張立蘭 陳玉霞 鐘儒清 陳 亮

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

飼料原料中含有植酸、非淀粉多糖、蛋白質(zhì)抑制因子等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，這些抗?fàn)I養(yǎng)因子會(huì)限制動(dòng)物對(duì)飼料的養(yǎng)分利用。飼用酶制劑在提高單胃動(dòng)物生長(zhǎng)性能、促進(jìn)動(dòng)物健康、調(diào)節(jié)基因功能等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。據(jù)估計(jì)，到2020年全球飼用酶制劑市場(chǎng)總值將達(dá)13.7億美元[1]。目前飼料和養(yǎng)殖企業(yè)中使用的蛋白酶大都是微生物源性蛋白酶，其作用機(jī)理受到廣大研究者的關(guān)注。大量研究表明，添加外源蛋白酶可改善畜禽生長(zhǎng)性能和健康，減輕飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，提高養(yǎng)分(尤其是蛋白質(zhì)和氨基酸)的消化率，降低排泄物中氮的含量，從而減少氨氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽對(duì)環(huán)境的污染[2-6]。但由于酶本身的特性、飼料基底背景、目標(biāo)動(dòng)物及使用方法的不同，得出的試驗(yàn)效果迥異，甚至出現(xiàn)負(fù)面結(jié)果[7]。因此，本文綜述了蛋白酶的分類、酶活性測(cè)定方法、作用機(jī)理及功能，側(cè)重分析了外源蛋白酶對(duì)豬、雞生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分消化率、健康和環(huán)境排放等方面的影響，以期對(duì)外源蛋白酶在豬、雞飼糧中合理高效利用提供理論參考。

1 蛋白酶

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的一類酶的總稱，廣泛存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中，其作用是斷裂肽鍵，破壞蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，從而將蛋白質(zhì)水解成小分子多肽和氨基酸。動(dòng)物本身可分泌一定量的內(nèi)源蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶等)消化飼料中的養(yǎng)分，但是飼料中仍會(huì)有大量養(yǎng)分不能被消化利用，隨糞便排入環(huán)境，不僅浪費(fèi)飼料資源，還造成環(huán)境污染。

1.1 蛋白酶分類

蛋白酶根據(jù)不同的分類方式可以分為不同種類。1)按來(lái)源分為：動(dòng)物源性蛋白酶、植物源性蛋白酶和微生物源性蛋白酶。動(dòng)物源性蛋白酶主要從牛、羊、豬等大型動(dòng)物的胰臟中提取，生產(chǎn)成本高，主要用于醫(yī)藥或試劑。植物源性蛋白酶常見(jiàn)的是木瓜蛋白酶和菠蘿蛋白酶，分別從未成熟的番木瓜和菠蘿中提取。微生物源性蛋白酶主要由黑曲霉、曲霉屬真菌、芽孢桿菌等細(xì)菌培養(yǎng)和真菌發(fā)酵獲得。與其他2種蛋白酶相比，微生物源性蛋白酶專一性強(qiáng)、安全高效、性質(zhì)穩(wěn)定，不受時(shí)間控制[8]，在飼料和養(yǎng)殖企業(yè)使用最為廣泛。我國(guó)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶菌種主要是芽孢桿菌，主要包括地衣芽孢桿菌2709、地衣芽孢桿菌C1213以及短小芽孢桿菌289和209[9]。2)按作用的最適pH分為：酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶。目前飼料工業(yè)應(yīng)用最多的是中性蛋白酶和酸性蛋白酶，包括胃蛋白酶、凝乳酶和部分微生物蛋白酶。酸性蛋白酶主要作用于胃，添加到飼料中可以提高動(dòng)物(尤其是幼齡動(dòng)物)對(duì)飼料中蛋白質(zhì)的消化吸收率，提高其生長(zhǎng)性能[4]。3)根據(jù)蛋白酶活性位點(diǎn)分為：天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等。國(guó)際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會(huì)(nomenclature committee of the international union of biochemistry and molecular biology，NC-IUBMB)根據(jù)蛋白酶在降解蛋白質(zhì)過(guò)程中作用于肽鏈的位置，將蛋白酶分為肽鏈內(nèi)切酶和肽鏈外切酶，如天冬氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶為肽鏈內(nèi)切酶[10]。

