周明輝, 顧有方

(1.合肥師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院,安徽 合肥 230039;2.安徽科技學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,安徽 鳳陽 233100)

隨著生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展，對(duì)生命現(xiàn)象和疾病機(jī)理的探討已深入到細(xì)胞和分子水平，而自由基則扮演相當(dāng)重要的角色[1]。機(jī)體在正常情況下，體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持著動(dòng)態(tài)平衡，這種平衡能夠保護(hù)身體免受細(xì)菌、病毒等有害物質(zhì)侵害[2-3]。但在某些情況下，如感染了某些病毒或者是機(jī)體的某些功能發(fā)生了紊亂，從而打破了這種動(dòng)態(tài)平衡，使自由基的產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出清除的水平，自由基在體內(nèi)越積越多，引起了多種細(xì)胞成分發(fā)生改變，甚至使細(xì)胞受到損傷；并且攻擊細(xì)胞，促使蛋白質(zhì)、核苷酸、脂肪的代謝異常，細(xì)胞產(chǎn)生突變而引起疾病[4-5]。為了維持這種動(dòng)態(tài)平衡，細(xì)胞內(nèi)存在有防止生物分子氧化損傷的抗氧化劑和抗氧化酶以及修復(fù)系統(tǒng)，而其中清除過量自由基主要依靠抗氧化酶系統(tǒng)[6]?？寡趸赶到y(tǒng)主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，這些酶不但協(xié)同防止自由基損傷效應(yīng)而且相互間起著保護(hù)作用[7-8]。此外自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而引起組織損傷，該損傷主要是通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的[9-10]。因此研究機(jī)體抗氧化損傷程度可以通過檢測(cè)血液及組織中的各類抗氧化酶活性與丙二醛(MDA)含量來衡量。近年來副粘病毒屬廣泛傳播，并且能在禽類中發(fā)生流行，國內(nèi)外對(duì)此病的研究主要在雞病方面，但近年來，鴨、鵝源副粘病毒的感染也有了報(bào)道[11-13]。因此，本研究通過檢測(cè)雛鴨在感染異源副粘病毒后血液中SOD、CAT、GSH-Px活性及MDA含量的變化，研究異源副粘病毒感染后雛鴨機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性是否存在差異，以及脂質(zhì)過氧化程度與抗氧化酶活性變化的相關(guān)性，為禽類感染副粘病毒的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 雞源、鵝源和鴨源副粘病毒毒株，由安徽科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，均為復(fù)壯的SPF雞胚絨尿液。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理 1日齡雛鴨200只，購自某孵化場(chǎng)，雛鴨飼養(yǎng)于徹底消毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房內(nèi)。雛鴨入舍后立即給予高錳酸鉀溶液飲水，并用百毒殺溶液噴霧消毒，7 h后給予飲用糖鹽水，并開食，雛鴨入舍后8 h頸部皮下注射抗鴨病毒性肝炎高免血清。

1.1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法 SOD：黃嘌呤氧化酶法；CAT：鉬酸銨法；MDA：硫代巴比妥酸比色法；GSH-Px：DTNB法；蛋白質(zhì):考馬斯亮蘭法。以上所用試劑均由南京建成生物研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇飼養(yǎng)20日齡健康雛鴨100只，隨機(jī)分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四組，每組數(shù)目相等，均為25只。第Ⅰ組為對(duì)照組，第Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組分別為雞新城疫病毒、鵝源副粘病毒、鴨源副粘病毒攻毒組。雛鴨至21日齡時(shí)，將病毒雞胚尿囊液用滅菌的生理鹽水按1∶5稀釋，按0.5 mL/只皮下注射各攻毒組的雛鴨，對(duì)照組的雛鴨用等量滅菌的生理鹽水進(jìn)行皮下注射。攻毒后7、14、21、28 d隨機(jī)抽?、?、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組雛鴨各5只進(jìn)行靜脈放血，采集血液，2000 r/min離心分離血清，-30 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抗氧化酶活性與MDA含量檢測(cè) 對(duì)所選雛鴨攻毒后的28 d，以7 d為1個(gè)周期，檢測(cè)對(duì)照組與3組不同來源的副粘病毒感染的血清中SOD、CAT、GSH-Px及MDA的活性與含量，同時(shí)以4 d為一個(gè)周期檢測(cè)雛鴨機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性與脂質(zhì)過氧化標(biāo)志物MDA的變化趨勢(shì)。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS軟件對(duì)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四組血清中抗氧化酶活性與MDA含量的差異性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 異源副粘病毒接種對(duì)雛鴨血清SOD活性影響

由表1可知，攻毒后7 d時(shí)，各組雛鴨血清中SOD活性均無顯著性差異(P>0.05)，攻毒后14、21、28 d時(shí)，鴨源副粘病毒、雞源副粘病毒、鵝源副粘病毒與試驗(yàn)對(duì)照組的SOD分別存在極顯著差異(P<0.01)、顯著差異(P<0.05)、極顯著差異(P<0.01)，且攻毒組之間SOD也存在著不同程度的差異。

表1 異源副粘病毒對(duì)雛鴨血清SOD活性影響

注：同一列中小寫字母不同表示顯著差異(P<0.05)，大寫字母不同表示極顯著差異(P<0.01),下表同

2.2 異源副粘病毒接種對(duì)雛鴨血清CAT活性影響

由表2可知，攻毒后7 d時(shí)，試驗(yàn)對(duì)照組與各攻毒組血清CAT活性均有極顯著差異(P<0.01)，攻毒后14 d時(shí)，鴨源副粘病毒、鵝源副粘病毒與試驗(yàn)對(duì)照組的CAT存在極顯著差異(P<0.01)，攻毒后21 d時(shí)血清CAT活性均無顯著性差異(P>0.05)，攻毒后28 d時(shí)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)一無效值，無法比較。

