高云雨， 鐘路遙， 董冠園， 佘偉怡， 周嬌嬌， 劉思遠(yuǎn)， 田生禮

(深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院 深圳市微生物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518052)

里氏木霉(Trichodermareesei)是一種絲狀真菌，是重要的纖維素酶產(chǎn)生菌，廣泛用于生產(chǎn)纖維素酶[1]。里氏木霉纖維素酶是一個復(fù)雜的酶體系，由三類酶組成，包括內(nèi)切葡聚糖酶(endo-β-1,4-D-glucanase，EG)、外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-g1ucanase，CBH)和 β-葡萄糖苷酶(β-g1ucosidase，BGL)。里氏木霉具有強(qiáng)大的合成和分泌蛋白的能力，其主要生產(chǎn)纖維素酶和纖維二糖水解酶 I (CBH1)，表達(dá)量最高的菌株分泌的纖維素酶總量可達(dá) 100 g/L[2]。里氏木霉的基因組只有33.9 Mb，比其他絲狀真菌的要小得多[3]。而且其安全無毒易于培養(yǎng)，因此，里氏木霉是重組蛋白表達(dá)和生產(chǎn)的優(yōu)良宿主,通過基因工程等手段可以高效調(diào)控里氏木霉纖維素酶基因以提高纖維素酶產(chǎn)量。里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)存在葡萄糖效應(yīng)，當(dāng)存在快速利用碳源如葡萄糖時纖維素酶基因的表達(dá)會受抑制，這是因?yàn)槠咸烟钦T導(dǎo)了里氏木霉中碳源阻遏調(diào)控因子的表達(dá)，目前公開發(fā)表的兩個阻遏蛋白是CRE1和ACE1。CRE1蛋白是Cys2-His2型轉(zhuǎn)錄因子[4]，是一個廣域轉(zhuǎn)錄抑制因子，能調(diào)節(jié)纖維素酶和木聚糖酶基因的表達(dá)，參與脯氨酸代謝、乙醇代謝、多糖水解等過程中的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[5]。研究表明，敲除或抑制里氏木霉野生型菌株中的cre1基因，可顯著提高纖維素酶的表達(dá)[6-7]。但是完全敲除cre1會引起纖維素酶以外的其他基因的表達(dá)變化，所以直接敲除cre1基因不是提高纖維素酶表達(dá)的最佳方法[8]，而采用RNAi對cre1基因進(jìn)行抑制的方法可以抑制cre1的表達(dá)同時對其他無關(guān)基因不產(chǎn)生影響。ACE1是一個含有3個Cys2-His2類鋅指結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合蛋白，ACE1為轉(zhuǎn)錄抑制因子，在里氏木霉中敲除基因ace1后，在纖維素和槐糖的培養(yǎng)條件下能夠提高主要的纖維素酶基因和半纖維素酶基因表達(dá)量[9]。目前，RNA干擾技術(shù)(RNA Interference, RNAi)在真菌中應(yīng)用廣泛，應(yīng)用RNAi技術(shù)對絲狀真菌如康氏木霉、里氏木霉和嗜熱毀絲霉的cre1基因的調(diào)控作用已有較多的研究發(fā)表[7，10-11]。大部分使用的是長鏈RNAi干擾技術(shù)以及誘導(dǎo)型干擾載體，對cre1使用短鏈siRNA組成型干擾載體未見報(bào)道。本文將利用Wang等[12]從里氏木霉糖代謝基因中篩選出了丙酮酸脫羧酶基因(pyruvate decarboxylase，pdc)的組成型強(qiáng)啟動子Ppdc和終止子Tpdc構(gòu)建里該氏木霉組成型表達(dá)載體。李潔璇等[13]已經(jīng)在里氏木霉中應(yīng)用該啟動子和終止子構(gòu)建了紅色熒光蛋白的siRNA干擾載體，并且成功地在里氏木霉中干擾了紅色熒光蛋白的表達(dá)，但其使用組成型siRNA干擾載體仍然需要和PAN7-1共轉(zhuǎn)化以獲得真菌的潮霉素抗性。本研究通過構(gòu)建里氏木霉cre1組成型siRNA干擾載體，使用組成型啟動子和終止子同時包含潮霉素抗性基因，可高效便捷地干擾里氏木霉cer1基因的表達(dá)，探討里氏木霉cre1基因沉默后，對纖維素酶基因的表達(dá)會如何變化，為里氏木霉纖維素酶基因的多靶向表達(dá)調(diào)控提供新的思路和實(shí)驗(yàn)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質(zhì)粒 大腸埃希菌JM107由本實(shí)驗(yàn)室保存，里氏木霉QM9414購自美國模式菌種收藏中心(ATCC);質(zhì)粒pLXT帶有真菌篩選標(biāo)記潮霉素B抗性基因(Hph)和大腸埃希菌篩選標(biāo)記氨芐青霉素抗性基因(Amp)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 里氏木霉液體基本培養(yǎng)基：KH2PO42 g/L，(NH4)2SO41.4 g/L，尿素0.3 g/L，CaCl2·2H2O 0.4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L，MnSO4·H2O 0.001 6 g/L，ZnSO4·7H2O 0.001 7 g/L，CoCl2·6H2O 0.003 7 g/L，蛋白胨2 g/L，吐溫-80 1 g/L，葡萄糖20 g/L。