1.2 蛋白酶活性測(cè)定方法

蛋白酶的活性受很多因素的影響。1)溫度：蛋白酶在一定溫度范圍內(nèi)存在活性，最適溫度時(shí)活性最大，溫度過(guò)低會(huì)影響酶促反應(yīng)速率，溫度過(guò)高時(shí)酶會(huì)失活；2)pH：蛋白酶在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出活性，高于或者低于這個(gè)范圍，酶將失活，酶活性最大時(shí)的pH為該酶的最適pH；3)激活劑或抑制劑分別會(huì)促進(jìn)或抑制酶促反應(yīng)；4)金屬離子：鎂離子(Mg2+)、鈣離子(Ca2+)等金屬離子可不同程度影響蛋白酶的活性。

我國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)以及國(guó)內(nèi)外有關(guān)部分企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)蛋白酶活性的測(cè)定方法和酶活性的定義并不統(tǒng)一。專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)ZB X 66030—87指出，測(cè)定蛋白酶活性一般使用福林法，在40 ℃條件下1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活性單位。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23527—2009規(guī)定使用福林法或紫外分光光度法測(cè)定微生物蛋白酶活性，定義1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)在一定溫度和pH條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個(gè)酶活性單位，以U/g或U/mL表示。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 28715—2012規(guī)定使用分光光度法測(cè)定酸性、中性蛋白酶活性，并定義在(40±0.2) ℃和相應(yīng)的pH條件下(酸性蛋白酶pH 3.0，中性蛋白酶pH 7.2)，在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量為1個(gè)酶活性單位，即1 U。丹麥諾維信(Novozyme)公司對(duì)絲氨酸蛋白酶活性的定義為：pH 9.0、37 ℃條件下，1 min從1 μmol/L底物中釋放出1 μmol對(duì)硝基苯胺所需酶的量定義為1個(gè)酶活性單位，即1 PROT。上海杰隆生物制品股份有限公司指出，以偶氮酪蛋白為底物采用紫外分光光度法可簡(jiǎn)潔的測(cè)定角蛋白酶活性[11]。

文獻(xiàn)中對(duì)酶活性定義以及酶活性單位的描述也不盡相同。Fru等[12]與Angel等[13]對(duì)蛋白酶活性單位的定義為：pH 9.0、37 ℃條件下，1 min從底物中釋放p-對(duì)硝基苯胺所需酶的量為1個(gè)酶活性單位。Yu等[14]定義1個(gè)蛋白酶活性單位為在pH 7.5、30 ℃條件下，1 min從血紅蛋白底物中釋放酪氨酸的量。白燕等[15]對(duì)蛋白酶活性的定義為1 g蛋白酶在37 ℃下1 min水解酪素產(chǎn)生酪氨酸的量為1個(gè)酶活性單位(U/g)。于潔等[16]指出，可采用考馬斯亮藍(lán)染色法簡(jiǎn)潔而環(huán)保的測(cè)定出生姜蛋白酶的活性，該方法對(duì)酶活性的定義為，在37 ℃下，1 min分解1 μg牛血清白蛋白所需要的酶量為1個(gè)酶活性單位(U)。

目前蛋白酶活性測(cè)定方法、酶活性測(cè)定時(shí)的底物、pH、溫度等條件尚沒(méi)有很好統(tǒng)一，而且國(guó)標(biāo)缺乏堿性蛋白酶活性測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)方法，這使得酶活性的測(cè)定彼此之間沒(méi)有可比性。

2 蛋白酶的功能

飼料中外源蛋白酶的功能研究報(bào)道主要包括以下幾方面：1)直接分解底物，提高蛋白質(zhì)等養(yǎng)分的消化利用率。外源蛋白酶能夠增加豆粕中蛋白質(zhì)的溶解度，改善氨基酸代謝率[17-19]。2)提高動(dòng)物機(jī)體內(nèi)源酶的活性，Zuo等[20]在玉米-豆粕型飼糧中添加100、200、300 mg/kg 3個(gè)不同水平的外源蛋白酶，斷奶仔豬胃蛋白酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶的活性顯著提高。3)消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高消化能力。Hosoyama等[5]研究表明，蛋白酶可減輕豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，提高豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。4)增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力。菠蘿蛋白酶可提高仔豬抗腹瀉的能力[21]。5)參與動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，通過(guò)改變血液中某些成分改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能[22]。6)改善養(yǎng)殖環(huán)境。畜禽飼糧中添加蛋白酶可以極大程度降低肉雞糞便中氮的排放量[6]。

