槐強(qiáng)強(qiáng)，賈祿強(qiáng)，丁健，陳珊珊，孫佼文，史仲平

江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

Monellin是西非植物Dioscoreophyllum cumminsii漿果中的一種天然甜味蛋白，它的甜度是相同質(zhì)量蔗糖的 3 000倍[1]。與其他的甜蛋白 (如pentadin，thaumatin等) 相類似，monellin也是一種非碳水化合物甜味劑，對(duì)于那些患有嚴(yán)重糖尿病但卻嗜好傳統(tǒng)糖類食品的人群而言是一種健康食品[2]。Monellin可以制作成安慰甜味劑或甜酵母片供糖尿病人食用[3-4]。Monellin純品價(jià)格昂貴，Sigma公司銷售的純度為 95%的 monellin價(jià)格為$100/100 mg (http://www.zhenghe.cn/JiShuTong/CG_TechnologyInfo_T.aspx?key=24ccc46229984a0190 28ee1a95034ac3)。Monellin也能夠通過微生物的生化反應(yīng)方法合成。在最新報(bào)道中，Chen等利用含有sacB啟動(dòng)子和信號(hào)肽的枯草芽孢桿菌生產(chǎn)monellin，monellin最大濃度達(dá)到0.29 g/L[5]。Liu等在重組釀酒酵母中表達(dá) monellin，monellin的最高濃度為0.675 g/L[6]。Leone等利用重組大腸桿菌表達(dá)monellin，其濃度大約為0.18 g/L[7]。

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母被認(rèn)為是一種高效的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[8]，該系統(tǒng)具有分子遺傳操作方便、細(xì)胞易于達(dá)到高密度、外源蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較高的特性。重組畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過程主要分為兩個(gè)階段：生長(zhǎng)階段，以甘油為碳源、獲取大量的功能性細(xì)胞；誘導(dǎo)階段，通過流加甲醇來誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白[9]。通常情況下，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到高密度 (100-130 g DCW/L) 時(shí)，將碳源從甘油切換成甲醇，并將甲醇濃度維持在適宜水平開始誘導(dǎo)[10-11]。然而，這種“標(biāo)準(zhǔn)”型外源蛋白表達(dá)策略有以下缺點(diǎn)：1) 高耗氧特性，通空氣供氧、培養(yǎng)后期/誘導(dǎo)期的溶氧濃度 (DO) 無法控制；2) 如果追求高細(xì)胞濃度，在細(xì)胞培養(yǎng)后期乙醇會(huì)積累，導(dǎo)致外源蛋白生產(chǎn)表達(dá)的不穩(wěn)定[12]；3) 在較低溫度 (20 ℃) 下誘導(dǎo)有利于外源蛋白的表達(dá)，可以增強(qiáng) AOX的活性，緩解目標(biāo)蛋白的降解，但是低溫誘導(dǎo)會(huì)增加熱交換壓力與氧氣供應(yīng)的負(fù)擔(dān)/成本[13]，特別是在夏季；4) 能量(NADH) 物質(zhì)的無效生成可造成過多/無效的甲醇消耗，降低整個(gè)發(fā)酵性能[9,14]。為了解決上述問題，人們提出了另一種在低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)的操作策略。Wang等使用該策略表達(dá)堿性果膠酶，發(fā)現(xiàn)在低細(xì)胞濃度56.7 g DCW/L下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，蛋白生產(chǎn)效率 (Qv) 最大，比在細(xì)胞濃度83.39或124.9 g DCW/L啟動(dòng)誘導(dǎo)的Qv高11.6%和 18.4%[15]。Jia等報(bào)道指出，在低細(xì)胞濃度60 g DCW/L時(shí)啟動(dòng)誘導(dǎo)，同時(shí)將誘導(dǎo)溫度控制在22 ℃的較低水平，提高了聚 (乙烯醇) 脫氫酶的產(chǎn)量，且DO一直處于可控范圍 (5%–20%) 內(nèi)[16]。然而，在低/高細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)時(shí)，甲醇/能量變化模式的相關(guān)報(bào)道很少，誘導(dǎo)性能得到優(yōu)化的機(jī)制/機(jī)理尚不明確。

