邱書娟，孫秀菊，李香玲

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,山東濰坊 261041)

Klotho是1997年日本學(xué)者在研究自發(fā)性高血壓小鼠模型時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種具有抗衰老作用基因，Klotho基因缺陷小鼠衰老過程加快，過早出現(xiàn)皮膚萎縮、性腺功能減退、動脈粥樣硬化、骨質(zhì)疏松等征象[1]，因此以希臘神話中掌握人類生命線的女神Klotho命名。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Klotho基因過表達(dá)小鼠在體內(nèi)Klotho濃度2倍于野生小鼠的同時(shí)平均壽命也延長20%～30%。除抗衰老作用外，Klotho還具有抗氧化、抗凋亡、保護(hù)血管及參與機(jī)體磷代謝等多種作用，且與腎臟疾病關(guān)系密切，在多種急、慢性腎臟疾病中都檢測到其表達(dá)顯著降低，與腎功能存在相關(guān)性，本文就近年來Klotho在急性腎損傷診斷及治療中作用的研究進(jìn)展進(jìn)行如下綜述。

1 Klotho的生物學(xué)活性

Klotho在體內(nèi)可由腎臟、腦、甲狀旁腺等多個(gè)器官分泌，以腎臟中濃度最高，主要由腎小管上皮細(xì)胞分泌[2]。除傳統(tǒng)的Klotho外，還有兩種同源異構(gòu)體：β-Klotho和γ-Klotho，其中前者主要在膽汁酸和能量代謝中起作用，而后者的作用至今未明，基于此，最先發(fā)現(xiàn)的Klotho又被稱為α-Klotho，本文中仍沿用傳統(tǒng)名字Klotho。Klotho基因定位在人類13號染色體，其編碼的蛋白產(chǎn)物被不同的蛋白酶剪切后分別產(chǎn)生膜型和分泌型兩種形式。目前研究發(fā)現(xiàn)，膜型Klotho是骨源性激素成纖維生長因子23(FGF-23)的共受體，其與FGF-23及其受體結(jié)合形成復(fù)雜的共同體而發(fā)揮下游效應(yīng)[3]，在機(jī)體的鈣磷代謝及凋亡中發(fā)揮作用。而分泌型Klotho被選擇性剪切后直接釋放到胞外，或由膜型Klotho蛋白的胞外部分被膜錨定蛋白酶ADAM10/17剪切后釋放出來，以內(nèi)分泌激素的形式分布于血液、尿液及腦脊液中,其具有糖苷酶活性，能調(diào)節(jié)離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體、抑制氧化應(yīng)激、抗衰老等，又稱為可溶性Klotho。

1.1 膜型Klotho 膜型Klotho作為FGF-23的共受體能增加其與受體結(jié)合物的穩(wěn)定性，從而加強(qiáng)其生物學(xué)作用。FGF-23是調(diào)節(jié)機(jī)體磷代謝的重要物質(zhì)，能抑制腎臟分泌1-α羥化酶，降低1,25-(OH)2 VitD3的產(chǎn)生并加速其分解，從而減少磷在腸道的吸收，在血磷的長期調(diào)節(jié)方面起重要作用。Klotho基因缺失的純合子小鼠體內(nèi)1,25-(OH)2 VitD3水平顯著升高，同時(shí)1-α羥化酶表達(dá)增加[4]，而Klotho基因的正常表達(dá)能降低1-α羥化酶活性，降低1,25-(OH)2 VitD3水平的同時(shí)減少其受體的表達(dá)，表明正常的Klotho蛋白表達(dá)對維生素D的代謝平衡非常重要。FGF-23能夠通過減少腎小管對磷的重吸收而增加尿磷，主要作用機(jī)制為抑制近端腎小管上皮細(xì)胞頂端膜的鈉-磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ⅱ。Klotho基因缺陷小鼠存在顯著的高磷血癥，而通過增強(qiáng)基因表達(dá)或補(bǔ)充外源性重組Koltho均能使小鼠的血磷恢復(fù)正常。有研究表明，Klotho基因過表達(dá)小鼠較正常鼠有較低的血磷水平，同時(shí)尿磷明顯增加，提示Klotho能通過減少腎臟對磷的重吸收而降低血磷[5]。