3 外源蛋白酶在豬、雞生產(chǎn)中的影響研究

3.1 外源蛋白酶對(duì)豬、雞生長(zhǎng)性能的影響

大量研究表明，蛋白酶能顯著提高肉雞的增重以及飼料轉(zhuǎn)化率，從而改善其生長(zhǎng)性能。Yu等[14]在玉米-豆粕型飼糧中添加125 mg/kg堿性蛋白酶(酶活性25 000 U/g)，肉雞1～21日齡、22～38日齡、1～38日齡的平均體重和飼料轉(zhuǎn)化率顯著提高。李東東等[2]在玉米-豆粕型飼糧中添加300 mg/kg堿性蛋白酶(酶活性100 000 U/g)，肉雞的21和42日齡平均體重及1～21日齡和1～42日齡平均日增重(average daily gain，ADG)顯著提高，1～21日齡料重比顯著降低。莊志偉等[23]在玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加500×10-6和600×10-6低溫堿性蛋白酶(來(lái)源于海洋細(xì)菌YS-80-122)，結(jié)果表明肉仔雞ADG分別增加了5.06%和3.98%，出欄均重分別提高了70和100 g，料重比分別降低了0.05和0.06。外源蛋白酶除了對(duì)玉米-豆粕型飼糧有作用效果外，對(duì)飼喂其他類型飼糧動(dòng)物的生長(zhǎng)性能也有改善作用。Mahmood等[24]在加工副產(chǎn)物型飼糧中添加200 mg/kg組合蛋白酶(含8 000 U/g酸性蛋白酶和12 000 U/g中性蛋白酶)，肉雞1～21日齡平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和ADG顯著增加，胴體率也顯著提高。然而，Purshotham等[7]在降低2%蛋白質(zhì)水平的玉米-豆粕型飼糧中添加6 000 U/kg的壓縮蛋白酶，肉雞整個(gè)生長(zhǎng)周期的ADFI和飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低。

豬飼糧中添加蛋白酶的效果報(bào)道不一。Stephenson等[25]在低賴氨酸的生長(zhǎng)豬玉米-豆粕-干酒糟及其可溶物(DDGS)型飼糧中添加500 mg/kg角蛋白酶(DP100)，1～131日齡的ADFI顯著提高，但屠體產(chǎn)量顯著下降。劉景環(huán)等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加300 mg/kg木瓜蛋白酶的飼糧組與未添加木瓜蛋白酶的對(duì)照組相比，仔豬ADFI增加了2.7%，ADG提高了2.56%，但是與對(duì)照組差異不顯著。O’Shea等[27]在生長(zhǎng)育肥豬的油菜粕-小麥-DDGS型飼糧中添加200 mg/kg蛋白酶，顯著提高了生長(zhǎng)育肥豬的ADG、ADFI和體重。然而，Mc Alpine等[28]在生長(zhǎng)豬的小麥糟-油菜粕-小麥-大麥型飼糧中添加200 mg/kg蛋白酶(酶活性75 000 U/g)，卻顯著降低了1～28日齡生長(zhǎng)豬的ADFI、ADG和末體重。

外源蛋白酶可降解餅粕類等蛋白質(zhì)原料中的特異性多肽，補(bǔ)充肉仔雞和仔豬消化道內(nèi)源蛋白酶分泌的不足，刺激內(nèi)源酶的分泌[29]，從而提高養(yǎng)分的消化利用率，促進(jìn)生長(zhǎng)性能的提高，但是動(dòng)物的年齡、飼糧類型、酶自身特性等因素會(huì)影響蛋白酶發(fā)揮作用[30]，外源蛋白酶對(duì)幼齡動(dòng)物生產(chǎn)性能的提高作用更明顯。