文中分析了在不同細(xì)胞濃度 (50、100 g DCW/L)及其不同的誘導(dǎo)溫度 (20、30 ℃) 下，畢赤酵母表達(dá)monellin的甲醇/能量代謝模式，試圖解釋在較低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)的控制策略可以促進(jìn)monellin表達(dá)的原因，為畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過程控制提供一些有用信息。

1 材料與方法

1.1 菌株

甲醇利用慢型重組畢赤酵母Pichia pastorisKM71菌株由武漢輕工業(yè)大學(xué)構(gòu)建并提供。表達(dá)載體為pPICZαA，重組質(zhì)粒為pPICZαA-Mon。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基 (g/L) 的組成如下所示：YPD培養(yǎng)基(葡萄糖 20，酵母提取物 10，蛋白胨 20) 用于種子培養(yǎng)。分批發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油 20，(NH4)2SO45，H3PO42 (%，V/V)，MgSO41，CaSO40.1，K2SO41；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。生長(zhǎng)流加培養(yǎng)基：甘油 500，(NH4)2SO40.5，KH2PO40.5，MgSO40.03；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。誘導(dǎo)流加培養(yǎng)基：純甲醇；PTM110 (mL/L)，pH 6.0。

1.3 在 5 L發(fā)酵罐中分批培養(yǎng)畢赤酵母表達(dá)monellin

畢赤酵母分批培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐 (百侖生物科技有限公司，BLBIO-5GJ-3-H) 中進(jìn)行，由1個(gè)顯示屏/控制柜同時(shí)驅(qū)動(dòng)2個(gè)5 L發(fā)酵罐。初始裝液量為2.0 L。接種量和通氣量分別為14% (V/V)和 3 vvm。在細(xì)胞生長(zhǎng)期，手動(dòng)提高攪拌轉(zhuǎn)速至700 r/min將DO維持在10%以上。采用標(biāo)準(zhǔn)或改進(jìn)型 DO-Stat[12]策略進(jìn)行甘油流加，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)。如果最大攪拌轉(zhuǎn)速下，DO基線仍不能維持在10%以上，則需要通入純氧。用5% (V/V)的氨水將pH維持在6.0。甘油/乙醇 (副產(chǎn)物) 完全耗盡后，開始流加純甲醇，進(jìn)入誘導(dǎo)期，并根據(jù)需要將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃或20 ℃，pH維持不變。使用配有多通道A/D-D/A轉(zhuǎn)換器 (臺(tái)灣研華科技有限公司，PCL-812PG) 的工控機(jī)，根據(jù)甲醇 (上海蘇泊公司，F(xiàn)C-2002) 和DO電極在線測(cè)量結(jié)果驅(qū)動(dòng)蠕動(dòng)泵 (河北保定蘭格有限公司，BT00-50M) 進(jìn)行甲醇/甘油流加。在誘導(dǎo)期，采用甲醇ON-OFF控制策略將甲醇濃度控制在5–7 g/L的范圍。甲醇電極也能夠在線測(cè)量生長(zhǎng)期的乙醇濃度并且與DO測(cè)量[12]相結(jié)合來調(diào)節(jié)甘油流加速率。利用尾氣分析儀 (韓國 Lokas公司，LKM2000A) 在線檢測(cè)尾氣 (通入空氣) 中 O2和CO2分壓。O2消耗速率 (OUR) 和 CO2釋放速率(CER) 可通過標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算公式[17]確定。

