徐建萍 李國平 吳 瑋 傅曉萌 鄭金源 李 丹 林東紅

(福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，福州 350004)

c-KIT，屬于Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族，位于人類染色體4q11～12上，基因序列高度保守，其mRNA大約5 084 bp。c-KIT作為干細(xì)胞因子的受體,可通過一系列信號通路參與造血干細(xì)胞增殖分化的調(diào)控[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)c-KIT基因突變，特別是激活性突變是導(dǎo)致以染色體 t(8；21)及 inv16為特征的核心結(jié)合因子急性髓系白血病(Core binding factor-acute myeloid leukemia，CBF-AML)患者預(yù)后不良的主要因素[2，3]。這些突變主要存在于8 和17號外顯子，其中17號外顯子酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的激活環(huán)(A-loop)中的D816V和N822K突變頻繁，并與CBF-AML不良預(yù)后密切相關(guān)[4-6]。目前國內(nèi)外對A-loop環(huán)的機(jī)制研究主要集中在c-KIT D816V突變[7，8]，而關(guān)于N822K突變的研究則鮮見報(bào)道，已有的研究報(bào)道也主要集中在臨床樣本突變檢出率及預(yù)后相關(guān)性[6,9，10]，其在CBF-AML中的生物學(xué)作用和可能機(jī)制尚不明確。

基于此，本課題組前期開展了c-KIT N822K突變對AML細(xì)胞生物學(xué)影響的研究，發(fā)現(xiàn)在AML中位于A-loop環(huán)的N822K突變可使c-KIT發(fā)生干細(xì)胞因子非依賴性結(jié)構(gòu)性激活；N822K突變的AML細(xì)胞對多靶點(diǎn)的受體酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼(Sunitinib)更敏感，較低濃度的舒尼替尼即可抑制其克隆形成和發(fā)生G0/G1期阻滯；然而流式凋亡檢測結(jié)果卻顯示N822K突變AML細(xì)胞的凋亡率遠(yuǎn)低于無N822K突變的AML細(xì)胞，但其相關(guān)的凋亡分子機(jī)制尚不清楚，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步通過Western blot在蛋白水平研究c-KIT N822K突變對舒尼替尼誘導(dǎo)的AML細(xì)胞凋亡的影響，并探討其相關(guān)的分子機(jī)制，以期為N822K突變作為干預(yù)CBF-AML治療預(yù)后靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 舒尼替尼購自美國Pfizer公司，β-actin抗體購自Bioworld公司，Bcl-2、Bax、c-myc、p-mTOR抗體購自Abcam公司，Actived-Caspase-3、PARP、Akt、PI3K抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Cyto C、Caspase-9抗體購自碧云天生物技術(shù)研究所，p-Akt、4EBP1、p-4EBP1、p-PI3K、mTOR抗體購自美國Signalway Antibody公司。

1.1.2主要儀器及器材 超凈工作臺購自香港Heal Force公司，低溫高速臺式離心機(jī)購自美國Thermo Fisher公司，低溫冰箱購自美國Thermo Fisher公司，電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置(DYC40C)購自美國Bio-Rad 公司，微量加樣器購自Eppendorf公司。