3.2 外源蛋白酶對(duì)豬、雞養(yǎng)分消化率的影響

蛋白酶可以分解飼糧中的大分子物質(zhì)，減輕飼料中抗?fàn)I養(yǎng)因子的作用，不僅可以提高蛋白質(zhì)、氨基酸等養(yǎng)分的消化利用率，也可提高飼料中其他養(yǎng)分的消化率。周梁[4]在玉米-豆粕-肉骨粉型基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg堿性蛋白酶(酶活性75 000 PROT/g，來(lái)源于地衣芽孢桿菌)，21日齡肉仔雞粗蛋白質(zhì)的表觀回腸消化率提高了5.92%，絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、脯氨酸的表觀回腸消化率也顯著提高。Fru等[12]在玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧中添加200 mg/kg堿性蛋白酶(酶活性75 000 PROT/g，來(lái)源于地衣芽孢桿菌)，蛋白質(zhì)、脂肪和能量的表觀回腸消化率分別提高了5.9%、2.5%、7.2%。Angle等[13]在降低粗蛋白質(zhì)水平的玉米-豆粕-玉米蛋白粉型飼糧中添加100～800 mg/kg的堿性蛋白酶(酶活性75 000 PROT/g，來(lái)源于地衣芽孢桿菌)，7～22日齡肉仔雞的粗蛋白質(zhì)以及精氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等大部分必需氨基酸和部分非必需氨基酸的消化率均顯著提高。Stefanello等[31]分別在肉雞豆粕和玉米-豆粕型半純合飼糧中添加15 000 U/g蛋白酶(酶活性75 000 PROT/g)，肉雞的必需氨基酸和非必需氨基酸的表觀回腸消化率均顯著提高，蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、能量的回腸末端和全消化道消化率也顯著增加。Freitas等[32]在肉雞玉米-豆粕-肉骨粉型飼糧中添加200 mg/kg蛋白酶(酶活性75 000 PROT/g)，粗蛋白質(zhì)和脂肪的回腸末端消化率顯著提高。Cowieson等[33]在肉雞小麥-豆粕型飼糧(含有植酸酶和木聚糖酶各100 mg/kg)中添加絲氨酸蛋白酶15 000 PROT/kg，顯著增加了氮、必需氨基酸、非必需氨基酸和總氨基酸的表觀回腸校正消化率。Mahmood等[34]在副產(chǎn)物型飼糧和玉米-雜粕-副產(chǎn)物型飼糧中添加200 mg/kg蛋白酶(含酸性蛋白酶8 000 U/g，堿性蛋白酶12 000 U/g)，肉雞的表觀代謝能、表觀氮校正代謝能、氮存留率和表觀氮消化率均顯著提高。張立蘭等[35]在肉仔雞玉米-豆粕型飼糧中分別添加75 000和150 000 PROT/g的外源蛋白酶(酶活性90 000 PROT/g，最適pH 7.0～10.0，來(lái)源于地衣芽孢桿菌)，利用仿生法測(cè)定養(yǎng)分消化率，結(jié)果表明全消化道的體外干物質(zhì)消化率、總能消化率和體外消化能均顯著提高，但肉仔雞22～42日齡飼糧胃消化階段的體外干物質(zhì)消化率和總能消化率卻顯著降低。

Pan等[36]在杜×長(zhǎng)×大三元雜交豬的玉米-豆粕型飼糧中添加200 mg/kg包被復(fù)合蛋白酶(8 000 U/g)，干物質(zhì)、總能、粗蛋白質(zhì)以及有機(jī)物的表觀全消化道消化率顯著提高，粗蛋白質(zhì)、氮以及多數(shù)必需氨基酸的表觀回腸消化率顯著提高。李建沅等[37]將2種酸性蛋白酶和1種中性蛋白酶按3∶3∶2質(zhì)量比混合(酶活性分別為88 000、59 000、129 000 U/g)，分別在魯煙白豬生長(zhǎng)豬的玉米-豆粕型、玉米-雜粕型、小麥-雜粕型飼糧中添加1 000 mg/kg的蛋白酶復(fù)合物，玉米-豆粕型飼糧的粗蛋白質(zhì)消化率與對(duì)照組相比差異不顯著，另外2種類型飼糧的養(yǎng)分消化率顯著增加。Wang等[38]在生長(zhǎng)豬的玉米-豆粕型飼糧中添加500和1 000 mg/kg的角蛋白酶，粗蛋白質(zhì)以及賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸和蘇氨酸等氨基酸的表觀回腸消化率均顯著提高。葉慧等[39]將酸性蛋白酶(酶活性≥50 000 U/g，來(lái)源于黑曲霉)和中性蛋白酶(來(lái)源于枯草桿菌)添加到仔豬玉米-全脂大豆-乳清粉型飼糧中，結(jié)果表明能量表觀消化率提高了6.08%，粗蛋白質(zhì)表觀消化率提高了7.53%。