1.4 測(cè)量細(xì)胞/甲醇/monellin濃度和相應(yīng)的生長(zhǎng)/消耗/合成速率

細(xì)胞濃度通過測(cè)量波長(zhǎng)600 nm (OD600) 處的吸光值測(cè)定，根據(jù)細(xì)胞干重 (DCW/L) 與OD600值的線性關(guān)系曲線 (DCW/L=0.25×OD600) 計(jì)算DCW/L。甲醇和乙醇濃度通過氣相色譜儀 (上海精密科學(xué)儀器有限公司，GC112A，F(xiàn)ID檢測(cè)器；Alpha-Col AC20毛細(xì)管柱，澳大利亞SGE國際有限公司) 進(jìn)行測(cè)定。中間代謝產(chǎn)物甲醛和甲酸的濃度通過高效液相色譜儀 (反向 ZORBAX SB C18柱，254 nm，紫外檢測(cè)器) 進(jìn)行測(cè)定。流動(dòng)相是 20 mmol/L的 Na2PO4溶液 (99%) 和乙腈(1%)。進(jìn)樣量 10 μL，柱溫為 28 ℃。電泳板的Marker泳道加入20 μL分子量已知的蛋白溶液。聚丙烯酰胺凝膠電泳 (12%分離膠) 以標(biāo)準(zhǔn)分子量作為基準(zhǔn)直至溴酚藍(lán)達(dá)到分離膠的底部。經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后，通過G:Box生物成像系統(tǒng)和基因工具軟件 (英國 SynGene公司) 對(duì)發(fā)酵moenllin的濃度進(jìn)行定量。每個(gè)條帶掃描三次取平均值作為定量結(jié)果。此外，以10 g/L的蔗糖溶液為對(duì)照，對(duì)無細(xì)胞發(fā)酵上清液進(jìn)行甜味檢測(cè)。電子天平 (上海?？惦娮觾x器廠，JA1102) 通過RS232通信接口與工控機(jī)連接，通過測(cè)量甲醇流加瓶的重量減少量在線檢測(cè)甲醇消耗量 (g/L)。細(xì)胞濃度 (X)、甲醇消耗量 (S) 和monellin濃度(P) 分別與獨(dú)立變量 (誘導(dǎo)) 時(shí)間進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合，以濃度對(duì)時(shí)間t進(jìn)行微分 (dX/dt，dS/dt，dP/dt)，確定細(xì)胞生長(zhǎng)/甲醇消耗/monellin合成的比速率。

1.5 碳分配比率計(jì)算

如圖 1所示，碳 (甲醇) 代謝用于 4個(gè)不同部分：細(xì)胞生長(zhǎng)、維持代謝、monellin合成和供能。其中，根據(jù)經(jīng)典生物工程教科書[18-20]，用于細(xì)胞生長(zhǎng)和維持代謝的碳流比率可由式1確定。

式中的ν、μ、YX/S和m分別表示甲醇比消耗速率、細(xì)胞比生長(zhǎng)速率、細(xì)胞對(duì)甲醇的得率系數(shù)和維持代謝常數(shù)。

這里，X和S分別表示細(xì)胞和底物濃度；F是甲醇流加速率，由甲醇濃度自動(dòng)控制系統(tǒng)確定；V是發(fā)酵液體積；SF是甲醇流加濃度；k和k-1分別代表當(dāng)前取樣時(shí)刻和上一個(gè)取樣時(shí)刻；ΔT是取樣間隔是取樣間隔內(nèi)細(xì)胞的平均濃度。由于甲醇濃度基本控制在 5 g/L左右的低水平(dS/dt≈0)，且使用純甲醇流加，SF–S≈SF，SF就是甲醇的密度 (800 g/L)。由于直接添加100%的純甲醇，添加量較少，且逃液量有限。通過適度調(diào)控采樣頻率和體積可以將發(fā)酵液體積V控制恒定水平。以μ和ν為橫縱坐標(biāo)，對(duì)不同誘導(dǎo)條件下的ν和μ數(shù)據(jù)作圖，從直線的斜率可以得到用于細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)底物的得率 (YX/S)。再根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[15,21]，畢赤酵母細(xì)胞中的碳含量在50%左右，因此，將原有的YX/S乘50%進(jìn)行計(jì)算，可得到真正用于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳流 (甲醇消耗) 比率。在計(jì)算細(xì)胞維持代謝能 (mXE) 方面，仍沿用公式1來進(jìn)行計(jì)算，但通過對(duì)該公式變形來計(jì)算真正意義上的細(xì)胞維持代謝能 (mXE)：

