鄧 超, 周振宇, 張家傲, 徐夢婷, 張陳齊, 卜 寧

(沈陽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034)

多環(huán)芳烴(Polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一類含有兩個或兩個以上苯環(huán)或雜環(huán)的有機(jī)化學(xué)污染物[1-2]，廣泛分布于空氣、水體、土壤以及植物等環(huán)境中，許多PAHs具有持久性、生物積累性以及高生物毒性等特點(diǎn)，可致畸、致癌和致突變，對人類健康和生態(tài)環(huán)境造成巨大危害[3]。芘是高分子量PAHs的典型代表，具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)和不易降解性，是檢測環(huán)境PAHs污染的指示物[4-5]。微生物種類多樣且代謝速率高效，是修復(fù)治理環(huán)境PAHs等有機(jī)污染物的有效途徑之一[6]。已有的研究表明，許多細(xì)菌、真菌等對PAHs都具有降解作用[7]，目前已分離出的PAHs降解菌主要包括假單胞菌屬(Pseudomonas)[8]、紅球菌屬(Rhodococcus)[9]、氣單胞菌屬 (Aeromonas)[10]、 芽胞桿菌屬(Bacillus)[11]、伯克氏菌屬(Burkholderia)[12]和分支桿菌屬 (Mycobacterium)[13]等。相對于細(xì)菌來說，真菌降解PAHs的效率雖然通常高于細(xì)菌，在降解高環(huán)PAHs方面表現(xiàn)突出，但種類并不多，特別是有關(guān)芘降解的酵母菌方面的研究較少。本研究以分離得到的酵母菌為研究對象，探究其對芘的降解情況，為其在環(huán)境修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 污染土壤樣品 供試土樣采自沈撫污灌渠三寶屯區(qū)段的污灌底泥。隨機(jī)選取5個采樣點(diǎn)，用抓斗式采泥器分別采集灌渠底泥，將采集的5份土樣混勻、分裝，于無菌紙袋中4 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.02，KH2PO41.0，NH4NO31.0，F(xiàn)eCl30.05， pH 6.0；含芘母液：稱取芘溶于甲醇溶液中，搖勻使其終濃度為1 g/L；芘無機(jī)鹽培養(yǎng)基：將用0.22 μm濾膜除菌的含芘母液置于無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：牛肉膏 3，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂 20，pH 6.0；PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200，蔗糖 20，瓊脂 20，pH自然；PDB培養(yǎng)基：馬鈴薯 200，蔗糖 20，pH自然。

1.1.3 主要試劑 芘，純度98%，Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 污染土壤懸液的制備 將供試土壤樣品1 g加入裝有玻璃珠并含有99 mL無菌水的250 mL錐形瓶中，25 ℃、175 r/min振蕩2 h制成土壤懸液，待靜止沉淀2 h后，取上清液作為菌源。

1.2.2 芘降解菌的富集、分離純化 將制備的菌源接入到50 mL以芘為唯一碳源的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，芘初始質(zhì)量濃度為50 mg/L，25 ℃、175 r/min富集培養(yǎng)7 d，取第一次富集培養(yǎng)液以10%體積比轉(zhuǎn)接到新的含芘無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行第二次富集培養(yǎng)，如此反復(fù)4次，每轉(zhuǎn)接1次，芘質(zhì)量濃度依次調(diào)整為50、100、150、200、300 mg/L。將經(jīng)5次富集后的培養(yǎng)液稀釋并分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)，挑取不同菌落形態(tài)的單菌落，采用平板劃線法進(jìn)行分離純化。將分離純化的菌株分別轉(zhuǎn)接于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)后于4 ℃冰箱保存、備用。