相比于普通的玉米-豆粕型飼糧，外源蛋白酶在雜粕型飼糧中作用效果更明顯。外源蛋白酶主要能提高必需氨基酸的消化率，除此之外還能提高部分非必需氨基酸、粗蛋白質(zhì)和能量的消化率。Mahagna等[40]研究表明，外源蛋白酶的添加可能會(huì)抑制內(nèi)源酶活性。張立蘭等[36]研究表明，外源蛋白酶的最適pH會(huì)影響酶促反應(yīng)。中性、堿性蛋白酶在動(dòng)物胃中的活性可能會(huì)受到抑制，甚至可能會(huì)被降解。因此，在選擇外源蛋白酶時(shí)，除了要考慮飼糧類型、動(dòng)物年齡、酶自身性質(zhì)外，還要考慮內(nèi)源酶與外源酶的互作效應(yīng)。

3.3 外源蛋白酶對(duì)豬、雞健康的影響

幼齡動(dòng)物消化系統(tǒng)不完善，消化不良時(shí)有發(fā)生。外源蛋白酶可以補(bǔ)充幼齡動(dòng)物內(nèi)源酶分泌的不足，提高蛋白質(zhì)的消化吸收，降低后段腸道消化吸收蛋白質(zhì)的壓力，從而減少因消化不良引起的腹瀉。外源蛋白酶的添加能緩解動(dòng)物冷熱應(yīng)激和斷奶應(yīng)激，增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體的免疫力。蛋白質(zhì)消化率的提高可降低腎臟排泄尿素或尿酸鹽的負(fù)擔(dān)，從整體上改善豬、雞的健康狀況，但研究結(jié)果報(bào)道也不盡一致，甚至有負(fù)效應(yīng)的結(jié)果。

3.3.1 外源蛋白酶對(duì)雞健康的影響

趙必遷等[41]在羅曼粉殼蛋雞產(chǎn)蛋后期玉米-豆粕型飼糧降低粗蛋白質(zhì)水平下，外源添加中性蛋白酶200 mg/kg(酶活性10 000 U/kg)，蛋雞死亡率顯著降低。Peek等[42]在玉米-小麥-豆粕型飼糧中添加25 000 U/kg蛋白酶(酶活性558 700 U/mL，來(lái)源于地衣芽胞桿菌)，結(jié)果表明蛋白酶對(duì)艾美耳球蟲(chóng)病感染的肉雞體重有顯著的提升作用，表明蛋白酶可以緩解艾美耳球蟲(chóng)病對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能帶來(lái)的不利影響。Giannenas等[3]在低粗蛋白質(zhì)水平(20%)的玉米-玉米麩-小麥麩型飼糧中添加200 mg/kg蛋白酶，盲腸和回腸中產(chǎn)氣莢膜梭菌以及盲腸中壞死梭桿菌數(shù)量顯著降低，蛋白酶的添加降低了腸道中有害菌的數(shù)量，說(shuō)明蛋白酶可促進(jìn)肉雞腸道健康。李慧[43]在肉仔雞的小麥型基礎(chǔ)飼糧中添加32 000 U/kg的蛋白酶(酶活性12 220 U/g)，肉仔雞的十二指腸絨毛高度與隱窩深度的比值顯著降低，該結(jié)果表明，高劑量的蛋白酶對(duì)腸道組織形態(tài)有不利的影響。王琤韡等[44]在三黃雞玉米-豆粕-棉籽粕-次粉型飼糧中添加125 m/kg PT125TM復(fù)合蛋白酶，三黃雞血清中的丙二醛(MDA)含量顯著降低，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性顯著升高，說(shuō)明外源蛋白酶的添加提高了三黃雞抗熱應(yīng)激和抗氧化的能力。