1.1.3 試劑 各種DNA工具酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker和RNase Free H2O等均購自TaKaRa 公司；DNA膠回收純化試劑盒、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；真菌總RNA提取試劑盒購自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；qPCR試劑盒(Bestar?SybrGreen qPCR mastermix)購自DBI Bioscience公司；溶壁酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum)購自Sigma公司；潮霉素和氨芐青霉購自Invitrogen公司；其他試劑均購自上海生工生物工程有限公司。

1.1.4 儀器 高壓自動滅菌鍋(Hirayama，HVE-50)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備總廠，SW-CJID)；熒光定量PCR儀(analytik jena, qTOWER3)；PCR儀(ABI，2720)；冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific，Multifuge XIR)；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，ND2000)；小型離心機(jī)(Eppendorf，Minispin)；pH計(jì)(Mettler-Toledo，320-S)；電泳儀(Amersham Pharmacia，EPS-601)；水平電泳槽(北京六一，DYCP-31D)；高純水儀(力新儀器有限公司，Heal force ROP3)；核酸成像系統(tǒng)(Bio-Rad，GEL DOX XR+)；低溫?fù)u床(上海蘇坤，SKY-200B)；低溫培養(yǎng)箱(上海愛朗，LTI-700)；奧林匹斯BX51TRF System (東京，日本)。

1.2 方法

1.2.1cre1干擾片段的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的CRE1的Protein ID：120117，在里氏木霉基因組網(wǎng)站(http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html)查找到cre1基因全序列。cre1位于scaffold 2中785 322～788 378 bp，包含1個外顯子，基因長度為3 075 bp。將cre1基因的mRNA序列，輸入網(wǎng)站(Invitrogen Block-iT RNAi Designer)進(jìn)行siRNA靶序列設(shè)計(jì)，選擇其中3條作用于不同位點(diǎn)的siRNA干擾片段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)靶序列的位置順序命名為cre1-T4、cre1-T7和cre1-T10。再另選一條將其序列順序打亂，作為陰性對照，命名為cre1-Neg。設(shè)計(jì)合成干擾片段的序列見表1。cre1的siRNA干擾片段分別由正、反義siRNA序列構(gòu)成，中間使用9 nt(TTCAAGAGA)的穩(wěn)定loop作為莖環(huán)連接siRNA，同時在該片段兩端5′端加入一個突出dA，便于與所構(gòu)建的T載體pLXT連接。分別設(shè)計(jì)好siRNA的正義鏈和反義鏈，由Invitrogen公司合成寡核苷酸鏈。然后把待退火的DNA oligos分別用雙蒸水配制成50 μmol/L濃度，退火后獲得的雙鏈DNA長度為54 bp。