式3是公式1的轉(zhuǎn)化版，即細(xì)胞對(duì)底物得率(YX/S) 必須要扣除用于細(xì)胞維持代謝能 (mXE) 的碳流比例。但是，由于誘導(dǎo)過程中 1/ν和μ/ν均在變化，因此，mXE不再是一個(gè)數(shù)值而是處在一定范圍內(nèi)。因此，我們利用下式計(jì)算mXE的平均值，得到用于維持代謝能的碳流比例。

式中，mXE(t)、ΔT、T分別是特定時(shí)刻計(jì)算得到的細(xì)胞維持代謝能 (碳流比率)、采樣和計(jì)算間隔、以及總誘導(dǎo)時(shí)間。另一方面，如圖1所示，一部分甲醇必須通過異化產(chǎn)能 (供能) 途徑A合成能量物質(zhì) (NADH)，同時(shí)釋放出 CO2。供能途徑中總的甲醇消耗/代謝比率 (ε)、包括用于monellin合成εP和細(xì)胞維持代謝m的供能比例，可由式5計(jì)算得到。

式中的CER，tf和ATMeOH分別表示CO2釋放速率、總誘導(dǎo)時(shí)間和甲醇總消耗量。最后，用于monellin合成 (前體) 的甲醇消耗比率 (γ) 可由式6確定。

圖1 甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)monellin簡(jiǎn)化代謝途徑Fig.1 Simplified methanol metabolic pathways by P.pastoris for monellin production.

2 結(jié)果與討論

2.1 低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)促進(jìn)monellin表達(dá)

在5 L發(fā)酵罐中共進(jìn)行了4批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。批次#1–2中，細(xì)胞達(dá)到高密度 (100 g DCW/L左右)后開始誘導(dǎo)。在批次#3–4中，當(dāng)細(xì)胞濃度在低密度 (50 g DCW/L左右) 時(shí)開始誘導(dǎo)。批次#3–4中，通空氣，采用傳統(tǒng) DO-Stat控制策略進(jìn)行甘油流加。但是，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50-60 g DCW/L以后，DO下線 (基線) 降低到接近于0的水平，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停止，細(xì)胞比生長(zhǎng)速率接近于 0。因此，在批次#3中，當(dāng)細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，立即啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，進(jìn)入誘導(dǎo)期。而在批次#1中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50 g DCW/L左右、細(xì)胞停止生長(zhǎng)后，將供氧模式從通空氣改為通純氧，以確保DO基線高于某臨界值 (約 5%)。如圖 2所示，通入純氧后，DO平均水平升高，細(xì)胞生長(zhǎng)恢復(fù)，但乙醇也開始積累。有報(bào)道指出[12]，乙醇的歷史積累嚴(yán)重破壞重組畢赤酵母的功能骨架，嚴(yán)重影響外源蛋白的表達(dá)和發(fā)酵穩(wěn)定性。因此，本研究中采用改良型 DO-Stat[12]策略，將乙醇濃度控制在低水平 (2 g/L以下)。如圖2所示，發(fā)酵批次#1中，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到50-60 g DCW/L后，通純氧并采用改良型 DO-Stat策略流加甘油，細(xì)胞最終可以達(dá)到高密度 (100 g DCW/L)，且最大乙醇濃度低于2.1 g/L。因此，理論上批次#1可以實(shí)現(xiàn)monellin的高效表達(dá)。

圖2 不同甘油流加/通氣控制策略下細(xì)胞生長(zhǎng)期內(nèi)的DO、細(xì)胞和乙醇濃度的變化Fig.2 Time courses of DO, cell, ethanol concentrations within growth phase with different glycerol feeding/aeration strategies.