1.2.3 HXY-5菌株的鑒定 ①HXY-5菌株的形態(tài)學(xué)鑒定：a.細(xì)胞個體形態(tài)觀察：光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞個體形態(tài)。b.菌落形態(tài)觀察：將篩選出的HXY-5菌種接種于50 mL的PDB培養(yǎng)基中25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)，活化24 h。接種活化后的HXY-5菌株于PDA培養(yǎng)基中涂布，25 ℃倒置培養(yǎng)數(shù)天，觀察菌落形態(tài)。②HXY-5菌株的分子生物學(xué)鑒定：用真菌基因組快速提取試劑盒提取HXY-5菌株的基因組DNA。以菌株HXY-5的基因組為模板，以18S-ITS1和18S-ITS4為引物，采用20 μL PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行同源性序列分析與比對。根據(jù)測序結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 HXY-5菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化 ①不同培養(yǎng)時間對菌株生長的影響：將1 mL活化后的菌液，分別加入到含有50 mL PDB培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)，間隔4 h取出一組，0～40 h共11組。每組做3個平行。②初始 pH對菌株生長的影響：將1 mL活化后的菌液，分別加入到含有50 mL PDB培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，PDB培養(yǎng)基的初始pH為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)24 h，每組3個平行。③不同碳、氮源對菌株生長的影響：在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別加入2%的葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，以不加碳源為對照，接種0.5 mL HXY-5菌株母液，25 ℃、175 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌體濃度，每組處理設(shè)3個重復(fù)，以篩選最佳碳源；用相同方法在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中加入2%的牛肉膏、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸鈉為供試氮源，以不加氮源的培養(yǎng)基為對照，篩選最佳氮源。④正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)：以最佳碳源(蔗糖和甘露醇)、最佳氮源(酵母浸粉)、MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4和FeCl3七個因素設(shè)計(jì)7因素4水平正交試驗(yàn)，測定HXY-5菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.5 HXY-5菌株對芘降解的研究 ①芘標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：取0.1 g芘溶于甲醇中，定容至100 mL，利用分光光度計(jì)在270～600 nm范圍內(nèi)測定芘標(biāo)準(zhǔn)溶液的最高吸收峰。取0.2 g芘溶于甲醇中，定容至250 mL，再取配制好的溶液分別稀釋2、4、8倍，配制濃度分別為0.8、0.4、0.2、0.1 mg/mL，在紫外分光光度計(jì)下測定其OD600值[14]。②不同芘濃度對 HXY-5菌株降解芘的影響：將1 mL活化后的菌液，分別加入到含有50 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，其初始芘濃度分別為0、50、100、200、400 mg/L，25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)15 d。每組3個平行，以空白培養(yǎng)基對為照。③不同培養(yǎng)時間對 HXY菌株降解芘的影響：將1 mL活化后的菌液，加入芘濃度為100 mg/L的含有50 mL無機(jī)鹽培養(yǎng)基的100 mL錐形瓶中，25 ℃、175 r/min搖床培養(yǎng)15 d，分別于第3、6、9、12和15天取出3瓶，用紫外分光光度計(jì)測定芘的濃度[8]。每組3個平行，以空白培養(yǎng)基為對照。

芘降解計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 HXY-5菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

HXY-5細(xì)胞形態(tài)見圖1。由圖1可見，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞內(nèi)可見明顯的大液泡，細(xì)胞大小(1.0～4.7)μm×(0.8～4.0)μm，可出芽生殖。HXY-5菌落形態(tài)見圖2。由圖2可見，HXY-5菌株在PDA平板培養(yǎng)基上的菌落呈乳白色，不透明，菌落邊緣整齊，表面光滑較粘稠，易挑取，菌落正反面顏色相同。

圖1 HXY-5菌株的細(xì)胞形態(tài)Fig.1 Cell morphology of HXY-5 strain

圖2 HXY-5菌落形態(tài)Fig.2 HXY-5 colonies morphology

2.2 HXY-5菌株的分子生物學(xué)鑒定

HXY-5菌株的18S rDNA序列經(jīng)BLAST對比，可鑒定該菌株為間型假絲酵母(Candidaintermedia)，基因同源性相似度達(dá)99%。MEGA6.0構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖3。

2.3 HXY-5菌株培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 不同培養(yǎng)時間對菌株生長的影響 由圖4可知，0～24 h內(nèi)OD600值隨培養(yǎng)時間的增加而加大，菌數(shù)呈指數(shù)增長，在24 h時達(dá)到最大；24 h以后，OD600值隨培養(yǎng)時間的增加而減少，菌數(shù)不再增加，整個群體生長進(jìn)入穩(wěn)定期、衰亡期。

2.3.2 初始 pH對菌株生長的影響 由圖5可知，pH為3.0～6.0時，菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而加大，菌數(shù)呈指數(shù)增長，pH為6.0時達(dá)到最大；pH 6.0～9.0時，菌體數(shù)量隨著初始pH的增大而減少。

2.3.3 不同碳、氮源對HXY-5菌株生長的影響 由于酵母菌菌體較大，故采取光電比濁法計(jì)算該菌株的濃度。從圖6、7中數(shù)據(jù)可以看出，該菌株在以蔗糖或甘露醇為碳源時生長情況相似，酵母浸粉為氮源時生長情況最好。

2.3.4 HXY-5菌株培養(yǎng)基優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蔗糖、甘露醇為碳源，酵母浸粉為氮源，同時選取MgSO4·7H2O、CaCl2、KH2PO4、FeCl3設(shè)計(jì)7因素4水平正交試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