1.1.3細(xì)胞來源與培養(yǎng) Kasumi-1細(xì)胞為復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院血液科劉立根教授惠贈、HL-60、NB4細(xì)胞為福建省血液病研究所提供。經(jīng)測序確定為c-KIT N822K突變型的急性髓系白血病Kasumi-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，用含20%Hyclone胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)；經(jīng)測序確定未發(fā)生c-KIT N822K突變的急性髓系白血病HL-60、NB4細(xì)胞作為對照組，分別用含15%和10%天津?yàn)笊镉邢薰咎ヅＱ宓腞PMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。均置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d 換液一次，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1干預(yù)處理 取對數(shù)生長期的各株細(xì)胞，用0、0.04、0.16、0.64 μmol/L的舒尼替尼分別與細(xì)胞共同孵育24 h。其中，舒尼替尼濃度組包括：0.04、0.16、0.64 μmol/L的藥物濃度組；0 μmol/L為未加藥對照組。各濃度組種2瓶，15 ml/瓶，以保證收集到足夠的細(xì)胞數(shù)以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2Western blot檢測細(xì)胞中蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，約5×105個/組，PBS洗滌細(xì)胞2次，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，BCA法定量。Western blot操作方法見文獻(xiàn)[11]。采用 Gel-Pro analyzer 軟件系統(tǒng)對膠片進(jìn)行圖像掃描和分析，目的蛋白的相對表達(dá)量為目的條帶與β-actin的灰度值之比。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1凋亡相關(guān)蛋白Western blot檢測結(jié)果 用0、0.04、0.16、0.64 μmol/L的舒尼替尼分別與Kasumi-1、HL-60及NB4細(xì)胞共同孵育24 h后，檢測線粒體參與的內(nèi)源性凋亡通路。如圖1、2所示，隨著舒尼替尼濃度的增加，HL-60及NB4細(xì)胞均出現(xiàn)促凋亡蛋白Bax、Cyto C、Caspase-9、Actived-Caspase-3、PARP上調(diào)(P<0.05)，抗凋亡蛋白 Bcl-2下調(diào)(P<0.01)，基本都在0.04 μmol/L濃度組就開始變化。但在具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞中這些蛋白的增高趨勢則明顯減弱，Bax、Cyto C、Caspase-9等蛋白直到最高濃度0.64 μmol/L組才開始出現(xiàn)較明顯的改變(P<0.05)。HL-60及NB4細(xì)胞中凋亡最終執(zhí)行者Actived-Caspase-3蛋白及其作用底物PARP的89 kD剪接體也出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.05)；但Kasumi-1細(xì)胞0.64 μmol/L組，PARP的89 kD剪接體仍無明顯變化(P>0.05)。同時檢測的原癌基因c-myc 蛋白可發(fā)現(xiàn)，Kasumi-1細(xì)胞c-myc蛋白在0.04 μmol/L濃度組出現(xiàn)下調(diào)(P<0.01)，具有明顯的劑量依賴性；而對照組HL-60和NB4細(xì)胞只在最高濃度0.64 μmol/L出現(xiàn)明顯下調(diào)(P<0.01)。

2.2PI3K/Akt/mTOR通路Western blot檢測結(jié)果 用0、0.04、0.16、0.64 μmol/L的舒尼替尼分別與Kasumi-1、HL-60及NB4細(xì)胞共同孵育24 h后，檢測PI3K/Akt/mTOR通路蛋白。如圖3、4所示，隨著舒尼替尼濃度的增加，具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞PI3K/Akt通路的磷酸化蛋白p-PI3K、p-Akt、p-4EBP1在其各自總蛋白中的比例與0 μmol/L 濃度組有明顯差異(P<0.05)，出現(xiàn)典型的劑量依賴性下調(diào)，尤其是p-PI3K和p-Akt 蛋白在0.04 μmol/L濃度組就開始下調(diào)(P<0.01)；但對照組HL-60及NB4細(xì)胞隨著舒尼替尼濃度的增加其p-PI3K、p-4EBP1的表達(dá)與0 μmol/L濃度組無明顯變化(P>0.05)，p-Akt 蛋白在0.64 μmol/L濃度上調(diào)(P<0.05)。此外，在對此通路的重要下游分子mTOR檢測時發(fā)現(xiàn)，具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞隨著舒尼替尼濃度的增大，mTOR蛋白磷酸化的水平明顯下調(diào)(P<0.01)；而對照組HL-60和NB4細(xì)胞的mTOR蛋白磷酸化水平無明顯變化(P>0.05)。

圖1 不同濃度舒尼替尼作用24 h后三株細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of apoptosis-related proteins of three cells treated by different concentrations of Sunitinib for 24 h Note: A.0 μmol/L；B.0.04 μmol/L；C.0.16 μmol/L；D.0.64 μmol/L.

圖2 不同濃度舒尼替尼作用24 h后三株細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of apoptosis-related proteins of three cells treated by different concentrations of Sunitinib for 24 hNote: *.P<0.05,**.P<0.01.