3.3.2 外源蛋白酶對(duì)豬健康的影響

謝梅冬等[45]在保育豬飼糧中添加1 000 mg/kg金屬蛋白酶，仔豬的咳嗽率、腹瀉率和死亡率分別比對(duì)照組降低了7.66%、3.33%和3.33%。梅寧安等[46]在仔豬基礎(chǔ)飼糧中添加100 mg/kg蛋白酶(酶活性≥50 000 U/g)，仔豬的抗腹瀉能力和生長(zhǎng)性能得到顯著提高。Kim等[47]的研究表明，在玉米-豆粕型低蛋白質(zhì)水平(23.51%)飼糧中添加200 mg/kg的蛋白酶(酶活性75 000 U/g，來(lái)源于地衣芽孢桿菌)，斷奶3 d的仔豬血液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)含量顯著低于對(duì)照組，斷奶7 d的仔豬血液中白細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組，斷奶7和14 d仔豬血液中的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量有低于對(duì)照組的趨勢(shì)，說(shuō)明外源蛋白酶的添加可以降低斷奶仔豬的炎癥反應(yīng)。

3.4 蛋白酶對(duì)環(huán)境排放的影響

動(dòng)物飼糧中的蛋白質(zhì)未被完全消化的部分會(huì)隨糞便和尿液排出體外，并在環(huán)境中分解為氨氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽。氨氣揮發(fā)到大氣中可導(dǎo)致酸雨，硝酸鹽和亞硝酸鹽則會(huì)污染水源和土壤，直接或間接的威脅人類健康。Ghazi等[48]在豆粕中添加曲霉屬真菌源的蛋白酶，在pH 4.5的酸性環(huán)境中50 ℃孵化2 h后，按照290 mg/kg添加到飼糧中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉仔雞氮的表觀回腸消化率和全消化道的表觀存留率顯著增加。Wang等[49]在肉雞的豆粕型和雜粕型飼糧中添加1 000 mg/kg角蛋白酶(400 000 U/g)，2種飼糧中氮的存留率均顯著增加。Pan等[36]研究表明，外源蛋白酶的添加顯著降低了糞氮的排放(3.7 vs. 4.7 g/d)，有降低尿氮排放的趨勢(shì)(2.9 vs. 4.7 g/d)，氮的存留率顯著增加(0.73% vs. 0.61%)。蛋白酶可增加蛋白質(zhì)原料的消化吸收，提高蛋白質(zhì)和氨基酸的消化利用率，從而減少氮的壞境排放。Leinonen等[6]根據(jù)生命周期評(píng)估(life cycle assessment，LCA)系統(tǒng)研究了蛋白酶在作物種植、飼料生產(chǎn)、肉雞飼養(yǎng)(水和能量使用、氣體排放)、肥料與廢棄物管理等各方面對(duì)環(huán)境的影響，結(jié)果表明蛋白酶的使用可以減少蛋白質(zhì)類飼料的使用，減少大豆的種植，降低了二氧化碳等溫室氣體的排放(最多降低12%，平均降低5%)。Oxenboll等[50]根據(jù)LCA針對(duì)飼料生產(chǎn)、肉雞出欄、糞便利用等畜禽生產(chǎn)的所有步驟對(duì)蛋白酶應(yīng)用于家禽飼料是否會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生影響的問(wèn)題進(jìn)行了專門探究，在肉雞的玉米-豆粕-肉骨粉型飼糧中添加200 mg/kg外源蛋白酶(酶活性15 000 PROT/kg)，結(jié)果表明降低了氨氣、一氧化二氮和一氧化氮等氣體的排放，在降低蛋白質(zhì)水平的飼糧中添加蛋白酶效果更明顯。此外，還顯著降低了酸化、富營(yíng)養(yǎng)化以及溫室氣體的排放。綜合所有因素表明，飼糧中添加蛋白酶可以提高蛋白質(zhì)和氮的利用，減少銨鹽的排放，減輕糞污對(duì)大氣、水和土壤的污染。