1.2 分泌型Klotho

1.2.1 抗衰老 抗衰老作用是Klotho首先被發(fā)現(xiàn)的作用。Klotho在體外和體內(nèi)均能明顯抑制尿毒癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞衰老進(jìn)程，且其水平與內(nèi)皮細(xì)胞衰老程度呈負(fù)相關(guān)，對NF-κB激活的抑制被認(rèn)為在其中起重要作用[6]。Klotho能降低過氧化氫和依托泊苷誘導(dǎo)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞caspase3和caspase9的活性，減少衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶表達(dá)，延緩衰老進(jìn)程，p53/p21信號通路與細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Klotho能抑制p53/p21的表達(dá),而其水平降低能增加p53/p21的表達(dá)，促進(jìn)衰老進(jìn)程[7]。重組Klotho能夠抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和衰老[8]，這種保護(hù)作用可以被絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)抑制劑減弱，推測Klotho可能通過引起MAPKs的磷酸化發(fā)揮抗凋亡和抗衰老作用。

1.2.2 抗氧化 機(jī)體內(nèi)缺血、缺氧時(shí)會產(chǎn)生過量的活性氧，超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力時(shí)會在體內(nèi)大量蓄積造成細(xì)胞損傷，促進(jìn)衰老過程，在糖尿病、腎病等疾病的病理發(fā)展過程中起重要作用。Klotho具有顯著的抗氧化活性，能增加體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cAMP產(chǎn)物，增強(qiáng)超氧化物歧化酶活性從而減輕氧化應(yīng)激損傷。Klotho高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠較野生型小鼠有更高的抗氧化應(yīng)激能力，壽命明顯延長，可能與抑制p53、p21等與衰老和凋亡有關(guān)的基因、激活cAMP途徑[6]等有關(guān)。同時(shí)，氧化應(yīng)激也對Klotho蛋白的產(chǎn)生具有抑制作用，在急性腎損傷(AKI)、糖尿病腎病等存在明顯氧化應(yīng)激的疾病中均可觀察到Klotho及其產(chǎn)物的表達(dá)降低[9]，而減少氧自由基的產(chǎn)生可抑制Klotho的下降，可見氧化應(yīng)激與Klotho間存在著相互制約、相互影響的復(fù)雜關(guān)系。

1.2.3 抗炎癥 Klotho還能抑制炎癥細(xì)胞、減輕炎癥反應(yīng)。Klotho與內(nèi)皮細(xì)胞共同培育能明顯減輕其由TNF-α誘導(dǎo)的黏附分子增加及NF-κB系統(tǒng)的活化。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Klotho無論在體內(nèi)還是體外均能抑制與衰老相關(guān)的炎癥因子IL-6和IL-8，其作用機(jī)制可能與維甲酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ的相互作用有關(guān)。另一方面，炎癥反應(yīng)也能抑制Klotho的產(chǎn)生，炎癥因子TNF-α能減少小鼠腎臟Klotho的產(chǎn)生，其作用機(jī)制與活化NF-κB信號通路有關(guān)，應(yīng)用NF-κB抑制劑能增加Klotho的表達(dá)。Thurston等[11]在三種不同的小鼠炎癥性腸病模型中均檢測到Klotho基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)降低，且降低程度與腸炎的嚴(yán)重程度正相關(guān)，而應(yīng)用抗TNF抗體可明顯緩解Klotho的缺乏狀態(tài)，提示炎癥對Klotho存在抑制作用。

1.2.4 調(diào)節(jié)離子通道 Klotho不但能通過影響鈉磷協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)血磷，還對其他多種離子通道具有調(diào)節(jié)作用，如能通過調(diào)節(jié)腎臟鈣離子通道瞬時(shí)感受器電位陽離子通道V5增加腎小管對鈣離子的重吸收，參與調(diào)節(jié)鈣平衡；通過對腎臟外髓質(zhì)鉀通道1的干預(yù)參與鉀平衡等。Klotho在發(fā)揮調(diào)節(jié)離子通道作用時(shí)類似于酶，其胞外結(jié)構(gòu)中有20%～40%的氨基酸序列與糖苷酶相同；在參與腎臟離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)控時(shí)具有β-糖苷酶和唾液酸酶的活性，因此被認(rèn)為是一種新的鈣磷調(diào)節(jié)激素。

