韓 麗 解培峰 趙 越 高乾坤 章文明 張 濤 王占彬 印遇龍 孔祥峰*

(1.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，動物營養(yǎng)生理和代謝過程實驗室，長沙 410125；2.河南科技大學，動物科技學院，洛陽 471003；3.贏創(chuàng)德固賽(中國)投資有限公司，北京 100600)

母豬的健康狀況和繁殖性能直接影響?zhàn)B豬場的經(jīng)濟效益。隨著規(guī)?；降奶岣?，養(yǎng)豬場存在飼料原料搭配不合理、缺乏特定營養(yǎng)素、飼料變質(zhì)等問題[1]，引起母豬腸道菌群失衡、營養(yǎng)物質(zhì)利用率低[2]，造成母豬便秘和繁殖障礙，縮短母豬利用年限，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展[3]。因此，如何通過營養(yǎng)調(diào)控措施改善母豬的腸道健康已成為目前的研究熱點。益生菌作為活菌制劑，可改善腸道菌群平衡。目前常用的益生菌主要有芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌等[4]。由于芽孢桿菌能夠形成芽孢，具有耐高溫高壓、耐酸堿等特點，便于生產(chǎn)和儲存[5]，為目前使用最普遍的微生物飼料添加劑。研究證實，芽孢桿菌可降低豬腸道pH，促進有益菌繁殖，防止腸道疾病的發(fā)生[6]；可改善仔豬腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)[7]，促進營養(yǎng)物質(zhì)利用，增強機體免疫力，進而促進仔豬的生長發(fā)育[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加枯草芽孢桿菌，母豬妊娠第85～112天和產(chǎn)后第21天的背膘厚呈增加趨勢，機體免疫力增強[9]；同時，仔豬腹瀉率降低，窩產(chǎn)仔數(shù)、產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生窩重、初生個體均重、斷奶窩重、斷奶窩個體均重和平均日增重均有所提高。圍產(chǎn)期母豬易遭受各種應激，引起腸道菌群失衡，對仔豬初生重、斷奶重和窩整齊度等造成不利影響，因此保證母豬腸道菌群平衡對提高其繁殖性能具有重要意義。目前，關(guān)于枯草芽孢桿菌影響母豬糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的研究報道較少。鑒于此，本試驗通過在圍產(chǎn)期母豬飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑，評價其對母豬糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的影響，旨在為枯草芽孢桿菌在母豬生產(chǎn)中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物、分組與飼養(yǎng)管理

動物飼養(yǎng)試驗于2017年3—5月份在中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所永安動物實驗基地開展。試驗選用2～4胎次、預產(chǎn)期相近、妊娠第85天的健康大白豬40頭，隨機分為2個組，每組20頭豬。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗組在基礎(chǔ)飼糧中添加250 g/t的枯草芽孢桿菌制劑。從妊娠第85天開始飼喂妊娠母豬飼糧，妊娠第100天更換為泌乳母豬飼糧，到產(chǎn)后第21天結(jié)束?；A(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參照NRC(2012)豬營養(yǎng)需求標準配制，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗用枯草芽孢桿菌制劑由贏創(chuàng)德固賽(中國)投資有限公司提供(活菌數(shù)≥4×109CFU/g)，其添加劑量根據(jù)前人相關(guān)研究報道[7-8,10]及生產(chǎn)廠家建議確定。試驗期間，不同妊娠階段母豬的飼喂量根據(jù)母豬體況隨時調(diào)整，防止母豬過瘦或過肥。妊娠第85～110天時母豬舍溫度控制在16～18 ℃；預產(chǎn)期前7 d將母豬轉(zhuǎn)入產(chǎn)仔舍，溫度控制在20～24 ℃，濕度控制在60%～80%。其他飼養(yǎng)管理均按商業(yè)養(yǎng)豬場規(guī)范進行操作。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

續(xù)表1項目Items妊娠母豬飼糧Pregnantsows’diet泌乳母豬飼糧Lactatingsows’diet賴氨酸Lys0.981.53蛋氨酸Met0.120.16蘇氨酸Thr0.680.99

1)妊娠母豬預混料為每千克飼糧提供 The pregnant sows’ premix provides the following per kilogram of the diet：VA 10 000 IU，VD 2 500 IU，VE 100 IU，VK 2.0 mg，VB210 mg，VB61.0 mg，VB1250 μg，氯化膽堿 choline chloride 1 500 mg，F(xiàn)e 80 mg，Cu 20 mg，Zn 100 mg，Mn 45 mg，I 0.7 mg，Se 0.25 mg。

2)哺乳母豬預混料為每千克飼糧提供 The lactating sows’ premix provides the following per kilogram of the diet：VA 15 000 IU，VD 3 200 IU，VE 50 IU，VK 4.0 mg，VB14.0 mg，VB210 mg，VB63.0 mg，VB1220 μg，氯化膽堿 choline chloride 800 mg，F(xiàn)e 120 mg，Cu 20 mg，Zn 112 mg，Mn 24 mg，I 0.5 mg，Se 0.4 mg。

3)消化能為計算值，其余指標為實測值。DE is a calculated value, while the others are measured values.

