小麥谷氨酰胺合成酶的原核表達(dá)特點(diǎn)

谷明鑫，韋一昊，賈喜婷，熊淑萍，馬新明，王小純,,3

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002

2 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002

3 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)因遺傳背景清晰、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、成本低、產(chǎn)量高、表達(dá)產(chǎn)物純化過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)物穩(wěn)定性好及不易污染等優(yōu)點(diǎn)，成為基因工程中應(yīng)用最廣泛的原核表達(dá)系統(tǒng)，取得了巨大的科研價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益[1-3]。但原核表達(dá)也存在一些缺點(diǎn)，表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體形式存在，部分真核基因表達(dá)量低，而且由于缺乏翻譯后加工修飾機(jī)制，表達(dá)產(chǎn)物生物活性低等[4-6]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的局限性目前已有一些相應(yīng)的解決方法，如攜帶pRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌株Rosetta，補(bǔ)充了稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，可提高稀有密碼子多的真核基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)量[7-8]；通過(guò)改變5′端的稀有密碼子降低翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，促進(jìn)核糖體與mRNA結(jié)合，增強(qiáng)翻譯起始效率以提高表達(dá)量[9]；通過(guò)降低誘導(dǎo)溫度[10]，或通過(guò)融合表達(dá)增加目的蛋白溶解性。雷榮悅等將人源BMP6分別與5種融合標(biāo)簽構(gòu)建重組表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)只有 MBP能增強(qiáng)rhBMP6的溶解性[11]。

谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS)是植物氮素同化的關(guān)鍵酶[12]，依據(jù)細(xì)胞定位分為胞液型GS (GS1) 和質(zhì)體型GS (GS2) 兩大類，它們?cè)谧魑锷L(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成中具有重要作用[13]。栽培小麥的胞液型 GS1有 TaGS1(TaGS1.1)、TaGSr (TaGS1.2) 和 TaGSe (TaGS1.3)三種，基因序列同源性 65%–75%，氨基酸序列同源性約80%，亞基約39 kDa；質(zhì)體型GS只有TaGS2一種，與 GS1基因序列同源性為 50%–60%，與GS1氨基酸序列同源性為 70%–75%，亞基約42 kDa[14-15]。GS同工酶在植物氮素代謝中功能不同，TaGS1和TaGSr主要參與小麥衰老葉片的氮素再利用[16]；大麥根部 HvGSe能緩解高濃度NH4+的毒害，籽粒 HvGSe參與種子發(fā)育過(guò)程中的氮素同化[17]；GS2則參與光呼吸釋放 NH4+和硝酸根還原產(chǎn)生 NH4+的同化[18]。深入研究小麥GS同工酶結(jié)構(gòu)及其調(diào)控機(jī)制有助于闡明提高小麥氮素利用效率的理論基礎(chǔ)，但是GS同工酶氨基酸序列，尤其是胞液型GS同工酶氨基酸序列同源性太高，在蛋白質(zhì)水平難以區(qū)分，目前基因特異性表達(dá)分析多局限在mRNA水平上。小麥組織中 GS同工酶量低，加之胞液型GS同工酶難以區(qū)分，從小麥中純化GS同工酶難以滿足深入研究的需求。在原核細(xì)胞中表達(dá)GS同工酶，可獲得足量的高純度的酶蛋白，便于進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，或篩選特異性抗體開(kāi)展特異性表達(dá)或免疫組化等深入研究。

本研究利用無(wú)縫克隆技術(shù)將小麥GS同工酶TaGS1、TaGSr、TaGSe、TaGS2的編碼區(qū)基因序列及TaGS2前體TaGS2p的編碼區(qū)基因序列 (含葉綠體定位的信號(hào)肽的基因序列) 插入 pET-21a表達(dá)載體，分析了小麥GS 在原核細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)及其原因，探索了GS同工酶可溶性表達(dá)的條件，為研究小麥GS同工酶結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和菌株

