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(集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021)

0 引言

大型海藻光合固碳的碳源來自海水。海水中溶解的無機碳以3種形式存在，即HCO3-、CO32-及CO2。正常海水(pH=8)中，HCO3-濃度約占總無機碳的92%，CO32-約占7%，CO2約占1%[1-2]。三種無機碳中，只有HCO3-和CO2是海藻可以直接吸收利用的碳源，但這兩種無機碳的理化性質(zhì)限制了藻類對二者的獲?。篊O2是小分子，通過細胞膜上的蛋白通道擴散進入細胞，但其濃度低，在海水中的擴散速度比空氣中慢一萬倍，導致藻類周圍的CO2消耗完后無法得到有效補充；HCO3-是海水中無機碳的主要組分，但它是陰離子，不易穿過細胞膜，藻類需要消耗能量來主動獲取[1,3-5]。因此，海水的CO2濃度遠低于光合固碳的關(guān)鍵酶——核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)的CO2半飽和點，藻類通過CO2濃縮機制(CO2concentrating mechanism，CCM)避免光合固碳受限于海水中CO2的濃度([CO2])。因此，CCM是藻類光合固碳的核心機制，壇紫菜等紅藻也具有CCM[1,3,6]。

對模式真核藻類萊茵衣藻的CCM研究發(fā)現(xiàn)，萊茵衣藻主要有3條無機碳吸收途徑[3]。細胞通過細胞膜上的CO2通道蛋白吸收海水中的CO2。而HCO3-的吸收利用有2個途徑：1)海水中的HCO3-被位于周質(zhì)空間的胞外碳酸酐酶(CA)催化生成CO2，經(jīng)CO2通道蛋白進入細胞，最終被用于光合固碳；2)海水中的HCO3-經(jīng)HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白進入細胞，經(jīng)細胞內(nèi)CA催化HCO3-生成CO2，然后CO2被用于光合固碳。紫菜也是真核生物，具有特殊的異型世代交替，主要分為單倍體的葉狀體世代和雙倍體的絲狀體世代。以往的研究發(fā)現(xiàn)壇紫菜的葉狀體世代的碳源主要是海水中的HCO3-，通過胞外CA催化HCO3-脫水生成CO2供給光合固碳[7-8]。通過陰離子轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑發(fā)現(xiàn)，條斑紫菜的自由絲狀體主要通過HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白來獲得外界HCO3-[9]。目前還沒有報道壇紫菜絲狀體CCM的研究，因此對其無機碳吸收途徑還不清楚。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和pH梯度

本研究所用的實驗材料是壇紫菜雜交品系Z-61的絲狀體，在壇紫菜種質(zhì)資源庫中保種達12年之久。隨機測定種質(zhì)資源庫中保種絲狀體的pH值，發(fā)現(xiàn)其值為(8.8±0.6)(n=17)，說明絲狀體長期在偏堿性的海水中生長。用天然海水配置的PES(provasoli’s enrichment solution )培養(yǎng)基培養(yǎng)絲狀體，培養(yǎng)溫度為21 ℃，光照強度60 μmol/(m2·s)，光照周期12 L∶12 D，充空氣培養(yǎng)，每2天更換1次培養(yǎng)基。用無菌金屬漏網(wǎng)收集絲狀體，然后轉(zhuǎn)移到pH不同的海水中培養(yǎng)4 h。本研究共設(shè)置4個pH梯度：6、7、8、9，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)海水pH，每個梯度設(shè)3個重復。

1.2 實時熒光定量PCR

過濾收集壇紫菜絲狀體約0.1 g，用濾紙吸干水分，在液氮中研磨后，用E.Z.N.A 植物 RNA 提取試劑盒(OMEGA，德國)提取總RNA。根據(jù)基因序列設(shè)計qPCR正反向引物，分析基因在不同pH處理下的表達差異。提取的總RNA按PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa，大連)的說明書進行操作。25 μL的反應體系包含：12.5 μL 2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)，0.2 μmol/L引物和2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。擴增程序為95 ℃變性1 min；95 ℃處理10 s，62 ℃處理30 s，共40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后從55 ℃緩慢升溫至95 ℃，然后繪制溶解曲線。熒光定量PCR擴增在ABI7300型定量PCR儀上進行，以10 × 梯度稀釋的cDNA為模板進行定量PCR擴增，制作標準曲線。每次反應都設(shè)置陰性對照和無模板對照，每個反應設(shè)3個平行復孔。本研究中基因表達水平定量分析所采用的引物由大連寶生物工程有限公司合成，引物名稱和序列如表1所示。

表1 實驗中所用引物的名稱和序列

1.3 光響應曲線

使用8個不同強度(166,607,1267,1795,2724,3395,4934，6578 μmol·m-2·s-1)、持續(xù)時間為10 s的光化光來測定快速光響應曲線，測定儀器為Diving-PAM(德國)。相對電子傳遞速率(rETR)的計算公式為：rETR=yield×0.84×0.5×PAR，其中，yield為光系統(tǒng)Ⅱ的有效光化學效率，0.84為固定常數(shù)，0.5代表約50%被吸收的光能分配到光系統(tǒng)Ⅱ，PAR則為光化光的強度。快速光響應曲線擬合公式為：ETR=ETRmax×tanh(α×PAR/Pmax)，其中，ETRmax為ETR的最大值，PAR則為光化光的強度，α為光限制部分的初始斜率。