表1 cre1的siRNA干擾片段

1.2.2 干擾表達(dá)盒的構(gòu)建 該載體的一個特征是含有潮霉素抗性基因，只需轉(zhuǎn)化一個DNA片段即可獲得含有抗性基因的陽性轉(zhuǎn)化子，減少篩選的工作量。含潮霉素抗性基因的干擾載體pLXT(載體圖譜見圖1)，通過限制性內(nèi)切酶AhdI酶切后，載體DNA雙鏈的3′端都懸掛一個胸腺嘧啶殘基dT，設(shè)計(jì)的干擾片段5′端都帶有一個dA，所以載體可直接連接干擾片段，以期實(shí)現(xiàn)對表達(dá)宿主里氏木霉高效轉(zhuǎn)化和對靶基因的干擾表達(dá)。構(gòu)建成功的含有干擾cre1基因的重組體，提取質(zhì)粒分別命名為Ppdc-T4-Tpdc、Ppdc-T7-Tpdc、Ppdc-T10-Tpdc和Ppdc-Neg-Tpdc。由于載體上有潮霉素抗性基因hph，質(zhì)粒可直接進(jìn)行里氏木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

圖1 載體pLXT圖譜Fig.1 A plasmid map of pLXT vector

1.2.4 基因組DNA提取 將PCR篩選出來的轉(zhuǎn)化子接種于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，制備適量孢子懸液接種于液體基本培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)2 d。抽濾菌液，得到菌絲體，液氮研磨成粉后使用omega的E.Z.N.A? Fungal DNA Kit提取基因組DNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的濃度和質(zhì)量。

1.2.5 RNA提取 為分析siRNA干擾片段對纖維素酶活力的影響，將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別接種于10 mL基本培養(yǎng)基中，每個菌株分別做3個平行樣品，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h后，每種重組菌取1.5 mL菌液接種到30 mL含有0.1%微晶纖維素(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h和144 h后，利用omega的E.Z.N.A?. Fungal RNA Kit試劑盒，按照說明書的方法將菌絲使用液氮研磨成粉后提取總RNA。用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA樣品的濃度和質(zhì)量。

1.2.6 RNA反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，以Random Primer為引物，將約100 ng RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行熒光定量PCR。每個反應(yīng)20 μL體積，包括2 μL模板(1∶ 60稀釋反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)，10 μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，8 μmol/L 正反向引物(表2)各0.5 μL和7 μL nuclease-free水。程序設(shè)置：預(yù)變性95 ℃ 30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸31 s，運(yùn)行40個循環(huán)。運(yùn)行結(jié)束后得到融解曲線，用以核對PCR產(chǎn)物的特異性。所有PCR反應(yīng)每個樣品做3個復(fù)孔。目的基因的表達(dá)量通過內(nèi)參基因sar1校正。以對照菌株的表達(dá)量為1，其他轉(zhuǎn)化子的表達(dá)量與對照樣品的比值作為數(shù)據(jù)分析。

表2 熒光定量PCR使用的引物

1.2.7 酶活測定 為分析siRNA干擾片段對纖維素酶活力的影響，將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別接種于30 mL基本培養(yǎng)基中，每個菌株分別做3個平行樣品，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)48 h后，每種重組菌取1.5 mL菌液接種到30 mL含有0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))微晶纖維素的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28 ℃、250 r/min培養(yǎng)，一般來說，里氏木霉的濾紙酶活性在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中會隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加，并將在誘導(dǎo)約144 h達(dá)到最大[15]。所以在48 h和144 h分別收集酶液，將粗酶液稀釋一定倍數(shù)后測定其濾紙酶活和CMC酶活。濾紙酶活(FPA)和羧甲基纖維素(CMC)酶活測定方法參考Ghose[16]。以CMC和Whatman No.1濾紙為底物，分別加酶液0.5 mL, 50 ℃孵育30 min和1 h，加DNS沸水浴5 min。測定OD540值，每個樣品做3個重復(fù)，結(jié)果取平均值。以1 h內(nèi)水解50 mg濾紙釋放出2.0 mg葡萄糖或30 min內(nèi)水解2%羧甲基纖維素釋放出0.5 mg葡萄糖的酶液稀釋倍數(shù)來計(jì)算FPU和CMCase活性單位，單位為IU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 里氏木霉siRNAW干擾表達(dá)盒完整性檢測