菌株Escherichia coliDH5α和Rosetta、載體pET-21a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 克隆載體構(gòu)建

從 NCBI獲得小麥 GS1 (DQ124209)、GSr(AY491968)、GSe (AY491970) 及 GS2p (DQ124212)基因序列，設(shè)計(jì)特異性克隆引物 (表1)，提取葉片、籽粒等不同部位 RNA，利用 HiscriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme) 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板，利用Phanta EVO Super-Fidelity DNA Polymerase (TaKaRa) 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，GS1 67 ℃/GSr 51 ℃ /GSe 60 ℃ /GS2p 57 ℃退火15 s，72 ℃延伸35 s，循環(huán)35次后 72℃延伸 7 min。利用 Mini BEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0(TaKaRa) 純化擴(kuò)增產(chǎn)物，然后連接T載體，轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽(yáng)性克隆送華大基因公司測(cè)序鑒定。

表1 GS同工酶克隆的特異性引物Table 1 The specific cloning primers of GS isoenzymes

1.3 表達(dá)載體構(gòu)建

據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)無(wú)縫克隆引物 (表 2)。以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性 15 s，72 ℃退火 25 s，72 ℃延伸 35 s，30個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物純化后，使用Clon Express One Step Cloning Kit (Vazyme)構(gòu)建 pET-21a重組載體，轉(zhuǎn)化 DH5α，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。提取pET-21a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Rosetta，挑取陽(yáng)性單克隆，接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基 (含1 mmol/L羧芐青霉素Car、34 μg/mL氯霉素Cm)，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，將菌種分管保存于–80 ℃。

1.4 GS同工酶原核表達(dá)

取上述菌種5 μL接入5 mL LB液體培養(yǎng)基 (含1 mmol/L Car、34 μg/mL Cm)，于 37 ℃、220 r/min過(guò)夜活化。取活化菌液4 mL接入100 mL LB液體培養(yǎng)基 (含上述濃度抗生素)，擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600達(dá)0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度1 mmol/L。分別于30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)3 h、5 h、7 h后取樣10 mL，離心收集菌體，用1 mL裂解液 (含10 mmol/L Tris, 10 mmol/L MgCl2，0.05% Triton X-100，100 μg/mL PMSF，pH 7.5) 懸浮菌體，超聲波破碎后于4 ℃、13 000 r/min離心30 min，取出上清；沉淀用 1 mL裂解液懸浮。利用SDS-PAGE分離菌體裂解液、菌體裂解液上清和沉淀中的蛋白質(zhì)，利用Quantity One分析目的蛋白含量。在37 ℃、30 ℃、25 ℃、16 ℃等不同溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，并利用SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)菌體裂解液上清和沉淀中的蛋白表達(dá)情況，以確定最佳誘導(dǎo)條件。

表2 GS同工酶無(wú)縫克隆引物Table 2 One step cloning primers of GS isoenzymes

1.5 RNA提取和RT-qPCR分析

取誘導(dǎo)3 h后的上述菌液1 mL，離心沉淀菌體，用細(xì)菌總 RNA提取試劑盒 (生工生物工程(上海) 有限公司) 提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得相應(yīng)的cDNA。利用 SYBR Green Mix (Vazyme) 進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃變性 15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)，利用iQ5 Multicolor Real-Time PCR Detection system(Bio-Rad) 檢測(cè)產(chǎn)物熒光信號(hào) (引物見(jiàn)表 3)。以E.coliRecA基因?yàn)閮?nèi)參，采用2–ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用RNA Structure 5.3對(duì)GS同工酶重組載體翻譯起始區(qū)100 nt (–30 nt–+70 nt) 的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和自由能 (ΔG) 進(jìn)行分析預(yù)測(cè)[19-20]。