1.4 光合速率和呼吸速率測定

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差(one-way ANOVA，LSD)分析采用不同pH處理的組間差異，P>0.05為差異不顯著；P<0.05為顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 光合作用和呼吸作用

壇紫菜Z-61絲狀體的凈光合速率明顯隨著pH降低而顯著增加(P<0.01)，3個低pH導致凈光合速率至少增加了74%(見圖1)。在不同pH下，抑制劑對凈光合速率的影響差異較大。在保種條件下(pH=9)，AZ和EZ對凈光合速率的抑制率達到80%，遠高于DIDS的抑制率(見圖2)，這說明壇紫菜絲狀體在保種條件下主要通過胞外碳酸酐酶來獲取無機碳，其次是HCO3-轉(zhuǎn)運蛋白，而胞內(nèi)碳酸酐酶的貢獻較小。不同pH下，DIDS的抑制率穩(wěn)定在40%以下，并且不同pH的影響較小。而EZ的抑制率隨pH降低而顯著降低，這說明絲狀體直接獲取的CO2隨pH降低/[CO2]增加而增加。在pH=6下，AZ和EZ對凈光合速率的抑制率的差異較大，說明胞內(nèi)碳酸酐酶對光合速率的貢獻較大，達到54%，顯著高于pH=9時(P<0.001)。

但是，通過快速光曲線的測定發(fā)現(xiàn)，降低pH顯著影響了rETR(見圖3)，rETRmax(最大相對電子傳遞速率，maximal rETR)、Ik(光飽和點，the light saturation point)和η(表觀光化學效率，the apparent photo chemical offciency)都隨著pH降低而顯著降低(見表2)。說明Z-61絲狀體的光系統(tǒng)Ⅱ受到了短期pH處理的負面影響，當[CO2]增加降低了對光的需求。而壇紫菜絲狀體的呼吸作用也隨pH降低有下降的趨勢，其中，pH=6下的呼吸速率顯著低于pH=9(見圖4)。說明低pH影響了呼吸速率的正常進行。

表2 快速光曲線擬合出的3個參數(shù)

pHrETRmaxIkη667．5±5．9a632．9±14．8a0．11±0．00a788．2±11．1ab502．9±91．5a0．18±0．01b8102．8±4．4b538．0±59．8a0．19±0．01bc9180．2±24．3c872．6±102．6b0．21±0．02c

說明：上標無相同字母表示顯著差異。Note：Superscripts represent significant difference among treatments.

2.2 低pH對基因表達的影響

不同的pH對4條碳酸酐酶基因的作用各不相同(見圖5)。

當pH值降到7和8時僅顯著降低PhβCA1的表達(P<0.05)。而pH=6則顯著降低PhβCA1和PhβCA2的表達水平(P<0.05)，卻對PhβCA3和PhγCA1的影響不明顯(P>0.05)。

pH降低顯著降低了6條光合固碳關(guān)鍵酶基因的表達水平(見圖6)，特別是pH=6導致PhRubisco、PhcpFBP、PhcFBP、PhSBP、PhPEPC和PhPEPCK的表達水平分別降低了85%以上(P<0.05)。而pH=8僅降低了PhPEPCK、PhcFBP和PhRubisco的表達，降低幅度分別達到93%、61%和88%(P<0.05)。

3 討論

本研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過長達12年的高pH/低[CO2]處理，壇紫菜Z-61絲狀體依然能在生理和分子水平快速響應海水[CO2]的大幅度升高。一些海洋微藻經(jīng)過幾百代(約2年)的高[CO2]適應后，其光合作用和生長速率等都受到明顯影響，特別是其無機碳吸收利用機制進化成適應高[CO2]狀態(tài)[12]。鈣化浮游植物顆石藻(Emilianiahuxleyi)在高[CO2](1000～2000 ppmv)下適應500代后，生長速率比未經(jīng)過適應的明顯提高，但鈣化速率明顯降低[16]。CCM在物種間和不同品系間的異同反應了各個物種和品系對無機碳的適應，最終表現(xiàn)在無機碳的吸收利用上[1,3]。而海藻的不同品系對環(huán)境[CO2]變化的適應能力不同，決定了他們在群體中的比例[11]。壇紫菜絲狀體對海水[CO2]的快速響應能力，以及高[CO2]對絲狀體光合作用的促進作用，說明壇紫菜絲狀體將受益于大氣[CO2]升高。同樣壇紫菜葉狀體的生長和光合作用也受益于[CO2]升高/pH降低。隨大氣[CO2]升高，壇紫菜的育苗和養(yǎng)殖都將受益于高[CO2]，野生壇紫菜因而可能在潮間帶生態(tài)系統(tǒng)中獲得更多競爭優(yōu)勢。

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