1.2 糞便微生物數(shù)量測定

分別于母豬妊娠第100和112天以及產(chǎn)后第7、14和21天，每組隨機收集8頭母豬的新鮮糞便樣品，-80 ℃凍存。按照QIAamp DNA Stool Mini Kit (QIAgen，德國)的方法提取糞便微生物DNA，參照焦金真等[11]的方法進行微生物定量PCR分析，并計算糞便微生物數(shù)量，結(jié)果以每克糞便中含有的微生物拷貝數(shù)的對數(shù)值[lg(copies/g)]表示。微生物絕對定量PCR的特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 細菌的特異性引物序列

1.3 糞便微生物代謝產(chǎn)物含量測定

采用氣相色譜法測定糞便中短鏈脂肪酸(SCFA)的含量，采用液相色譜法檢測糞便中生物胺的含量[12]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 18.0軟件進行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤”表示。P<0.05表示差異顯著，0.05≤P<0.10表示有變化趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑對母豬糞便微生物數(shù)量的影響

由表3可知，與對照組相比，試驗組產(chǎn)后第7天母豬糞便中乳酸桿菌數(shù)量和乳酸桿菌/大腸桿菌顯著增加(P<0.05)；產(chǎn)后第21天糞便中厚壁菌數(shù)量顯著增加(P<0.05)，雙歧桿菌數(shù)量呈增加趨勢(P=0.097)。

2.2 飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑對母豬糞便SCFA含量的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗組妊娠第100天母豬糞便中乙酸、異丁酸、支鏈脂肪酸和總SCFA含量，產(chǎn)后第7天糞便中戊酸、直鏈脂肪酸、異丁酸、異戊酸、支鏈脂肪酸和總SCFA含量，產(chǎn)后第21天糞便中丙酸、丁酸和直鏈脂肪酸含量顯著增加(P<0.05)；妊娠第100天糞便中戊酸(P=0.071)和異戊酸(P=0.064)含量，產(chǎn)后第7天糞便中乙酸(P=0.051)含量，產(chǎn)后第21天糞便中總SCFA含量(P=0.057)呈增加趨勢；產(chǎn)后第14天糞便中異戊酸含量顯著降低(P<0.05)，支鏈脂肪酸含量呈降低趨勢(P=0.066)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。下表同。

* means significant difference compared with the control group (P<0.05). The same as below.

表4 飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑對母豬糞便SCFA含量的影響

2.3 飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑對母豬糞便生物胺含量的影響

由表5可知，與對照組相比，試驗組妊娠第100天母豬糞便中尸胺含量顯著增加(P<0.05)，腐胺含量呈增加趨勢(P=0.074)；妊娠第112天糞便中亞精胺和精胺含量顯著增加(P<0.05)；產(chǎn)后第14天糞便中尸胺、酪胺、亞精胺和精胺含量顯著增加(P<0.05)。

表5 飼糧中添加枯草芽孢桿菌制劑對母豬糞便生物胺含量的影響

3 討 論

乳酸桿菌和雙歧桿菌是豬腸道中的優(yōu)勢菌群，對維持腸道健康具有重要作用[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可增加圍產(chǎn)期母豬糞便中乳酸桿菌、雙歧桿菌、厚壁菌數(shù)量以及乳酸桿菌/大腸桿菌，提示母豬腸道菌群平衡得到改善，對母豬繁殖性能和子代腸道健康具有促進作用[9]。這可能與芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素等抑菌物質(zhì)有關(guān)，也可能與微生物產(chǎn)生的有益代謝產(chǎn)物有關(guān)，與前人的研究結(jié)果基本一致[10]。圍產(chǎn)期母豬易發(fā)生氧化應激，對其產(chǎn)仔數(shù)和子代生長發(fā)育具有極其不利的影響。研究表明，芽孢桿菌和乳酸菌具有抗氧化功能，可減少細胞損害[13-14]，提示枯草芽孢桿菌可改善母豬營養(yǎng)狀況和繁殖性能[9]，這可能與腸道中有益菌的增加和機體總抗氧化能力增強有關(guān)。另外，母豬糞便中雙歧桿菌數(shù)量增加，可促進其在新生仔豬腸道內(nèi)的早期定植，防止仔豬腹瀉，改善母豬便秘和乳汁品質(zhì)[15]。