1.7 Western blotting鑒定GS同工酶

利用SDS-PAGE分離蛋白樣品，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，利用小麥GS多克隆抗體檢測(cè)GS同工酶的特異表達(dá)，使用 Bio-Rad Clarity Western ECL試劑盒顯色[21-22]，用 Chemi DocTMXRS+Imaging System (Bio-Rad) 掃描試驗(yàn)結(jié)果。

1.8 酶活測(cè)定

分別挑3個(gè)含GS同工酶的陽(yáng)性克隆，在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)，取10 mL菌液離心，沉淀菌體加入1 mL裂解液懸浮，超聲破碎后離心取上清 (方法同前) 測(cè)定GS酶活[23]。

表3 GS同工酶qPCR引物Table 3 qPCR primers of GS isoenzymes

2 結(jié)果與分析

2.1 GS同工酶在大腸桿菌中的表達(dá)特點(diǎn)

30 ℃下，GS同工酶在Rosetta菌株中表達(dá)特點(diǎn)各不相同 (圖1A)。與誘導(dǎo)前 (0) 相比，誘導(dǎo)后GS1和GSr在約41 kDa處出現(xiàn)大量特異表達(dá)的蛋白，與融合蛋白理論值一致，且GS1于誘導(dǎo)7 h后表達(dá)量達(dá)最大，約占細(xì)菌總蛋白的22%；GSr于誘導(dǎo)3 h后表達(dá)量達(dá)最大，約占菌體總蛋白的15%。GSe在41 kDa處出現(xiàn)一條微弱的蛋白帶，與融合蛋白理論值一致。GS2在44 kDa處出現(xiàn)誘導(dǎo)蛋白帶，與融合蛋白理論值一致，且誘導(dǎo)后3–7 h差異不大，約占細(xì)菌總蛋白的12%。GS2p沒(méi)有出現(xiàn)特異的誘導(dǎo)蛋白帶。Western blotting進(jìn)一步證明，GSe的確微量表達(dá)，而 GS2p無(wú)表達(dá) (圖 1B)。可見(jiàn)，高度同源的GS同工酶在原核細(xì)胞中的表達(dá)水平存在明顯差異，這些差異可能與基因序列的差異有關(guān)。

2.2 GS同工酶在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄水平

由于GS同工酶在Rosetta菌株中表達(dá)量差異很大，我們提取了誘導(dǎo) 3 h的細(xì)菌 RNA，利用RT-qPCR檢測(cè)了GS同工酶的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，GSr的mRNA表達(dá)量為7.59，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于GS1 (1.00)、GSe (1.46)、GS2 (1.84)及 GS2p (1.66)，后4個(gè)基因的 mRNA水平相近?？梢?jiàn)，GS同工酶的蛋白質(zhì)翻譯與轉(zhuǎn)錄水平不一致，原核生物蛋白質(zhì)表達(dá)量不是由相應(yīng)的mRNA量決定。

2.3 GS同工酶翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

原核生物基因表達(dá)沒(méi)有時(shí)空差異，即轉(zhuǎn)錄與翻譯同時(shí)進(jìn)行。只有出現(xiàn)像終止子那樣穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)才會(huì)影響蛋白質(zhì)的翻譯。利用 RNA Structure 5.3預(yù)測(cè)了GS同工酶原核表達(dá)載體翻譯起始區(qū) mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)及維持二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能。結(jié)果表明，同工酶翻譯起始區(qū)二級(jí)結(jié)構(gòu)的自由能為：GS1 (14.4)

圖1 GS同工酶在表達(dá)菌株 E.coli Rosetta中的表達(dá) (A) 及Western blotting鑒定 (B)Fig.1 Prokaryotic expression of GS isoenzymes in E.coli Rosetta cell (A) and identification of recombinant protein GS by Western blotting (B).

圖2 GS1和GS2p翻譯起始區(qū)mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 The secondary structure of mRNA translation initiation region of GS1 and GS2p.