2.3 異源副粘病毒接種對(duì)雛鴨血清MDA含量影響

由表3可知，攻毒后7、14、28 d時(shí)，血清MDA含量均無顯著性差異(P>0.05)，21 d時(shí)，對(duì)照組與鴨源副粘病毒血清MDA含量存在顯著差異(P<0.05)，攻毒14 d時(shí)，攻毒組的MDA含量要明顯高于對(duì)照組，至21 d時(shí)又顯著下降。

表2 異源副粘病毒對(duì)雛鴨血清CAT活性影響

注：“-”代表無效值

表3 異源副粘病毒對(duì)雛鴨血清MDA活性影響

2.4 異源副粘病毒接種對(duì)雛鴨血清GSH-Px活性影響

由表4可知，攻毒后7、28 d時(shí)血清的GSH-Px活力均無顯著性差異(P>0.05)，攻毒后14 d時(shí)，對(duì)照組與鴨源副粘病毒血清GSH-Px含量存在顯著差異(P<0.05)，攻毒后21 d時(shí)，對(duì)照組與各攻毒組均存在顯著差異(P<0.05)。

表4 異源副粘病毒對(duì)雛鴨血清GSH-Px活性影響

2.5 病毒感染后雛鴨血清中抗氧化酶活性與脂質(zhì)過氧化程度變化趨勢(shì)

在攻毒后的28 d中，每隔4 d檢測(cè)雛鴨血清中抗氧化酶活性與MDA含量，以確定它們的變化趨勢(shì)及相互關(guān)系，結(jié)果見圖1。由圖1可知，攻毒后12 d中，雛鴨血清中MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而SOD與GSH-Px的活性呈下降趨勢(shì)，在12～20 d時(shí)，MDA含量明顯下降，而SOD與GSH-Px呈明顯上升趨勢(shì)，最終達(dá)到一個(gè)平衡的狀態(tài)，而CAT的活性與MDA含量變化趨勢(shì)基本一致。

圖1 雛鴨血清中抗氧化酶活性與MDA含量變化Fig.1 Antioxidant enzyme activity and MDA content in serum wrinkle duck

3 討 論

自由基是一些具有不配對(duì)電子的分子、原子、離子或原子團(tuán)，如·O2-、HO·、H2O2、 ONOO-、NO·等，在機(jī)體內(nèi)具有較強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，如不能及時(shí)清除會(huì)引起機(jī)體的損傷[14]。病毒感染機(jī)體后，由于發(fā)生氧化應(yīng)激，會(huì)有大量活性氧自由基(ROS)產(chǎn)生，從而引起抗氧化系統(tǒng)的變化[15]。本研究結(jié)果表明，在攻毒初期，對(duì)照組與各攻毒組中的SOD、MDA、GSH-Px活力差異均不顯著；對(duì)照組和各攻毒組之間CAT均存在極顯著差異，而各攻毒組之間的CAT活力差異均不顯著；這說明在雛鴨攻毒初期對(duì)CAT的活力影響較大，同時(shí)也間接反映了異源的副粘病毒對(duì)自由基的代謝產(chǎn)生了不同的影響，而其他三種物質(zhì)活性與含量的差異不顯著，可能與病毒感染初期機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)沒有得到激發(fā)有關(guān)。雛鴨接種病毒后，機(jī)體受到病毒的影響逐漸增加，異源副粘病毒也對(duì)各氧化物的活力產(chǎn)生不同的影響，同時(shí)各攻毒組之間的差異也有增加的趨勢(shì)，而MDA的活力在各組之間并沒有產(chǎn)生顯著差異，或許與其自身的性質(zhì)有關(guān)，如對(duì)病毒的感染不敏感等，需要進(jìn)一步研究。攻毒后的28 d，機(jī)體可能產(chǎn)生了與之相應(yīng)的免疫抗體，從而阻止了病毒對(duì)自由基代謝的繼續(xù)影響。因此，異源副粘病毒對(duì)機(jī)體的抗氧化物的活力產(chǎn)生了明顯的影響，且來源不同的病毒組之間也存在差異，而同屬的鵝源與鴨源的副粘病毒對(duì)雛鴨的敏感性要強(qiáng)于雞源的副粘病毒，這可能與病毒擴(kuò)增的載體是雞胚有關(guān)[16]。由于異源副粘病毒感染導(dǎo)致雛鴨機(jī)體內(nèi)抗氧化物活性的差異，也會(huì)引起自由基代謝程度的不同。 通過對(duì)感染副粘病毒雛鴨血清中SOD、CAT、GSH-Px活性與MDA含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在感染后初期機(jī)體受到病毒感染，體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多，MDA含量增高，而抗氧化系統(tǒng)未被有效激發(fā)，隨著感染后時(shí)間延長，機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)，抗氧化酶活性增高，清除體內(nèi)過多的自由基，MDA含量明顯減少，通過圖1曲線變化趨勢(shì)發(fā)現(xiàn)，此過程中降低的MDA主要由SOD、GSH-Px活性升高所致，而CAT對(duì)MDA含量變化作用不明顯，因此抗氧化系統(tǒng)對(duì)由于病毒感染引起自由基的清除效應(yīng)具有一定的滯后性。

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