將重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10、T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414分別提取轉(zhuǎn)化子基因組進(jìn)行PCR鑒定，使用引物1：5′-CCTGCAAGTCTCCATCACAAG-3′，引物2：5′-TTCATAGTCCCATTGTCAGCA-3′，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示在1 000 bp處有明顯條帶，該條帶的大小與siRNA干擾表達(dá)盒的大小基本一致,進(jìn)一步對PCR擴(kuò)增的DNA片段進(jìn)行測序分析，表明DNA序列與siRNA干擾表達(dá)盒的序列一致,進(jìn)一步證明了干擾表達(dá)盒成功整合到里氏木霉QM9414基因組中。

圖2 PCR鑒定里氏木霉基因組中的 siRNA干擾表達(dá)盒Fig.2 PCR amplified siRNA disruption cassettes from recombinant strains M：Takara DL 2 000 DNA Marker；1～4：分別從重組菌T. reesei-cre1-T4、T. reesei-cre1-T7、T. reesei-cre1-T10和T. reesei-cre1-Neg的基因組中擴(kuò)增出來的siRNA干擾表達(dá)盒 M: Takara DL 2 000 DNA Marker；1-4：The PCR amplified siRNA disruption cassettes from recombinant strains T.reesei-cre1-T4，T.reesei-cre1-T7，T.reesei-cre1-T10 and T.reesei-cre1-Neg

2.2 干擾重組菌的纖維素酶酶活的測定

濾紙酶活代表的是纖維素酶三種酶組分，即內(nèi)切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶、β-葡聚糖苷酶協(xié)同作用后的總酶活，是菌株整個纖維素酶系酶活力水平的綜合體現(xiàn)。重組菌在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中48 h和144 h的濾紙酶活如圖3所示，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所有菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)約144 h時濾紙酶活均比48 h時高。其中，含有siRNA干擾片段的重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7和T.reesei-cre1-T10的濾紙酶活均是T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的1倍以上，而陰性對照和出發(fā)菌株的酶活力相近。

外切葡聚糖酶對纖維素鏈具有高度的專一性，而內(nèi)切葡聚糖酶的專一性較低，所以以羥甲基纖維素為底物時測得的酶活(CMCase)主要反映內(nèi)切β-1，4-葡聚糖苷酶的活力，結(jié)果見圖 4。其中，含有siRNA干擾片段的重組菌株T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7和T.reesei-cre1-T10的CMC酶活都是出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的1.8倍以上。T.reesei-cre1-T10的CMC酶活力最高可達(dá)7.2 IU/mL。出發(fā)菌株T.reeseiQM9414和陰性對照菌株T.reesei-cre4-Neg的酶活也在144 h有明顯增長趨勢，但兩者的酶活力均低于干擾重組菌。

圖3 重組菌在48 h和144 h時產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分泌 的濾紙酶活Fig.3 The FPA produced by recombinant strains in induction medium of 48 h and 144 h T. reesei-cre1-T4、T. reesei-cre1-T7和T. reesei-cre1-T10：cre1的siRNA干擾重組菌；T. reesei-cre1-Neg：干擾重組菌的陰性對照菌株；T. reesei QM9414：里氏木霉原菌。*P<0.05, **P<0.01，圖4～9同 T. reesei-cre1-T4， T. reesei-cre1-T7 and T. reesei-cre1-T10：The siRNA recombinant strain of cre1; T. reesei-cre1-Neg：The negative control of the recombinant strain; T. reesei QM9414：The starting strain. *P<0.05, **P<0.01，the same as figure 4-9

圖4 重組菌在48 h和144 h時產(chǎn)酶培養(yǎng)基中分泌的CMC酶活Fig.4 The CMCase produced by recombinant strains in induction medium of 48 h and 144 h

