凌春燕 綜述，王 琳 審校

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院腎病科 200032)

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)溶酶體依賴性蛋白降解的過(guò)程，自噬在饑餓、缺氧、缺血/再灌注、感染等條件下可以被激活，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)能量代謝。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的主要成分，其結(jié)構(gòu)和功能的完整性決定著腎小球?yàn)V過(guò)功能的完整性。因足細(xì)胞是高度分化的終末期細(xì)胞，當(dāng)其丟失超過(guò)40%時(shí)，球囊粘連明顯增加，導(dǎo)致腎小球硬化增加，產(chǎn)生持續(xù)大量蛋白尿，乃至腎功能異常[1]。各種病理改變導(dǎo)致足細(xì)胞受損會(huì)使其從腎小球基底膜(GBM)脫落，造成濾過(guò)屏障完整性受損，最終導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生。本文就足細(xì)胞在生理和病理情況下，自噬對(duì)其的作用及在腎臟疾病中發(fā)揮何種效應(yīng)進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞自噬(autophagy)

細(xì)胞自噬依據(jù)其分子機(jī)制、溶酶體攝入底物的方式等不同分為巨自噬、小自噬和分子伴侶介導(dǎo)自噬，目前通常說(shuō)的“自噬”是指巨自噬，細(xì)胞自噬主要分為以下步驟：細(xì)胞接受自噬誘導(dǎo)信號(hào)，在細(xì)胞質(zhì)某處形成吞噬泡(phagophores)；吞噬泡不斷延伸，將細(xì)胞質(zhì)中的任何成分包括細(xì)胞器全部納入，形成密封的、球形自噬體(autophagosome)；自噬體形成后與溶酶體融合形成自體溶酶體(autolysosome)；自噬體的內(nèi)膜被降解，二者的內(nèi)容物合為一體，自噬體中的“貨物”被降解，產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸等被輸送到細(xì)胞質(zhì)中，供細(xì)胞重新利用[2]。

2 自噬相關(guān)信號(hào)通路

2.1哺乳動(dòng)物雷帕霉素蛋白靶蛋白(mTOR)相關(guān)信號(hào)通路 mTOR是細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的關(guān)鍵，mTOR激活抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生。細(xì)胞中缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(如生長(zhǎng)因子或氨基酸等)時(shí)，可通過(guò)抑制mTOR的表達(dá)，其后不僅可以激活Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(Class Ⅲ PI3K)和UNC-51樣激酶1(ULK1)，還可以抑制核糖體蛋白亞基6激酶(S6K1)活性，激活細(xì)胞自噬[3]。mTORC1(與自噬相關(guān))活性受到細(xì)胞對(duì)氨基酸攝入水平的影響，受尿苷三磷酸酶(GTPases)和有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)3介導(dǎo)[4]。細(xì)胞在缺乏能量時(shí)ATP/AMP比值降低，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)依賴AMP活化蛋白激酶(AMPK)的自噬過(guò)程來(lái)獲得能量[5]。

2.2PI3K/蛋白質(zhì)激酶B(AKT)信號(hào)通路 PI3K是真核生物體內(nèi)重要的信號(hào)分子。20世紀(jì)80年代，發(fā)現(xiàn)Ⅲ型PI3K分子抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)能抑制自噬[6]。AKT是PI3K/AKT信號(hào)通路的核心。正常生理?xiàng)l件下，絡(luò)氨酸激酶受體被細(xì)胞外及細(xì)胞內(nèi)因子活化，進(jìn)而激活PI3K，活化的PI3K將底物磷脂酰肌醇2磷酸(PIP2)轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇3磷酸(PIP3)，使PIP3與磷酸肌醇依賴的激酶-1(PDK-1)協(xié)同完全激活A(yù)KT，繼而信號(hào)傳至mTOR，活化后的mTOR激活下游相關(guān)因子，抑制細(xì)胞自噬[7]。

2.3活性氧(ROS)信號(hào)通路 研究發(fā)現(xiàn)ROS參與細(xì)胞自噬的發(fā)生[8]。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)缺陷時(shí)，大量ROS在線粒體蓄積，引起線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致線粒體功能異常，進(jìn)而激活自噬。ROS還可上調(diào)Atg4產(chǎn)生Atg8-磷脂酰胺(PE)復(fù)合體，促進(jìn)復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)累積，最終促進(jìn)細(xì)胞自噬[5]。