1.2.5 抗血管及軟組織鈣化 高磷血癥是血管及軟組織鈣化的重要促進(jìn)因素，Klotho的降低血磷作用使其能有效減少血管及軟組織鈣化水平。慢性腎臟病動物模型中Klotho高表達(dá)小鼠的異位鈣化水平較野生型及Klotho基因缺陷小鼠明顯降低[12]。Klotho對甲狀旁腺激素(PTH)的抑制也是其減輕異位鈣化的重要機(jī)制，其除了能通過對血磷、活性維生素D及FGF-23的影響對PTH進(jìn)行調(diào)節(jié)外，還能直接影響PTH的產(chǎn)生和分泌。Ben-Dov等在甲狀旁腺組織中發(fā)現(xiàn)了FGFR1、FGFR3，認(rèn)為FGF-23在甲狀旁腺中與Klotho/FGFR結(jié)合后激活MAPK級聯(lián)信號通路直接調(diào)節(jié)PTH的分泌。正常表達(dá)的Klotho和FGF-23能增加甲狀旁腺的鈣敏感受體和維生素D受體的表達(dá)，且抑制甲狀旁腺細(xì)胞增生，從而減少PTH的分泌。

2 Klotho在AKI診治中的作用

2.1 Klotho在AKI中的水平變化 AKI是臨床常見綜合征，指腎功能在短期內(nèi)下降，表現(xiàn)為血肌酐升高、尿量減少、水電解質(zhì)紊亂等，常見于膿毒癥、大手術(shù)、心源性休克、藥物損傷等情況，在醫(yī)院內(nèi)尤其是ICU發(fā)生率逐漸升高，影響患者預(yù)后，部分可引起慢性腎臟損害，甚至導(dǎo)致死亡[13，14]。多種原因?qū)е碌腁KI模型包括缺血再灌注(IR)損傷、膿毒癥、輸尿管梗阻、低血容量及腎毒性藥物等均可檢測到腎臟Klotho產(chǎn)生減少，提示Klotho的表達(dá)降低在腎前性、腎實(shí)質(zhì)性及腎后性AKI中普遍存在。一項(xiàng)大鼠腎臟IR損傷模型試驗(yàn)檢測了腎臟灌注不同時(shí)間點(diǎn)的Klotho水平，發(fā)現(xiàn)在腎臟灌注的第1天Klotho明顯降低，在灌注的第3天和第4天腎臟Klotho的基因和蛋白表達(dá)水平恢復(fù)到基線水平。一項(xiàng)回顧性研究檢測了21例AKI患者的腎臟Klotho表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其水平顯著下降,且與血肌酐基線水平和峰值均呈負(fù)相關(guān)[15]。葉酸誘導(dǎo)的腎毒性AKI小鼠模型中腎臟Klotho mRNA的表達(dá)降低維持到第7天尚未恢復(fù)，而此時(shí)血肌酐水平已經(jīng)基本恢復(fù)到基線水平，表明Klotho轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的恢復(fù)比腎功能的恢復(fù)晚，但其是否能夠預(yù)測AKI進(jìn)展至慢性腎臟病尚不明確。除了腎臟中Klotho的表達(dá)降低，血漿和尿液中也有相似的變化，多項(xiàng)嚙齒類動物試驗(yàn)檢測到在缺血性AKI中，血漿和尿液可溶性Klotho在腎臟再灌注3 h開始下降，2 d后逐漸升高，7 d基本恢復(fù)到基線水平，這與腎臟中的表達(dá)改變基本一致。腎毒性藥物導(dǎo)致的AKI中也觀察到血漿Klotho水平的降低。腎移植患者中腎功能延遲恢復(fù)者的血漿Klotho水平較早期恢復(fù)者明顯降低，這種差別在移植術(shù)后2年仍可檢測到。

AKI中Klotho快速下降的機(jī)制尚不完全明確。IR損傷導(dǎo)致的AKI中腎臟Klotho蛋白水平的下降幅度明顯大于mRNA的下降，表明除轉(zhuǎn)錄水平降低外尚存在其他的原因?qū)е翶lotho水平降低。氧化應(yīng)激和炎癥因子活化是AKI病理過程中的重要特點(diǎn)，二者均可在一定程度上抑制Klotho的產(chǎn)生[10]。