2.3 干擾重組菌轉(zhuǎn)錄水平的cre1和ace1相對表達(dá)量分析

對所有樣品進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，使用qPCR Software 3.2軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參基因sar1定量值校正后，分別以出發(fā)菌株T.reeseiQM9414中cre1和ace1的表達(dá)量為1，計(jì)算出培養(yǎng)48 h和144 h的干擾重組菌中cre1和ace1的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖5、圖6。

圖5 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 和144 h cre1的相對表達(dá)量Fig.5 cre1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

圖6 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h 和144 h ace1的相對表達(dá)量Fig.6 ace1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h時，干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的cre1 mRNA表達(dá)量與出發(fā)菌株T.reeseiQM9414相比，分別約為出發(fā)菌株的1.3、1.2和1.5倍。然而，在誘導(dǎo)培養(yǎng)144 h后，T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的cre1 mRNA表達(dá)量是出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的0.5、0.6和0.4倍。而含有無同源序列的陰性對照菌株T.reesei-cre1-Neg中cre1的表達(dá)量與出發(fā)菌相近，結(jié)果表明對cre1基因進(jìn)行siRNA干擾的效果明顯。ACE1 和CRE1同樣是阻遏蛋白，研究表明，ACE1是負(fù)調(diào)節(jié)因子，ace1基因的缺失會導(dǎo)致cbh1、cbh2、egl1和egl2基因的轉(zhuǎn)錄增加2～30倍，其與cre1基因的調(diào)節(jié)機(jī)制是不相關(guān)的，是相互獨(dú)立的調(diào)節(jié)機(jī)制[9]。本研究對ace1基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qPCR 驗(yàn)證，結(jié)果見圖6，結(jié)果表明對cre1的siRNA干擾沒有引起ace1的表達(dá)變化，證實(shí)了cre1的干擾表達(dá)不影響ace1的表達(dá)，纖維素酶活力變化的原因不是由于ace1基因的影響。

纖維素酶是起協(xié)同作用的多組分酶系，不僅具有內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活性，還有很高活力的木聚糖酶。cbh1是纖維二糖水解酶CBH1的編碼基因，egl1是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶EGL1的編碼基因[17]。文獻(xiàn)報(bào)道，XYR1是主要纖維素酶和半纖維素酶基因包括cbh1、cbh2、egl1、bgl1、xyn1和xyn2等轉(zhuǎn)錄所必須的激活因子[18]。作為上述基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，研究顯示xyr1自身的轉(zhuǎn)錄受到cre1和ace1的調(diào)控[17-19]。為驗(yàn)證干擾cre1是否會有效解除對纖維素酶基因或其激活因子的抑制作用，分別使用熒光定量PCR分析干擾重組菌中纖維素酶基因cbh1、egl1和木聚糖酶激活因子XRY1的相對表達(dá)量。

cbh1主要編碼纖維二糖水解酶CBH1。對干擾重組菌進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果見圖7。在誘導(dǎo)48 h時，重組菌cbh1的表達(dá)量與出發(fā)菌株相差不大，但是在誘導(dǎo)144 h后分別是同時段出發(fā)菌QM9414的1.9、2.5和2.5倍。說明cre1對激活蛋白CBH1編碼基因的轉(zhuǎn)錄具有激活作用。

egl1是內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶Egl1的編碼基因。通過熒光定量PCR手段，分析重組菌中egl1的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖8。在誘導(dǎo)144 h時，重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10中egl1的相對表達(dá)量分別是QM9414的2.7、2.5和2.9倍。由此可知，在cre1受到有效干擾的菌株中，內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶的表達(dá)可能由于解除了抑制而高效表達(dá)。說明抑制cre1的表達(dá)不僅部分解除纖維素酶合成受葡萄糖分解代謝物阻遏作用，而且激活纖維素酶中egl1基因的轉(zhuǎn)錄。

圖7 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h cbh1的相對表達(dá)量Fig.7 cbh1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

圖8 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h egl1的相對表達(dá)量Fig.8 egl1 gene relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