具體的誘導(dǎo)操作策略如下：批次#1-2在高細(xì)胞濃度 (100 g DCW/L) 下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度分別是 30 ℃ (批次#1) 和 20 ℃ (批次#2)；批次#3-4在低細(xì)胞濃度 (50 g DCW/L) 下開始誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃ (批次#3) 和20 ℃ (批次#4)。批次#3中，monellin濃度達(dá)到了2.62 g/L的最高水平；其次是批次#4，monellin濃度為1.87 g/L (圖 3C)。但是，當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)策略 (高細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)) 時(shí)，monellin濃度分別為1.04 g/L (批次#2，20 ℃) 和 0.54 g/L (批次#1，30 ℃)，發(fā)酵性能很差。上述結(jié)果也總結(jié)歸納于表1中。此外，收集無細(xì)胞發(fā)酵上清液檢測(cè)其甜度。雙盲測(cè)試結(jié)果表明，批次#3中收集得到的上清液甜度明顯高于其他批次中的上清液甜度。圖 3B和3D是批次#1-4中monellin濃度隨時(shí)間變化的SDS-PAGE圖，Monellin分子量為10.7 kDa。批次#3-4中，monellin表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加，而批次#1-2中的monellin濃度基本不變。此外，無論胞內(nèi)還是胞外，甲醇代謝的中間毒副產(chǎn)物甲醛和甲酸均未檢測(cè)到 (數(shù)據(jù)未顯示)。

如圖 1所示，碳 (甲醇) 代謝用于 4個(gè)不同部分：細(xì)胞生長(zhǎng)、維持代謝、monellin合成和供能。碳流分配比率可由公式1-6確定。另外，我們假定monellin比合成速率 (ρ) 和細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 (μ) 遵從Luedeking-Piret模型，即

Luedeking-Piret模型是關(guān)聯(lián)目標(biāo)代謝產(chǎn)物比合成速度與細(xì)胞比生長(zhǎng)速度之間關(guān)系的、比較公認(rèn)的基礎(chǔ)模型。因此，碳代謝和monellin合成模式可由式1-7確定。

一般認(rèn)為，乙醇、乳酸等初級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)酵生產(chǎn)屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)完全耦聯(lián)型，氨基酸、某些有機(jī)酸等發(fā)酵生產(chǎn)屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)半耦聯(lián)型，而抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)則屬于代謝產(chǎn)物合成/細(xì)胞生長(zhǎng)非耦聯(lián)型。

2.2 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá) monellin的碳代謝模式

圖4是不同誘導(dǎo)策略下的μ、ν和ρ的變化模式。其中，圖4B和圖4C也間接顯示了二級(jí)發(fā)酵參數(shù)YX/S、α和β的差異。表2則總結(jié)歸納了不同誘導(dǎo)策略 (批次) 下主要二級(jí)發(fā)酵參數(shù)YX/S、mXE、εP、γ、α和β的差異和變化。

圖3 不同誘導(dǎo)策略下monellin濃度和SDS分析結(jié)果Fig.3 Monellin concentrations and SDS analysis results with different induction strategies.

表1 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin的發(fā)酵性能比較Table 1 Fermentation performance of monellin synthesis by Pichia pastoris using different induction strategies

圖4 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin的碳代謝模式Fig.4 Carbon metabolism modes for monellin synthesis by P.pastoris with different induction strategies.

上述結(jié)果表明，采用低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)誘導(dǎo)的策略，1) 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率高但用于細(xì)胞生長(zhǎng)的碳流較少 (圖4B中，斜率1/YX/S較大)。2) 30 ℃下monellin的比合成速率與細(xì)胞比生長(zhǎng)速率完全耦聯(lián)、耦聯(lián)系數(shù) (α) 最大，且細(xì)胞比生長(zhǎng)速率μ也較高 (第二大)，這可能是批次#3中 monellin濃度達(dá)到最大的一個(gè)原因。3) 甲醇供能途徑A中用于能量NADH合成的甲醇消耗比率εP較大 (用于為 monellin合成供能)。低細(xì)胞濃度下誘導(dǎo)，εP=22.7%-29.2%；高細(xì)胞濃度下誘導(dǎo)，εP=14.0%-19.0%，整個(gè)代謝過程中的細(xì)胞/monellin合成有足夠的能量支撐。4) 30 ℃下用于monellin前體合成的甲醇利用比率γ最大(65.2%)，而且與較高的能量支撐相匹配。此時(shí)，應(yīng)該有較多的前體物質(zhì) (氨基酸等)[22]可用于甜味蛋白monellin合成。