2.4c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路 JNK是一種p54微管相關(guān)蛋白激酶，主要通過(guò)以下機(jī)制調(diào)節(jié)自噬：(1)通過(guò)磷酸化Bcl-2/Bcl-XL解離Beclin-1-Bcl-2/Bcl-XL復(fù)合體釋放Beclin-1；(2)通過(guò)介導(dǎo)Bcl-2的磷酸化阻礙Bcl-2/Bcl-XL與Beclin-1形成復(fù)合體[9]。

3 足細(xì)胞自噬及其在慢性腎臟病中的作用

有研究發(fā)現(xiàn)腎臟中的足細(xì)胞內(nèi)自噬水平比其他細(xì)胞高，足細(xì)胞依賴自噬反應(yīng)維持自身內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[10]。有基礎(chǔ)研究檢測(cè)到正常足細(xì)胞內(nèi)存在自噬泡，氯喹通過(guò)時(shí)間依賴方式增加自噬標(biāo)志蛋白——微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ型的表達(dá)，說(shuō)明足細(xì)胞自噬的高活性；該研究通過(guò)內(nèi)毒素(LPS)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，降低足細(xì)胞podocin、LC3Ⅱ和Beclin-1表達(dá)，使自噬體數(shù)量減少；而雷帕霉素(RAPA)可逆轉(zhuǎn)LC3Ⅱ和podocin低表達(dá)，3-MA可加重LPS的損傷作用[11]。HARTLEBEN等[12]通過(guò)觀察特異性敲除足細(xì)胞內(nèi)ATG5基因的小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠足細(xì)胞喪失自噬能力后增加了其患腎病的風(fēng)險(xiǎn)，表明細(xì)胞自噬不僅能在正常情況下維持足細(xì)胞的自穩(wěn)狀態(tài)，而且也是應(yīng)激條件下足細(xì)胞內(nèi)自我保護(hù)的有效機(jī)制。

3.1糖尿病腎病(DN)中足細(xì)胞自噬情況 DN小鼠腎小球中發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞和自噬體數(shù)量明顯減少、LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯下降，腹腔注射RAPA后，LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高，自噬功能恢復(fù)，蛋白尿減少[13]。高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，在高糖作用72 h時(shí)足細(xì)胞損傷加重，細(xì)胞活性受抑制，自噬功能受抑制。p62/SQSM1基因敲除后，能明顯改善足細(xì)胞受損情況，緩解胰島素抵抗，說(shuō)明足細(xì)胞自噬功能受抑制可能參與了DN的發(fā)病機(jī)制[14]。AUDZEYENKA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞自噬水平下調(diào)，可能與其對(duì)胰島素敏感性降低有關(guān)。DN患者常存在脂質(zhì)代謝紊亂，棕櫚酸(PA)能明顯增加足細(xì)胞中ROS產(chǎn)生，降低足細(xì)胞線粒體膜電位，增加足細(xì)胞凋亡，氯喹干預(yù)加重足細(xì)胞的凋亡，RAPA能有效抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的ROS增多及細(xì)胞凋亡[16]。HUANG等[17]用高糖誘導(dǎo)人足細(xì)胞損傷，發(fā)現(xiàn)中藥三七提取物——三七皂苷R1能通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR通路恢復(fù)足細(xì)胞自噬功能，從而減少足細(xì)胞凋亡。上述研究表明，DN中存在足細(xì)胞自噬低表達(dá)情況，但具體分子機(jī)制尚不明確，可能與PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)[18]，也可能與腎臟衰老、氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)及胰島素抵抗有關(guān)[14-15,19]，改善足細(xì)胞自噬功能可能是延緩DN進(jìn)展新的治療靶點(diǎn)。