4 外源蛋白酶研究存在的問(wèn)題

目前外源蛋白酶的研究還存在很多不足：1)產(chǎn)酶菌種類不多(主要是枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌)，產(chǎn)酶菌發(fā)酵產(chǎn)生的蛋白酶性質(zhì)不穩(wěn)定，酶活性參差不齊；2)微生物蛋白酶研究較多的是堿性蛋白酶和金屬蛋白酶，pH作用范圍較狹窄，不同蛋白酶在畜禽消化道的作用位點(diǎn)及其與內(nèi)源酶的關(guān)系研究不夠深入；3)酶活性測(cè)定方法、動(dòng)物試驗(yàn)條件等不一致，蛋白酶添加劑量的研究結(jié)果缺乏可信度。

Saarelainen等[51]和Saleh等[52]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有蛋白酶存在時(shí)，碳水化合物酶的水解活性會(huì)受到抑制或碳水化合物酶自身被消化，篩選最佳酶譜非常重要[53]。因此飼用蛋白酶的有效性評(píng)價(jià)研究需要通過(guò)體外法模擬蛋白酶不同濃度、不同pH、不同來(lái)源的組合作用和在不同類型、不同比例的飼糧中添加蛋白酶的作用效果，找出節(jié)約蛋白酶資源并提高其催化效率的最佳組合，再開(kāi)展動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)仿生方法模擬蛋白酶在動(dòng)物體內(nèi)的消化過(guò)程[36]，確定蛋白酶在動(dòng)物體內(nèi)的作用部位(胃、小腸還是大腸)，探討通過(guò)蛋白酶包埋等技術(shù)使蛋白酶直達(dá)作用位點(diǎn)，防止外源蛋白酶被內(nèi)源酶分解或者活性受抑制；亦可從分子水平找到不同蛋白酶的作用受體，通過(guò)提高酶與受體結(jié)合能力來(lái)提高酶促反應(yīng)效率等途徑進(jìn)一步深入研究。

總之，飼用蛋白酶產(chǎn)酶菌及酶制劑的生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、使用的各個(gè)階段都還有很多工作有待深入。生產(chǎn)方面，可以開(kāi)發(fā)新型產(chǎn)酶菌種，生產(chǎn)耐高溫、耐酸的蛋白酶，探究提高各種產(chǎn)酶菌的產(chǎn)量和蛋白酶質(zhì)量的新方法；加工過(guò)程中，選擇合適的材料(硫酸鈉、糊精等)對(duì)蛋白酶進(jìn)行包被，提高生產(chǎn)效率，使用過(guò)程中也可以抵抗動(dòng)物胃酸對(duì)蛋白酶的損傷；在酶活性測(cè)定、酶的添加和使用等方面也有待完善。此外，目前市場(chǎng)上廣泛使用的是轉(zhuǎn)基因工程菌生產(chǎn)的酶，而目前我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因飼用酶安全性評(píng)價(jià)的必要性缺乏統(tǒng)一認(rèn)識(shí)，雖然歐盟等國(guó)家制訂了一系列轉(zhuǎn)基因食品、飼料等生產(chǎn)和使用相關(guān)法規(guī)，但并沒(méi)有涉及到轉(zhuǎn)基因工程菌生產(chǎn)的酶的安全性評(píng)價(jià)的制度與標(biāo)準(zhǔn)，我們需要建立統(tǒng)一的轉(zhuǎn)基因蛋白酶的安全性評(píng)價(jià)體系。

5 結(jié) 語(yǔ)

隨著飼用蛋白酶制劑研究的不斷深入，其提高蛋白質(zhì)等養(yǎng)分消化利用率、改善動(dòng)物生長(zhǎng)性能、節(jié)約蛋白質(zhì)原料的優(yōu)點(diǎn)逐漸被人重視，外源蛋白酶也越來(lái)越受到養(yǎng)殖企業(yè)和飼料企業(yè)的關(guān)注，微生物源性蛋白酶因其生產(chǎn)成本低、功能明確及環(huán)境友好的特征，成為其中最具有發(fā)展前景的一員。

致謝：

感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所張宏福研究員對(duì)本文的審閱、指正。

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