水飛薊素主要在水飛薊籽殼中[1]，籽仁中蛋白質(zhì)和油的含量較高，水飛薊籽的含油率一般在20%～30%左右。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)水飛薊的研究主要集中在水飛薊素的提取、純化及其生物活性的研究上，而對(duì)其副產(chǎn)物水飛薊油的研究較少，致使水飛薊油的開發(fā)利用相對(duì)滯后[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)75%以上（以亞油酸為主），且富含VE，此外還含有β-谷甾醇、豆甾醇等固醇類成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。研究表明水飛薊油具有較好的降血脂、抗肝中毒和預(yù)防肝病的作用[7-9]。安全性實(shí)驗(yàn)表明，水飛薊油無(wú)致突變、致畸作用，無(wú)明顯亞慢性毒性[10-11]，且被國(guó)家衛(wèi)生部在2014年第6號(hào)公告中批準(zhǔn)為新資源食品。

大量研究證明，自由基的氧化損傷與許多疾病有關(guān)，人體通過(guò)適當(dāng)攝入抗氧化物質(zhì)可以降低體內(nèi)自由基水平，防止脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生，從而幫助機(jī)體抵御疾病。但目前應(yīng)用于食品中的人工合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、叔丁基羥基茴香醚（butylated hydroxy anisol，BHA）等被發(fā)現(xiàn)有不同程度的副作用，因此人們迫切希望從自然界中尋找高效安全的天然抗氧化劑，而水飛薊油中含有許多抗氧化活性很強(qiáng)的物質(zhì)，如VE和固醇類物質(zhì)，但現(xiàn)有關(guān)水飛薊油抗氧化活性的研究鮮有報(bào)道；因此本實(shí)驗(yàn)研究了水飛薊油的體外抗氧化活性，并進(jìn)一步研究了水飛薊油對(duì)氧化損傷小鼠的保護(hù)作用，以期為水飛薊油的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

3 月齡ICR小鼠40 只，購(gòu)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2013-0011，所有小鼠均飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物房?jī)?nèi)。

水飛薊油由水飛薊籽仁通過(guò)低溫加壓溶劑萃取技術(shù)（0.2 MPa壓力），以液化丁烷為溶劑常溫制得；橄欖油市售。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美國(guó)Sigma公司；D-半乳糖美國(guó)Amresco公司產(chǎn)品；總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

加壓溶劑萃取裝置 江南集團(tuán)與江蘇大學(xué)聯(lián)合研制；FC-160型錘式粉碎機(jī) 上海中藥機(jī)械廠；L500離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T8電動(dòng)均漿器德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

清除DPPH自由基能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12-13]，用無(wú)水乙醇配制質(zhì)量濃度分別為10、15、20、25、30、50 mg/mL的水飛薊油作為待測(cè)樣品備用。取2 mL待測(cè)樣品加入2 mL 0.04 g/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，混合均勻，反應(yīng)20 min，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處吸光度，記為A1；另取2 mL待測(cè)樣品加入無(wú)水乙醇2 mL，反應(yīng)20 min，測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處吸光度，記為A2；再測(cè)定2 mL 0.04 g/L DPPH無(wú)水乙醇溶液和2 mL無(wú)水乙醇在517 nm波長(zhǎng)處吸光度A0。所有測(cè)定平行進(jìn)行3 次，取平均值。按照式（1）計(jì)算水飛薊油對(duì)DPPH自由基的清除率。

1.3.2 清除羥自由基能力的測(cè)定

清除羥自由基能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]，將水飛薊油用無(wú)水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 mg/mL的樣品備用。取2 mL水飛薊油，依次加入2 mL 6 mmol/L的FeSO4和H2O2，混勻后靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸，混勻，靜置30 min，測(cè)其510 nm波長(zhǎng)處吸光度記為Ai，用蒸餾水代替水楊酸的吸光度記為Aj。以蒸餾水代替水飛薊油的吸光度記為A0。每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取平均值。按照式（2）計(jì)算水飛薊油對(duì)羥自由基的清除率。