圖3 不同濃度舒尼替尼作用24 h后三株細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of PI3K/Akt/mTOR proteins of three cells treated by different concentrations of Sunitinib for 24 hNote: A.0 μmol/L；B.0.04 μmol/L； C.0.16 μmol/L；D.0.64 μmol/L.

圖4 不同濃度舒尼替尼作用24 h后三株細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路蛋白的相對表達(dá)量Fig.4 Relative expression of PI3K/Akt/mTOR proteins of three cells treated by different concentrations of Sunitinib for 24 hNote: *.P<0.05；**.P<0.01.

3 討論

CBF-AML是一群特殊的FAB分型為 M2 和 M4Eo 亞型的AML亞群，占 AML 患者5%～8%，其主要特征是8號和21號染色體異位t(8;21)(q22;q22)和16號染色體倒位inv(16) (p13q22)/t(16，16) (p13;q22)[12]。細(xì)胞遺傳學(xué)預(yù)后分組中，CBF-AML被認(rèn)為是預(yù)后較好的一種白血病類型[13]。

近年大量研究發(fā)現(xiàn)，c-KIT基因突變是導(dǎo)致CBF-AML 患者預(yù)后不良的主要因素[2，3]。c-KIT突變在隨機(jī)急性髓系白血病(AML)案例中出現(xiàn)的頻率只有2%～6.9%，但在高頻率的CBF-AML中，高達(dá)48%[14-16]。在所有c-KIT突變中，TK2區(qū)域尤其是A-loop環(huán)處的突變檢出頻率明顯高于其他區(qū)域，而A-loop環(huán)中又以D816V和N822K突變與總生存期(Overall survival，OS)有顯著負(fù)相關(guān)[5]且突變率高。美國 NCCN(National Compre-hensive Cancer Network)指南已將D816V突變列為AML的重要預(yù)后指標(biāo)。隨著研究的深入，N822K突變也因其可導(dǎo)致AML 患者復(fù)發(fā)率高、治愈率低引起了人們的關(guān)注[9]。

眾所周知，Kasumi-1細(xì)胞是從M2亞型的AML患者外周血中分離建株的[17]，并且具有c-KIT第822個密碼子(N822K)的點(diǎn)突變[18]，可作為CBF-AML和c-KIT N822K突變研究的最合適的細(xì)胞模型。Beghini等[19]研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶抑制劑——甲磺酸伊馬替尼(imatinib mesilate，商品名：格列衛(wèi))，可抑制c-KIT活性，誘導(dǎo)增殖抑制和具有c-KIT N822K突變的細(xì)胞凋亡。但其在包括Kasumi-1在內(nèi)的AML細(xì)胞內(nèi)藥物積累量低于舒尼替尼，故舒尼替尼敏感性更高[20]。Ikezo等[21]篩查各種惡性血液病細(xì)胞時也發(fā)現(xiàn)舒尼替尼對于具有酪氨酸激酶激活突變的白血病細(xì)胞，包括EOL-1、MV4-11和Kasumi-1細(xì)胞有很強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡能力。因此，本課題組前期通過17外顯子測序確認(rèn)具有N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，選擇經(jīng)確認(rèn)無N822K突變的HL-60和NB4作為對照細(xì)胞，選取舒尼替尼作為c-KIT抑制劑，研究N822K突變對c-KIT抑制劑誘導(dǎo)AML細(xì)胞凋亡的影響，其對生物學(xué)特性影響的相關(guān)結(jié)果已總結(jié)論文待發(fā)表。其中，流式凋亡檢測結(jié)果顯示，隨著舒尼替尼濃度從0 μmol/L增加到0.80 μmol/L，Kasumi-1細(xì)胞的凋亡率從(19.41±1.83)%上升到(33.30±4.36)%(P<0.05)，而無N822K突變的HL-60和NB4細(xì)胞其凋亡率分別上升到87.85% 和43.97%。可見舒尼替尼抑制c-KIT活性后，具有N822K突變AML細(xì)胞的凋亡率明顯低于無N822K突變的AML細(xì)胞，因此，本研究擬進(jìn)一步探討其相關(guān)的凋亡分子機(jī)制。