圖9 干擾重組菌分別誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h和 144 h xyr1的相對表達(dá)量Fig.9 Gene xyr1 relative expression level of recombinant strains after respectively inducing 48 h and 144 h

xry1是木聚糖酶激活因子XRY1的編碼基因。因此通過熒光定量PCR手段，分析重組菌中xyr1的相對表達(dá)量，結(jié)果見圖9。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h時，干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的xyr1表達(dá)量分別與原菌相差不大，但在誘導(dǎo)144 h后發(fā)現(xiàn)，此時干擾重組菌T.reesei-cre1-T4、T.reesei-cre1-T7、T.reesei-cre1-T10的xyr1相對表達(dá)量分別是同時期T.reeseiQM9414中xyr1基因表達(dá)量的2.4、2.7和2.8倍，陰性對照菌株和T.reesei-cre1-Neg和出發(fā)菌株中xyr1表達(dá)量均變化不大。這說明xyr1基因在干擾cre1基因的轉(zhuǎn)錄后獲得高效轉(zhuǎn)錄。

3 討 論

里氏木霉是工業(yè)生產(chǎn)纖維素酶的重要菌種。由于其存在的“碳抑制效應(yīng)”，所以在碳源豐富的條件下，纖維素酶的合成受到分解代謝阻遏物的抑制[20-21]。為提高里氏木霉中纖維素酶的產(chǎn)量，需要從纖維素酶表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)入手進(jìn)行研究。至今對里氏木霉纖維素酶表達(dá)機(jī)制的研究尚不深入。本研究就里氏木霉碳阻遏抑制因子cre1對里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的影響進(jìn)行了研究。目前使用siRNA對里氏木霉進(jìn)行干擾研究的報(bào)道較少，一些基因如果直接被敲除會引發(fā)一系列的反應(yīng)甚至致死[22]，而通過RNA干擾技術(shù)則可以降低基因表達(dá)量的同時避免這些問題。本研究構(gòu)建siRNA干擾載體，使用特異性小片段連接組成型啟動子和終止子，不受誘導(dǎo)物的影響，可高效穩(wěn)定地表達(dá)干擾基因，直接合成的小片段還可以隨時更換為其他基因，為里氏木霉其他基因甚至多基因的干擾研究提供極大的便利。該載體還包含潮霉素B抗性基因，而且原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程中省略了包含潮霉素B抗性基因的載體pAN7-1的提取和共轉(zhuǎn)化步驟，不僅大大減少了工作量，并可提高轉(zhuǎn)化效率。

通過表達(dá)siRNA干擾載體，實(shí)現(xiàn)了對cre1基因的干擾抑制，而其他阻遏因子ace1的基因表達(dá)則不受影響。兩種酶活性測定的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入不同干擾片段重組菌中的濾紙酶活和CMC酶活均高于出發(fā)菌株T.reeseiQM9414的酶活性水平，說明酶活性的提高與干擾cre1有關(guān)，酶活性提高的原因可能是由于cre1的干擾導(dǎo)致分解代謝阻遏總體效應(yīng)的下降，從而解除了阻遏物對纖維素酶基因合成的抑制，菌株在短期內(nèi)大量分泌纖維素酶。酶活性從一定程度上證明了通過RNA干擾cre1基因，降低了cre1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步對纖維素酶基因cbh1、egl1及木聚糖酶激活因子XYR1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了熒光定量PCR檢測，結(jié)果顯示，與出發(fā)菌相比，cre1干擾重組菌中的cbh1、egl1和xyr1的表達(dá)均有明顯提高，說明干擾cre1可以解除阻遏物對部分纖維素酶基因表達(dá)的抑制，解除cre1的抑制對纖維素酶及其相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控都具有重要意義。

本研究通過纖維素酶酶活和mRNA水平等分析，進(jìn)一步確定了沉默cre1基因可提高里氏木霉中相關(guān)纖維素酶的產(chǎn)量。從而也證實(shí)了通過組成型siRNA干擾載體可以對里氏木霉進(jìn)行方便、高效和快捷的基因調(diào)控，為進(jìn)一步對里氏木霉多靶向基因調(diào)控等提供參考。

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