1.3.3 T-AOC的測(cè)定

[15-16]的方法，將水飛薊油用無(wú)水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.5、2.0、4.0、6.0 mg/mL的樣品備用。取0.4 mL水飛薊油，加入4 mL磷鉬酸試劑（28 mmol/L磷酸鈉、0.6 mol/L濃硫酸和4 mmol/L鉬酸銨），95 ℃恒溫水浴90 min，測(cè)定695 nm波長(zhǎng)處吸光度。每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取平均值。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為4 組（正常組、模型組、水飛薊油組、橄欖油組），每組10 只，經(jīng)1 周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水，其他組小鼠均腹腔注射D-半乳糖500 mg/（kg·d）（以體質(zhì)量計(jì)，下同），第3、4組小鼠分別灌胃10 mL/（kg·d）劑量的水飛薊油和橄欖油，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水、自由采食，每天固定時(shí)間注射和灌胃，連續(xù)飼喂7 周。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采血，引頸處死小鼠，迅速取肝組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸去水分后，以電子天平準(zhǔn)確稱取質(zhì)量，置潔凈塑料袋中密封，超低溫保存。

1.3.5 血清中抗氧化酶活力和T-AOC的測(cè)定

小鼠血1 500 r/min離心15 min，取上層血清按試劑盒要求測(cè)定SOD、GSH-Px、T-AOC水平。

1.3.6 組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1.3.6.1 光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)

取小鼠肝組織用10%中性福爾馬林溶液固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明處理，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.6.2 肝組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察

取小鼠肝組織切割成1 mm3的組織塊，立即投入2.5%戊二醛溶液進(jìn)行前固定，然后用磷酸鹽緩沖溶液清洗數(shù)次，再經(jīng)過(guò)1%鋨酸溶液后固定，丙酮系列脫水，環(huán)氧樹脂包埋，切片后用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，透射電子顯微鏡下觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 水飛薊油對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖1 水飛薊油對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging effect of Silybum marianum seed oil on DPPH radicals

由圖1可看出，在10～50 mg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，水飛薊油對(duì)DPPH自由基的清除率隨著質(zhì)量濃度升高而逐漸增大，幾乎呈線性關(guān)系，表現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。其IC50為33.68 mg/mL，比蓮子胚芽油（IC50＝48.90 mg/mL）[17]和甜橙油（IC50＝66.10 mg/mL）[18]等植物油的低，與山茶油相近（IC50＝35.13 mg/mL）[19]，表明其具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

2.2 水飛薊油對(duì)羥自由基的清除能力

圖2 水飛薊油對(duì)羥自由基的清除率Fig.2 Scavenging effect of Silybum marianum seed oil of hydroxyl radicals

羥自由基是破壞性極強(qiáng)的自由基，它可以與活細(xì)胞中許多分子反應(yīng)，且速度極快，從而引發(fā)各種病變，是導(dǎo)致疾病和衰老的主要因素[20-21]。由圖2可以看出，在5～25 mg/mL范圍內(nèi)，水飛薊油對(duì)羥自由基的清除率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)其質(zhì)量濃度為25 mg/mL時(shí)清除率達(dá)54.04%，遠(yuǎn)高于蓮子胚芽油（IC50＝3.13 mg/mL）[17]，但遠(yuǎn)低于南瓜籽油（IC50＝121 mg/mL）[22]，體現(xiàn)了較好的羥自由基清除活性。

2.3 水飛薊油的T-AOC

圖3 水飛薊油的T-AOCFig.3 Total antioxidant capacity of Silybum marianum seed oil

由圖3可見，樣品液的吸光度隨質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，表明其抗氧化活性逐漸增強(qiáng)，當(dāng)質(zhì)量濃度為6 mg/mL時(shí)其吸光度達(dá)到0.383，略低于歐李仁油和橄欖油[23]，但也說(shuō)明其在體外的T-AOC較強(qiáng)。

2.4 水飛薊油對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 水飛薊油對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響（n＝10）Table1 Effect of Silybum marianum seed oil on body weight of mice (n= 10)

由表1可知，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠的體質(zhì)量都有增加，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明水飛薊油和橄欖油的添加對(duì)小鼠的生長(zhǎng)、食欲、消化及其物質(zhì)代謝不存在顯著影響。

2.5 水飛薊油對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px活力和T-AOC的影響

SOD是體內(nèi)最有效的抗氧化劑，能清除體內(nèi)超氧陰離子和各種過(guò)氧化物，防止活性氧的生成和蓄積，對(duì)機(jī)體的抗氧化水平起著非常重要的作用[24-25]。GSH-Px是體內(nèi)重要的催化過(guò)氧化氫分解的酶，其能催化GSH還原過(guò)氧化氫，使過(guò)氧化氫被還原成水，從而穩(wěn)定含巰基的酶，防止血紅蛋白及其他輔助因子受到氧化損傷，從而減輕過(guò)氧化物對(duì)機(jī)體的損傷，保護(hù)生物體不受氧化損害[26]。而T-AOC的作用主要是維持內(nèi)環(huán)境活性氧的動(dòng)態(tài)平衡，清除過(guò)高的活性氧，使機(jī)體處于氧化還原相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，T-AOC水平的下降是造成體內(nèi)活性氧水平升高的原因之一[27]。因此SOD、GSH-Px、T-AOC水平的變化可反映機(jī)體抗氧化能力的變化。水飛薊油對(duì)小鼠SOD和GSH-Px的活力及T-AOC的影響見表2。