需要說明的是，在批次#1中，由于誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生的 monellin立即降解 (圖 3A)，數(shù)據(jù)不符合 Luedeking-Piret模型，因此相應(yīng)參數(shù)未在圖 4和表2中顯示。

2.3 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá) monellin的能量利用效率

能量利用效率是增強(qiáng)畢赤酵母表達(dá) monellin的另一個(gè)重要因素。碳代謝和能量代謝必須相匹配才能提高發(fā)酵性能。如表2所示，批次#1和批次#3中走向前體物質(zhì)合成途徑的碳流比率相差較大 (γ=48%，批次#1；γ=65%，批次#3)，走向能量代謝 (用于 monellin合成) 的碳流比率相差也很大 (批次#1，εP=14%；批次#3，εP=23%)。因此，批次#3中的甲醇/能量代謝比例是比較匹配的。另外，能量利用效率在畢赤酵母代謝甲醇的過程中是非常重要的。該效率取決于氧化磷酸化反應(yīng)中的氧氣消耗速率，并直接影響到用于細(xì)胞生長(zhǎng)/monellin合成的能量供給-ATP再生速率。如圖1所示，在甲醇代謝過程中有兩個(gè)耗氧步驟。第一步是甲醇經(jīng)AOX酶的催化生成甲醛 (HCHO)，這是甲醇代謝的中樞和第一個(gè)代謝反應(yīng)。這個(gè)步驟中O2消耗速率由式9確定。

表2 不同誘導(dǎo)策略下、畢赤酵母表達(dá)monellin發(fā)酵過程的主要二級(jí)發(fā)酵參數(shù)Table 2 Major secondary parameters in monellin fermentation by Pichia pastoris using different induction strategies

這里T和t分別表示溫度和誘導(dǎo)時(shí)間。第二步耗氧反應(yīng)發(fā)生在氧化磷酸化反應(yīng)過程中，該過程將供能途徑A中生成的NADH轉(zhuǎn)化為ATP，此步驟中的 O2消耗速率可由甲醇消耗速率rMeOH和OUR并結(jié)合公式11計(jì)算得到。

式中的rMeOH、rFNADH、rCNADH、rATP、OUR和 CER分別表示甲醇消耗速率、NADH合成速率、NADH利用速率、氧化磷酸化反應(yīng)中的ATP再生速率、O2消耗速率和CO2釋放速率。

理論上ATP再生速率rATP取決于公式14中假設(shè)不同誘導(dǎo)溫度下P/O比例恒定不變，ATP再生速率rATP可由rATP=(P/O)rCNADH表示。這里，我們定義一個(gè)新參數(shù)η來表示能量利用效率。

即η(rCNADH/rFNADH) 定義為畢赤酵母表達(dá)外源蛋白時(shí)的能量利用效率。理論上，η=1表明氧化磷酸化過程可以將所有來源于甲醇異化產(chǎn)能途徑的NADH完全氧化，再生ATP，為外源蛋白合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量。如圖1所示，如果η>1，表明NADH的需求量高于其生成量，這意味著 NADH的需求量是受限的，最大 NADH需求量rCNADH只能等于其生成量rFNADH。針對(duì)η的取值，我們進(jìn)行如下聚類：如果η≥1，途徑A中生成的 NADH可完全 (100%) 用于 ATP的再生，為 monellin合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量；如果0.8<η<1.0，能量利用效率被認(rèn)為處于較高水平；如果η≤0.8，表明能量利用效率處于低水平，產(chǎn)生的NADH不能有效地用于ATP再生為monellin合成/細(xì)胞生長(zhǎng)-維持代謝提供能量。圖5A和表 2是批次#1–4中整個(gè)誘導(dǎo)階段每小時(shí)間隔內(nèi)的η聚類結(jié)果。如該圖和表所示，批次#3 (低細(xì)胞濃度誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度30 ℃) 中高η(η≥1，非常高；0.8<η<1.0，較高) 的聚類比例是最高的(η≥1，49%；0.8<η<1.0，40%；共 89%)。批次#1 (較高細(xì)胞濃度啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)溫度30 ℃)中低η(η≤0.8，100%；0.8<η<1.0和η≥1.0，0%)聚類比例是 100%。批次#2和批次#4中高η(0.8<η<1.0+η≥1.0) 的聚類比例分別是 34%和63%，介于批次#1和批次#3之間。圖5B是兩個(gè)極端批次 (批次#1和批次#3) 中η隨時(shí)間的變化情況。

圖5 不同誘導(dǎo)策略下畢赤酵母表達(dá)monellin過程的能量 (NADH) 效率η分布模式Fig.5 Energy (NADH) distribution patterns η in monellin production by P.pastoris with different induction strategies.