乙酸、丙酸、丁酸等SCFA主要由結(jié)腸中乳酸菌、雙歧桿菌等厭氧菌發(fā)酵降解膳食纖維、抗性淀粉等碳水化合物產(chǎn)生，可參與機體氧化供能、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡和改善腸道功能等[16]。其中，乙酸可為腸道細菌和腸黏膜提供能量[17]；丙酸可抑制膽固醇的合成，參與三羧酸循環(huán)，為機體供能；丁酸是厚壁菌的主要代謝產(chǎn)物，可為結(jié)腸上皮細胞提供能量，促進細胞的代謝和生長等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌可提高圍產(chǎn)期母豬糞便中乙酸、丙酸和丁酸等SCFA的含量，從而有益于母豬的腸道健康和營養(yǎng)物質(zhì)代謝，這可能與其產(chǎn)生高活性的消化酶有關(guān)，也可能與其促進乳酸菌和雙歧桿菌的增殖有關(guān)。研究表明，乳酸菌能增加肉雞盲腸中SCFA含量和丁酸百分比[18]，促進仔豬結(jié)腸中丁酸的產(chǎn)生[10]。Duncan等[19]報道，雙歧桿菌可促進乳酸向丁酸的轉(zhuǎn)化?？梢姡莶菅挎邨U菌可通過增加腸道有益菌數(shù)量而改善母豬的營養(yǎng)狀況，滿足母豬的能量需求，這有益于母體的腸道健康和胎兒發(fā)育。支鏈脂肪酸是亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸經(jīng)氧化脫氨基后的產(chǎn)物，是腸腔內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝的標志物[20]。本研究中，飼糧中添加枯草芽孢桿菌增加了圍產(chǎn)期母豬糞便中支鏈脂肪酸含量，提示母豬結(jié)腸中這幾種氨基酸的分解代謝增加，其生理學意義尚有待進一步探明。

腸道中的生物胺主要由腸細胞和腸道微生物代謝含氮物質(zhì)產(chǎn)生，可緩解細胞氧化損傷，參與腸道黏膜屏障的發(fā)育和維持，對胎盤生長和胎兒發(fā)育具有重要作用。其中，腐胺、尸胺、精胺和亞精胺是動物細胞的重要組成部分，可調(diào)節(jié)核酸與蛋白質(zhì)合成，酪胺具有顯著的抗氧化作用[21]。本研究表明，飼糧中添加枯草芽孢桿菌增加了圍產(chǎn)期母豬糞便生物胺含量，可能是由于枯草芽孢桿菌、乳酸菌或雙歧桿菌等可產(chǎn)生氨基酸脫羧酶，參與賴氨酸、酪氨酸、鳥氨酸和精氨酸等生物胺前體氨基酸的分解代謝。Lopez-Garcia等[22]報道，妊娠后期大鼠胎盤需要維持高濃度的亞精胺、精胺和腐胺等來滿足胎兒生長的需求，而腸腔內(nèi)的多胺可被機體吸收，用于其他器官和組織的細胞生長[23]。因此，推測枯草芽孢桿菌可通過增加機體中生物胺的合成而促進胎兒的生長發(fā)育。

4 結(jié) 論

綜上所述，飼糧中添加枯草芽孢桿菌可增加母豬腸道中有益菌的數(shù)量、部分生物胺和SCFA含量，從而改善圍產(chǎn)期母豬的腸道健康和營養(yǎng)狀況。

[1] VAN DEN BRAND H,HEETKAMP M J,SOEDE N M,et al.Energy balance of lactating primiparous sows as affected by feeding level and dietary energy source[J].Journal of Animal Science,2000,78(6):1520-1528.

[2] 周根來,殷潔鑫.影響母豬繁殖性能的營養(yǎng)因素及調(diào)控措施[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(11):90-93.

[3] 路永強,張瑜,任利忠,等.母豬繁殖障礙成因分析[J].中國農(nóng)學通報,2010,26(18):39-42.