3.2IgA腎病(IgAN)中足細(xì)胞自噬情況 有研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者腎組織中足細(xì)胞自噬體的數(shù)量明顯減少[20]，該研究納入了35例病理確診為IgAN的患者，病理分期都在LeeⅡ級(jí)以上，透過(guò)光鏡和透射電鏡觀察足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和自噬體的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，IgAN患者的足細(xì)胞自噬體明顯減少，且隨病理分期級(jí)別的增加，其自噬體的數(shù)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，LeeⅣ級(jí)的患者腎組織中足細(xì)胞自噬體明顯較LeeⅡ級(jí)患者增多。LIANG等[21]進(jìn)一步從IgAN患者和健康者血清中分離出IgA1用來(lái)體外培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞48 h，制備IgA1-系膜細(xì)胞上清液，用該上清液培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞(MPC5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用IgAN患者IgA1-系膜細(xì)胞上清液培養(yǎng)的足細(xì)胞，其表達(dá)LC3 Ⅱ和CD63較健康者降低，p62蛋白累積，電子顯微鏡顯示其比健康者IgA1-系膜細(xì)胞上清液干預(yù)的足細(xì)胞自噬體明顯減少，凋亡蛋白caspase-3表達(dá)增加，足細(xì)胞凋亡增加。運(yùn)用RAPA與IgA1-系膜細(xì)胞上清液共培養(yǎng)足細(xì)胞，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值增加30%，p62蛋白積累下降近50%，每個(gè)足細(xì)胞自噬體數(shù)量增加到單純用IgA1-細(xì)胞細(xì)胞上清液干預(yù)的近7倍，凋亡率也從19.88%下降到16.78%，caspase-3蛋白表達(dá)降低。RAPA作為mTOR信號(hào)通路的抑制劑，自噬通路的激活劑，能通過(guò)上調(diào)足細(xì)胞自噬功能起到保護(hù)IgAN患者足細(xì)胞的作用，為IgAN的治療提供了新靶點(diǎn)。

3.3膜性腎病(MN)中足細(xì)胞自噬情況 足細(xì)胞自噬功能異常同樣參與了MN的發(fā)病機(jī)制。LIANG等[22]通過(guò)35例IgAN和26例特發(fā)性MN(IMN)患者足細(xì)胞自噬體的電鏡檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腎病患者足細(xì)胞自噬體數(shù)量都明顯少于健康對(duì)照組(0～5個(gè)自噬體/足細(xì)胞)，兩種腎病類型之間自噬體數(shù)量無(wú)差異。根據(jù)患者腎小球?yàn)V過(guò)率(eGFR)情況，分為eGFR≥60 mL/min和eGFR<60 mL/min兩組，eGFR低的自噬體數(shù)比eGFR高的多。JIN等[23]研究納入15例健康者、41例MN患者包括26例IMN(Ⅰ期14例、Ⅱ期12例)和15例繼發(fā)性膜性腎病(SMN)，結(jié)果提示MN發(fā)病機(jī)制中可能存在足細(xì)胞自噬體減少的情況，這一現(xiàn)象隨著病理分期從Ⅰ期到Ⅱ期呈現(xiàn)加重趨勢(shì)。呂倩影等[24]通過(guò)亞溶破C5b-9誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷，結(jié)果表明抑制自噬可以明顯加重C5b-9誘導(dǎo)的足細(xì)胞形態(tài)異常，包括nephrin表達(dá)的進(jìn)一步減少和分布異常，并且增加足細(xì)胞的凋亡。

早期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IMN經(jīng)典被動(dòng)Heyamnn腎炎大鼠發(fā)病機(jī)制中同時(shí)存在ERS激活和足細(xì)胞自噬功能活化現(xiàn)象，造模第14、21天，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，LC3沿著腎小球毛細(xì)血管袢高表達(dá)，并隨著時(shí)間的增加，其表達(dá)逐漸增多[25]。非折疊蛋白反應(yīng)誘導(dǎo)劑(UPR)——衣霉素2.5 ng/mL干預(yù)MPC5 10 h，誘導(dǎo)ERS活化，自噬增強(qiáng)，細(xì)胞骨架圍微管蛋白Tubulin表達(dá)降低、排列紊亂。加用PI3K阻斷劑與衣霉素共同干預(yù)足細(xì)胞后，與衣霉素組相比，LC3 Ⅱ表達(dá)明顯降低，Tubulin蛋白表達(dá)上升。說(shuō)明在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均存在ERS激活，造成足細(xì)胞損傷(未凋亡)，自噬功能可改善ERS造成的足細(xì)胞損傷。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，與在人類腎組織中的表現(xiàn)并不完全相同，可能是因?yàn)閯?dòng)物并不能完全替代人類IMN的發(fā)病機(jī)制，但足細(xì)胞自噬功能的調(diào)節(jié)確實(shí)能起保護(hù)足細(xì)胞的作用，具體表現(xiàn)可能是早期的自噬激活，進(jìn)行細(xì)胞自身的修復(fù)，晚期隨著疾病的進(jìn)展，各種病理表現(xiàn)的加重，足細(xì)胞自噬功能受到抑制，自我修復(fù)自救能力降低，造成足細(xì)胞損傷的不可挽救，病情持續(xù)快速進(jìn)展，跟臨床表現(xiàn)的腎病終末期進(jìn)展加快相吻合。