圖3 基于18S rDNA序列構(gòu)建的HXY-5系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 HXY-5 phylogenetic tree based on 18S rDNA sequences

試驗(yàn)號蔗糖/(g·L-1)甘露醇/(g·L-1)酵母浸粉/(g·L-1)MgSO4·7H2O/(g·L-1)CaCl2/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)FeCl3/(g·L-1)OD60011040100.02200.7392102000.250.0210.10.55530100.500.0420.050.9294401000.250.01200.524520100.510.0100.10.9816402000.500.50.050.58971000.50.5020.11.1968040010.0110.050.54494010200.020.50.0251.133

續(xù)表2

根據(jù)R值大小可得各因素作用的主次順序?yàn)榈?酵母浸粉)>無機(jī)鹽(硫酸鎂)>無機(jī)鹽(氯化鈣)>碳源(蔗糖)>碳源(甘露醇)>無機(jī)鹽(磷酸二氫鉀)>無機(jī)鹽(三氯化鐵)。由上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基正交試驗(yàn)結(jié)果中的各列K值可知：碳源蔗糖的最適濃度為20 g/L，碳源甘露醇的最適濃度為20 g/L，氮源酵母浸粉的最適濃度為2 g/L,硫酸鎂的最適濃度為0.5 g/L,氯化鈣的最適濃度為0.01 g/L，磷酸二氫鉀的最適濃度為0.5 g/L，三氯化鐵的最適濃度為0.025 g/L。

由測定結(jié)果可知，HXY-5菌株最佳培養(yǎng)基的配方(g/L)：蔗糖20， 酵母浸粉2， MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.01，KH2PO40.5。

2.4 HXY-5菌株對芘的降解作用

2.4.1 芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線 用1.0、2.0、3.0 mg/L的芘標(biāo)準(zhǔn)溶液測定紫外吸收光譜，得到芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在320 nm處有最高吸收峰。在波長320 nm處測得芘標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1～0.8 mg/L 的范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，見圖8。

圖4 HXY-5菌株生長曲線Fig.4 HXY-5 strain growth curve

圖5 初始pH對HXY-5菌株生長的影響Fig.5 Effect of initial pH on the growth of HXY-5 strain

圖6 不同碳源對HXY-5菌株生長的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on the growth of HXY-5 strain

圖7 不同氮源對HXY-5菌株生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on the growth of HXY-5 strain

圖8 芘的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.8 Standard curve of pyrene

2.4.2 HXY-5菌株對芘的降解 HXY-5菌株在芘濃度為0～400 mg/L時的生長狀況見圖9。由圖9可知，當(dāng)芘濃度為100 mg/L時，菌株的生長情況最好，芘在第3、6、9、12、15天降解率分別為8%、20%、32%、46%和63%。

圖9 不同芘濃度對HXY-5菌株生長的影響Fig.9 Effect of pyrene concentration on the growth of HXY-5 strain

3 討 論

從被石油嚴(yán)重污染的污灌渠底泥中分離得到芘降解菌HXY-5，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其為間型假絲酵母(Candidaintermedia)。該菌株的優(yōu)化培養(yǎng)條件為蔗糖20 g，酵母浸粉2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.01 g，KH2PO40.5 g，初始pH 6.0， 25 ℃培養(yǎng)24 h。在芘濃度為100 mg/L時，該菌株對芘的降解效果明顯，培養(yǎng)15 d時芘降解率可達(dá)63%。

對HXY-5酵母菌的光學(xué)顯微鏡觀察顯示，其細(xì)胞內(nèi)具較大液泡，但其液泡內(nèi)卻具有一可見的桿狀物質(zhì)，且在活體細(xì)胞內(nèi)呈較活躍的運(yùn)動狀，其對低濃度美藍(lán)的著色情況與活體酵母菌相同。該桿狀物是否與芘的降解有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

利用微生物修復(fù)自然環(huán)境中PAHs污染是污染治理的關(guān)鍵，因其具有費(fèi)用低、二次污染少、修復(fù)徹底等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為較高效、安全的生物修復(fù)技術(shù)[15-17]。本研究從HXY-5菌株生長條件入手，探究了HXY-5菌株對芘的降解作用。研究表明，該菌株對芘的降解效果良好。對HXY-5菌株的研究，有利于進(jìn)一步探究該菌株的生物學(xué)價值，探究該菌株在石油污染環(huán)境下生存的意義，并為治理芘污染提供高效、低消耗的可能。

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