[4] 侯冠彧,周漢林,荀文娟,等.幾種常用飼料添加劑對斷奶仔豬腸道菌群調(diào)控的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2016,43(11):2939-2944.

[5] 張愛武,薛軍.枯草芽孢桿菌在動物生產(chǎn)中的應用效果[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(4):234-238.

[6] 孔祥峰.結(jié)腸微生物氮代謝與機體健康研究進展[J].飼料與畜牧(新飼料),2013,(4):10-17.

[7] LEE S H,INGALE S L,KIM J S,et al.Effects of dietary supplementation withBacillussubtilisLS 1-2 fermentation biomass on growth performance, nutrient digestibility, cecal microbiota and intestinal morphology of weanling pig[J].Animal Feed Science and Tschnology,2014,188(1/2):102-110.

[8] 張麗,丁宏標.酵母培養(yǎng)物、枯草芽孢桿菌和木瓜蛋白酶對保育豬生長性能、營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率和糞便微生物數(shù)量的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2016,28(11):3642-3649.

[9] 韓麗,孔祥峰,趙越,等.枯草芽孢桿菌對圍產(chǎn)期母豬繁殖性能和子代生長的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2017,29(12):4440-4446.

[10] 蘇勇,姚文,黃瑞華,等.芽孢乳桿菌S1對斷奶前后仔豬腸道乳酸菌、大腸桿菌和揮發(fā)性脂肪酸含量變化的影響[J].福建農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),2006,35(1):73-76.

[11] 焦金真,王芃芃,湯少勛,等.瀏陽黑山羊胃腸道不同部位重要功能微生物的數(shù)量分布特征研究[J].畜牧獸醫(yī)學報,2013,44(10):1590-1599.

[12] 李華偉,蘇家宜,胡誠軍,等.飼糧添加發(fā)酵中藥渣對圍產(chǎn)期母豬糞便微生物及其代謝產(chǎn)物的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2017,29(9):3232-3239.

[13] 余東游,毛翔飛,秦艷,等.枯草芽孢桿菌對肉雞生長性能及其抗氧化和免疫功能的影響[J].中國畜牧雜志,2010,46(3):22-25.

[14] GUO X,XIA X,TANG R,et al.Development of a real-time PCR method forFirmicutesandBacteroidetesin faeces and its application to quantify intestinal population of obese and lean pigs[J].Letters in Applied Microbiology,2008,47(5):367-373.

[15] DI GIOIA D,ALOISIO I,MAZZOLA G,et al.Bifidobacteria:their impact on gut microbiota composition and their applications as probiotics in infants[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(2):563-577.

[16] KONG X F,JI Y J,LI H W,et al.Colonic luminal microbiota and bacterial metabolite composition in pregnantHuanjiangmini-pigs:effects of food composition at different times of pregnancy[J].Scientific Reports,2016,6(1):37224.

[17] ZHOU X L,KONG X F,LIAN G Q,et al.Dietary supplementation with soybean oligosaccharides increases short-chain fatty acids but decreases protein-derived catabolites in the intestinal luminal content of weanedHuanjiangmini-piglets[J].Nutrition Research,2014,34(9):780-788.

[18] 于卓騰,毛勝勇,朱偉云.微生態(tài)制劑和飼用抗生素對肉雞盲腸VFA和微生物區(qū)系的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報,2007,30(3):110-114.

[19] DUNCAN S H,LOUIS P,FLINT H J.Lactate-utilizing bacteria, isolated from human feces, that produce butyrate as a major fermentation product[J].Applied and Environmental Microbiology,2004,70(10):5810-5817.

[20] KONG X F,ZHOU X L,LIAN G Q,et al.Dietary supplementation with chitooligosaccharides alters gut microbiota and modifies intestinal luminal metabolites in weanedHuanjiangmini-piglets[J].Livestock Science,2014,160:97-101.

[21] BLACHIER F,MARIOTTI F,HUNEAU J F,et al.Effects of amino acid-derived luminal metabolites on the colonic epithelium and physiopathological consequences[J].Amino Acids,2007,33(4):547-562.

[22] LOPEZ-GARCIA C,LOPEZ-CONTRERAS A J,CASTELLS A,et al.Transcriptomic analysis of polyamine-related genes and polyamine levels in placenta, yolk sac and fetus during the second half of mouse pregnancy[J].Placenta,2009,30(3):241-249.

[23] MILOVICV.Polyamines in the gut lumen:bioavailability and biodistribution[J].European Journal of Gastroenterology & Hepatology,2001,13(9):1021-1025.