我們首先檢測了caspase通路的凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示隨著舒尼替尼濃度的增加，對照組HL-60及NB4細(xì)胞出現(xiàn)線粒體參與的內(nèi)源性凋亡通路蛋白的典型變化：Bcl-2下調(diào)及Bax上調(diào)促進(jìn)Cyto C的釋放，Caspase-9被活化，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡最終執(zhí)行者Caspase-3，剪切底物PARP，最終導(dǎo)致DNA被裂解，細(xì)胞凋亡；而具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞這種趨勢變化則明顯減弱。同時檢測可促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期的c-myc 蛋白時發(fā)現(xiàn)，Kasumi-1細(xì)胞原癌基因c-myc出現(xiàn)了明顯的劑量依賴性下調(diào)，而對照組HL-60和NB4細(xì)胞只在最高濃度0.64 μmol/L組出現(xiàn)明顯下調(diào)。以上結(jié)果與我們前期對生物學(xué)特性改變的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步表明可能由于N822K突變誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)性激活的存在，使Kasumi-1細(xì)胞對舒尼替尼凋亡誘導(dǎo)作用及增殖抑制的反應(yīng)不同于無N822K突變的HL-60及NB4細(xì)胞。

有研究表明，c-KIT D816v突變最明顯的通路改變是PI3K/Akt通路，該通路主要作用是抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，從而促進(jìn)細(xì)胞的生存和增殖[22]。因此我們設(shè)想，在c-KIT N822K突變的AML細(xì)胞中也存在PI3K/Akt通路的變化，并影響舒尼替尼對其凋亡誘導(dǎo)作用。通過進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著舒尼替尼濃度的增加，具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞出現(xiàn)了磷酸化p-PI3K、p-Akt、p-4EBP1劑量依賴性下調(diào)；但對照組HL-60及NB4細(xì)胞對PI3K/Akt通路蛋白的抑制作用則較弱。分析其原因可能是：Kasumi-1細(xì)胞具有N822K突變而出現(xiàn)c-KIT結(jié)構(gòu)性激活，細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt通路處于高活性狀態(tài)，因而對舒尼替尼的酪氨酸激酶抑制作用尤其敏感；而無c-KIT結(jié)構(gòu)性激活作用的對照組HL-60及NB4細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)PI3K/Akt通路本身為低活性，故對較低濃度的抑制劑不敏感，PI3K/Akt通路磷酸化蛋白下調(diào)現(xiàn)象不明顯。

尤其值得一提的是，在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，作為PI3K/Akt通路一個重要的下游分子mTOR，具有c-KIT N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞隨著舒尼替尼濃度的增大，mTOR分子磷酸化蛋白被明顯抑制，其促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換的能力也可能因此被削弱，而出現(xiàn)舒尼替尼劑量依賴性的G0/G1期阻滯；而對照組的HL-60和NB4細(xì)胞mTOR磷酸化蛋白抑制作用不明顯，G0/G1期阻滯作用也不明顯。

綜上所述，舒尼替尼對具有c-KIT N822K突變的AML細(xì)胞的G0/G1周期阻滯和增殖抑制作用可能是通過c-myc 蛋白和mTOR分子共同發(fā)揮作用的；抑制N822K突變引起的c-KIT結(jié)構(gòu)性激活可能經(jīng)抑制PI3K/Akt/mTOR通路，而削弱舒尼替尼對Kasumi-1細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

本課題組前期研究表明，在舒尼替尼作用下，Kasumi-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖抑制和周期阻滯與其低凋亡率不符，因此我們思考除凋亡外，N822K突變的Kasumi-1細(xì)胞是否還通過其他方式死亡？本研究通過對凋亡相關(guān)蛋白和PI3K/Akt/mTOR通路蛋白水平檢測發(fā)現(xiàn)舒尼替尼作用后的Kasumi-1細(xì)胞出現(xiàn)明顯的mTOR抑制。Willems等[23]最近的研究成果引起了我們的高度關(guān)注，其在研究移植AML細(xì)胞的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抑制mTOR可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬，在此過程中有顯著的自噬和部分凋亡發(fā)生，小鼠存活率明顯升高。那么，我們用舒尼替尼作用后的Kasumi-1細(xì)胞是否也是發(fā)生了自噬呢？有待進(jìn)一步深入研究。

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