表2 水飛薊油對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px、T-AOC的影響（n＝ 10）Table2 Effect of Silybum marianum seed oil on SOD, GSH-Px and T-AOC in serum of mice (n= 10)

表2顯示，模型組小鼠的SOD和GSH-Px活力及T-AOC顯著低于正常組（P＜0.05），說(shuō)明D-半乳糖可引起小鼠體內(nèi)抗氧化能力的下降。水飛薊油和橄欖油可顯著提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活力，并能提高其T-AOC，使其達(dá)到正常組水平。說(shuō)明水飛薊油和橄欖油可提高小鼠的抗氧化能力，降低D-半乳糖對(duì)小鼠的氧化損傷，從而達(dá)到抗氧化的目的。研究發(fā)現(xiàn)，植物油中的VE和甾醇類物質(zhì)具有很強(qiáng)的生物活性[28-31]，而水飛薊油含有豐富的VE和β-谷甾醇，這也是其具有抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.6 水飛薊油對(duì)小鼠肝組織形態(tài)的影響

肝臟是生物體內(nèi)物質(zhì)代謝的重要器官，具有物質(zhì)儲(chǔ)存、代謝、解毒等多種功能，肝組織的形態(tài)變化是研究機(jī)體氧化損傷的重要指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：正常組小鼠肝組織細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹；模型組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的變化，細(xì)胞排列不整齊，肝細(xì)胞間沒(méi)有明顯的界限，細(xì)胞之間連接比較松散；水飛薊油和橄欖油組小鼠的肝細(xì)胞形態(tài)基本與正常組一樣，細(xì)胞排列整齊，無(wú)明顯的腫脹（圖4）。說(shuō)明水飛薊油可以對(duì)小鼠肝細(xì)胞的氧化損傷起到保護(hù)作用，這與其抗氧化活性有密切關(guān)系。

圖4 水飛薊油對(duì)小鼠肝組織形態(tài)的影響（400×）Fig.4 Effect of Silybum marianum seed oil on liver tissue morphology in mice (400 ×)

2.7 水飛薊油對(duì)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

圖5 水飛薊油對(duì)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 Effect of Silybum marianum seed oil on ultrastructure of mouse liver cells

如圖5所示，正常組小鼠肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，核膜完整，細(xì)胞中線粒體數(shù)量多，形態(tài)正常，線粒體嵴清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富；模型組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯改變，部分細(xì)胞器結(jié)構(gòu)不清或變形，線粒體膜損傷，結(jié)構(gòu)不完整，出現(xiàn)腫脹變形，部分線粒體出現(xiàn)空泡，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相對(duì)減少；水飛薊油和橄欖油組小鼠的肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均接近正常組，可見細(xì)胞核膜完整，線粒體清晰，形態(tài)規(guī)則，線粒體腫脹不明顯，無(wú)空泡現(xiàn)象。由此可見，D-半乳糖對(duì)肝細(xì)胞造成了氧化損傷，引起了線粒體結(jié)構(gòu)的改變，水飛薊油可以減輕小鼠肝細(xì)胞氧化損傷的程度，從而維持細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的完整性，具有很好的抗氧化作用。水飛薊油的抗氧化活性與其含有大量的不飽和脂肪酸和VE，以及β-谷甾醇、豆甾醇等固醇類成分密切相關(guān)，但具體的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

水飛薊油的體外抗氧化結(jié)果表明其具有一定的抗氧化活性，其抗氧化能力與質(zhì)量濃度有較好的量效關(guān)系。水飛薊油清除羥自由基的能力高于DPPH自由基，其總抗氧化能力較強(qiáng)。

水飛薊油的體內(nèi)抗氧化結(jié)果表明，水飛薊油的抗氧化活性與橄欖油相當(dāng)，可以顯著提高小鼠血清中SOD、GSH-Px和T-AOC水平，說(shuō)明水飛薊油可以提高D-半乳糖氧化損傷小鼠的抗氧化能力。通過(guò)光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)水飛薊油可以改善氧化損傷小鼠肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保護(hù)小鼠肝細(xì)胞形態(tài)的完整性，維持細(xì)胞正常功能的發(fā)揮。

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