2.2 Klotho對AKI的診斷價(jià)值 AKI的早期診斷非常重要，目前較靈敏的指標(biāo)包括尿液或(和)血漿中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(NGAL)和尿腎臟損傷分子-1，這些標(biāo)志物在AKI中均表現(xiàn)為水平升高，其中NGAL在再灌注后5 h即可檢測到明顯升高，大大縮短了AKI的診斷時(shí)限。血漿和腎臟中Klotho水平在小鼠腎臟再灌注后3 h明顯下降，較NGAL的升高更加提前，表明其具有良好的早期診斷價(jià)值，與上述生物標(biāo)記物聯(lián)合檢測能提高AKI診斷的靈敏性和特異性。研究發(fā)現(xiàn)AKI患者腎臟Klotho表達(dá)降低與腎損害嚴(yán)重程度相關(guān)，且能預(yù)測腎功能的短期恢復(fù)情況[15]。在AKI的鑒別診斷方面Klotho也有一定價(jià)值。有研究[16]比較了腎前性和腎實(shí)質(zhì)性AKI的SD大鼠尿Klotho水平，發(fā)現(xiàn)腎前性AKI大鼠的尿Klotho水平較腎實(shí)質(zhì)性AKI明顯下降，而血、尿NGAL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Liu等[17]研究發(fā)現(xiàn)，心臟瓣膜置換術(shù)后AKI患者較未發(fā)生AKI患者的即時(shí)血液Klotho水平明顯降低，而這種差別在術(shù)后24 h逐漸消失，表明血液Klotho水平可作為AKI超早期(1 d)的生物學(xué)標(biāo)志物,而在術(shù)后較長時(shí)間(2～3 d)可檢測血肌酐與Klotho比值提高AKI診斷的敏感性。目前Klotho作為AKI診斷的標(biāo)志物仍有許多不足，如大部分為動物試驗(yàn)，以人類為對象的研究較少；尚沒有理想的檢測時(shí)機(jī)及正常范圍等。

2.3 Klotho在AKI中的治療作用 Klotho在AKI中表達(dá)降低，不僅是疾病的一種表現(xiàn)，也很可能參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)動物試驗(yàn)表明，Klotho在AKI中起到保護(hù)作用。在缺血性腎損傷模型中，Klotho基因高表達(dá)的Tg-Kl小鼠較野生型小鼠腎損傷明顯減輕，而低表達(dá)小鼠損傷更重，在缺血性腎損傷早期給予外源性重組Klotho同樣能改善腎功能，降低NGAL水平。在大鼠的IR損傷模型中，應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Klotho基因表達(dá)增加也能使血清肌酐顯著降低，腎臟病理改變減輕及凋亡細(xì)胞減少。在抗腫瘤藥順鉑誘導(dǎo)的腎實(shí)質(zhì)性腎損傷模型中，Klotho基因缺陷的雜合子小鼠腎損傷較Klotho高表達(dá)的Tg-Kl小鼠明顯加重，NGAL升高更顯著，凋亡細(xì)胞更多，表明Klotho對缺血性及藥物性AKI均有良好的腎保護(hù)作用。除預(yù)防性提高Klotho的水平可以顯著減輕腎損傷外，在腎臟IR損傷30～60 min給予重組Klotho仍能有效地保護(hù)腎臟。但是Klotho的這種腎保護(hù)作用仍具有很強(qiáng)的時(shí)效性，在腎損傷前或腎損傷超早期給予效果最好，對于可以預(yù)知的AKI如心臟手術(shù)、冠脈造影、腎毒性藥物的使用等情況可能會有較大的應(yīng)用價(jià)值。

AKI不但能在短期內(nèi)損傷腎功能，增加病死率，還可能引起慢性腎功能損害，導(dǎo)致腎纖維化。Klotho在改善AKI的早期預(yù)后、降低患病率和病死率的同時(shí)還對其晚期預(yù)后有明顯的改善作用，在單側(cè)輸尿管梗阻誘導(dǎo)的腎損傷小鼠模型中，腎臟及血漿Klotho水平均明顯降低的雜合子小鼠腎臟纖維化明顯較野生型小鼠加重，表明Klotho能夠抑制AKI后的腎臟纖維化，改善遠(yuǎn)期預(yù)后。Klotho保護(hù)急性腎臟損傷的機(jī)制可能與其抗氧化、抗凋亡、抗炎癥[9]、抗衰老[7，8]和促進(jìn)血管生成等作用有關(guān)。

綜上所述，Klotho具有抗衰老、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)血管等廣泛生物學(xué)作用，與AKI關(guān)系密切，不但是其早期生物學(xué)標(biāo)志物，且可能參與病理過程，并可作為治療靶點(diǎn)發(fā)揮作用。

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