2.4 GS同工酶原核表達(dá)條件優(yōu)化及可溶性分析

翻譯起始區(qū)穩(wěn)定的 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)不利于起始翻譯，影響蛋白表達(dá)量。適當(dāng)升高溫度可能有助于打開(kāi)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高翻譯起始效率，增加蛋白表達(dá)量。但是，如果外源蛋白表達(dá)過(guò)快可能形成包涵體，影響蛋白質(zhì)的活性，需要降低培養(yǎng)溫度以降低外源蛋白表達(dá)速率，增加外源蛋白的可溶性。

GS1于30 ℃誘導(dǎo)5 h后不僅有較大的表達(dá)量，且可溶性蛋白含量最高。在 30 ℃下誘導(dǎo)，GSr大量表達(dá)且為包涵體；在25 ℃及20 ℃下誘導(dǎo)，GSr主要表達(dá)產(chǎn)物為包涵體；16 ℃誘導(dǎo)6 h以后，GSr可溶性表達(dá)量逐漸升高，誘導(dǎo)15 h后可溶性GSr占比達(dá)到最大。盡管降低誘導(dǎo)溫度可以增加外源蛋白的可溶性，但隨著誘導(dǎo)溫度的降低，外源蛋白表達(dá)量減少，需要延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間以獲得較多的外源蛋白。GSe在 37 ℃下誘導(dǎo)的表達(dá)量明顯高于 30 ℃，且主要為可溶性蛋白，并于誘導(dǎo)后5 h含量達(dá)最高。在30 ℃下誘導(dǎo)，GS2主要為包涵體；在 25 ℃下誘導(dǎo)，GS2的可溶性表達(dá)比例增加，并于誘導(dǎo) 7 h后蛋白量達(dá)最大(圖 3)。GS2p 在 37 ℃、30 ℃、25 ℃及 20 ℃下誘導(dǎo)均無(wú)表達(dá)。

2.5 原核表達(dá)GS同工酶的活性

收獲最佳表達(dá)條件下的菌體1 mL，破碎后測(cè)定上清液中相應(yīng)的GS同工酶活性。結(jié)果表明，GS1、GSe及GS2均有活性，GSr無(wú)活性；酶活性大小為 GS1>GSe>GS2 (圖 4A)。Western blotting分析顯示，GS1含量最高，GSe含量最低，GS2與GSr蛋白含量相近 (圖4B)。可見(jiàn)，原核表達(dá)GS同工酶蛋白含量與酶活性不一致，可能與小麥中GS同工酶修飾有關(guān)。

3 討論

同源性很高的GS同工酶在相同的原核表達(dá)載體、受體菌株及誘導(dǎo)條件下，蛋白表達(dá)卻差異極大，推測(cè)GS同工酶基因存在調(diào)控位點(diǎn)控制蛋白質(zhì)的表達(dá)。首先是稀有密碼子的數(shù)量與分布，稀有密碼子分析發(fā)現(xiàn)，GSr、GSe和GS2p基因5′端均存在連續(xù)的稀有密碼子。當(dāng)受體菌株是BL21(DE3) plyss時(shí)，GS1和GS2表達(dá)，而GSr、GSe和GS2p不表達(dá) (圖5)；當(dāng)受體菌株為Rosetta時(shí)，顯著提高GSr和GSe的表達(dá)。但是突變GSe基因中的稀有密碼子 AGGAGG (又似 SD序列)為大腸桿菌偏愛(ài)的密碼子(CGTCGT)，并沒(méi)有提高其表達(dá)量 (圖6)。其次是翻譯起始區(qū)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。由于GSr轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于GSe、GS2及GS2p，均高于GS1，與蛋白表達(dá)水平不一致，鑒于原核生物基因邊轉(zhuǎn)錄邊翻譯的特點(diǎn)，推測(cè)翻譯起始區(qū)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響翻譯效率。利用RNA Structure 5.3分析包含載體SD序列到起始密碼子下游的100 nt序列，發(fā)現(xiàn)GS1翻譯起始區(qū)的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最不穩(wěn)定，GS1表達(dá)量最高；GS2p翻譯起始區(qū)的 mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，GS2p無(wú)表達(dá)。當(dāng)將GS2p構(gòu)建在PET28a載體時(shí)，由于N端含有載體的融合肽，即使在BL21(DE3)plyss菌株中也大量表達(dá) (圖 7)，進(jìn)一步證明mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性影響翻譯效率。盡管原核與真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制不同，但在小麥中GS2、GSr和GS1表達(dá)量較高，與原核表達(dá)相似，是否基因編碼區(qū)序列本身也參與真核基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)非常有趣的科學(xué)問(wèn)題。