3.4狼瘡性腎炎(LN)中足細(xì)胞自噬情況 在LN患者中，足細(xì)胞自噬功能異常存在于LN發(fā)病機(jī)制中。JIN等[23]納入了60例LN患者，病理分級(jí)從Ⅱ～Ⅴ型，LN患者足細(xì)胞自噬體數(shù)量明顯少于對(duì)照組，根據(jù)病理分級(jí)的加重，自噬體數(shù)量呈增多趨勢(shì)，但各型間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，同時(shí)研究還觀察到Ⅴ型LN患者(15例)足細(xì)胞內(nèi)自噬體數(shù)量少于IMN組(26例)。SMN常繼發(fā)于LN，屬于自身免疫系統(tǒng)疾病，免疫功能的紊亂可能參與足細(xì)胞自噬體的形成，在IMN及LN發(fā)病機(jī)制中的致病作用可得到側(cè)面體現(xiàn)。

3.5抗腎小球基底膜性腎炎(anti-GBM) anti-GBM系循環(huán)中抗基底膜抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病，單有腎臟損傷時(shí)稱為anti-GBM。鈣依賴性磷脂酶A2γ(iPLA2γ)屬于磷脂酶A2受體家族，對(duì)補(bǔ)體介導(dǎo)的腎小球上皮細(xì)胞損傷時(shí)起保護(hù)作用。iPLA2γ基因敲除的小鼠并無(wú)蛋白尿的產(chǎn)生，但會(huì)導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)異常，增加衰老足細(xì)胞的自體吞噬能力；有研究發(fā)現(xiàn)，iPLA2γ基因敲除幼鼠誘導(dǎo)anti-GBM后，與野生型相比，產(chǎn)生了明顯的蛋白尿、足細(xì)胞足突融合和足細(xì)胞脫落。從兩組小鼠中分離足細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡分析，iPLA2γ基因敲除小鼠足細(xì)胞骨架蛋白synaptopodin、Nephrin和podocalyxin表達(dá)均降低，足細(xì)胞骨架遭到破壞，足突間距拉大，LC3Ⅱ/Ⅰ比值明顯增加，同時(shí)AMPK磷酸化水平明顯較野生型增多[26]。iPLA2γ基因在正常足細(xì)胞及腎小球腎炎中起保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)自噬通路實(shí)現(xiàn)。

4 展 望

細(xì)胞自噬是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，其在生理和病理上具有重要作用，以往的研究證實(shí)眾多介質(zhì)和信號(hào)通路參與其中，包括Beclin-1和2、ClassⅢ、PI3K/AKT、mTOR、AMPK、JNK、ROS等。目前的研究表明足細(xì)胞可以通過(guò)細(xì)胞自噬功能清除細(xì)胞內(nèi)的損傷和衰老的細(xì)胞器，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，防止自身的損傷引起腎臟疾病。這些相關(guān)研究主要觀察了足細(xì)胞自噬情況變化，了解其自噬能力丟失帶來(lái)的影響，雖然證明了細(xì)胞自噬與足細(xì)胞損傷的相關(guān)性，但并不能闡明之間的確切因果關(guān)系。細(xì)胞自噬參與足細(xì)胞損傷導(dǎo)致的腎病蛋白尿和腎小球硬化中的具體作用機(jī)制，仍有待進(jìn)一步深入研究。