GS同工酶基因不僅影響其在原核中的蛋白質(zhì)表達(dá)量，還影響蛋白質(zhì)表達(dá)方式。GS1在30 ℃下誘導(dǎo)5 h主要為可溶性蛋白，GSr在20–30 ℃誘導(dǎo)均表達(dá)為包涵體蛋白，在16 ℃誘導(dǎo)15 h為可溶性蛋白，但表達(dá)量極少；37 ℃誘導(dǎo)提高GSe的表達(dá)，且為可溶性蛋白。推測(cè)溫度升高有利于打開(kāi)mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高翻譯效率，溫度降低抑制蛋白質(zhì)翻譯，促進(jìn)蛋白質(zhì)可溶表達(dá)。也可能是GS同工酶組裝的方式不同，原核細(xì)胞沒(méi)有GSr組裝的條件，所以才以包涵體形式存在。

圖3 重組GS同工酶在Rosetta中誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 (s指上清，p指沉淀)Fig.3 Optimization of induction conditions for inducible expression of GS isoenzymes.“s” is supernatant, and “p” is precipitation.

圖4 最佳誘導(dǎo)條件下重組GS的全酶活測(cè)定 (A) 及表達(dá)量鑒定 (B)Fig.4 Determination of recombinant protein GS activity (A) and identification of recombinant protein GS by Western blotting (B) under the condition of the best induction.

圖5 GS同工酶在BL21(DE3) plyss菌株中的表達(dá)Fig.5 Prokaryotic expression of GS isoenzymes in BL21(DE3) plyss cell.

圖6 PET-21a-GSe-tu在Rosetta菌株中的表達(dá) (s指上清，p指沉淀)Fig.6 Prokaryotic expression of PET-21a-GSe-tu in Rosetta cell.“s” is supernatant, and “p” is precipitation.

圖7 PET-28a-GS2p在BL21(DE3) plyss菌株中的表達(dá)Fig.7 Prokaryotic expression of PET-28a-GS2p in BL21(DE3) plyss cell at 16 °C.

真核生物新生蛋白質(zhì)需要不同程度的加工修飾才能變?yōu)橛谢钚缘某墒斓鞍?，大腸桿菌缺少蛋白加工修飾機(jī)制，這可能就是原核表達(dá)的 GS在酶活性水平與蛋白水平不一致的原因。GSe雖然蛋白含量低，但卻具有較高的酶活水平，可能是GSe在小麥中修飾的較少；GSr雖然表達(dá)量高，卻沒(méi)有GS催化活性，可能是GSr在小麥中翻譯后需要較多的加工修飾才能形成有活性的結(jié)構(gòu)。

目前，利用原核表達(dá)GS并成功解析其結(jié)晶三維結(jié)構(gòu)的基因有玉米GS1和苜蓿GS1[25-26]，其他GS同工酶的三維結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道，可能是由于原核表達(dá)的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。植物中GS表達(dá)量少，純化復(fù)雜，很少用天然蛋白來(lái)研究其結(jié)構(gòu)。本研究構(gòu)建了GS同工酶的原核表達(dá)載體，分析了其原核表達(dá)特點(diǎn)及其原因，探索了其可溶性表達(dá)的條件，為GS同工酶結(jié)構(gòu)研究及特異性抗體的篩選奠定了基礎(chǔ)，也為深入研究小麥GS同工酶調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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