如圖3和表1所示，批次#1中表達(dá)monellin濃度最低，且誘導(dǎo)表達(dá)后立即降解。原因可能有兩個(gè)：1) 批次#1中，用于供能/蛋白合成的甲醇利用比例 (εP/γ) 較低，εP/γ=0.29，供能/蛋白合成的碳流比率低；而批次#3 的εP/γ較高，εP/γ=0.35，供能/蛋白合成的碳流比率相對(duì)匹配。2) 批次#1中的NADH利用效率η低于0.8 (η≤0.8) 的比例為 100%，極低的能量效率是導(dǎo)致最低 monellin濃度的另一個(gè)重要原因。相反，批次#3中、η數(shù)據(jù)的絕大多數(shù) (89%) 都高于0.8 (η≥0.8)，表明途徑A中產(chǎn)生的NADH能高效地用于ATP再生以支撐monellin合成。綜合這兩個(gè)因素，發(fā)酵批次#3的monellin濃度達(dá)到2.62 g/L的最高水平。

需要指出的是，η>1是不符合實(shí)際的 (η=1是理論上的最大值)。不符實(shí)際數(shù)據(jù) (η>1) 的產(chǎn)生源于OUR、CER和甲醇消耗速率的在線測(cè)量。因?yàn)檫@些在線測(cè)量系統(tǒng)是獨(dú)立的，同時(shí)在實(shí)際操作過程中 OUR和 CER對(duì)于尾氣分析儀干燥劑(硅膠) 的頻繁更換非常敏感。另外，計(jì)量甲醇添加量的電子天平的零點(diǎn)漂移較大，每10 h “負(fù)漂移”在10-20 g左右。由于低細(xì)胞密度誘導(dǎo)條件下，甲醇添加速度較慢，monellin能持續(xù)表達(dá)，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，根據(jù)公式11、13和15，該“負(fù)漂移”實(shí)際上間接加大了η計(jì)算公式的分子且貢獻(xiàn)較大，導(dǎo)致η>1數(shù)據(jù)的頻繁出現(xiàn)。相反，在高細(xì)胞密度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，甲醇添加速度相對(duì)快。這時(shí)，零點(diǎn)漂移雖然也加大了η計(jì)算公式的分子，但貢獻(xiàn)率相對(duì)較低。同時(shí)，該條件下，能量利用效率參數(shù)η也確實(shí)低，所以在觀察窗口內(nèi)η>1的數(shù)據(jù)一個(gè)都沒有出現(xiàn)。總之，大多數(shù)η>1的數(shù)據(jù)均處于1.00-1.25，稍高于1的區(qū)域內(nèi)?？紤]到大多數(shù)發(fā)酵過程中嚴(yán)重的測(cè)量噪聲，因此，上述數(shù)據(jù)還是可以接受的。雖然批次#3中有許多η的數(shù)據(jù)大于1，但是批次#1中所有η的數(shù)據(jù)均未超過0.8。這些數(shù)據(jù)至少可以解釋這兩個(gè)極端批次 (#1和#3) 中NADH利用效率與monellin濃度的關(guān)聯(lián)性。

最后，必須承認(rèn)目標(biāo)蛋白(monellin)對(duì)甲醇的得率YP/S低下，僅有0.11%-0.75% (表1)。其中，批次#3的得率最高，達(dá)到0.75%。這與許多文獻(xiàn)中目標(biāo)蛋白/抗體對(duì)甲醇的得率低是相一致的(0.020%-0.093%)[12,23-26]。目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量與甲醇消耗量比例 (得率) 很低，但并不意味著走向目標(biāo)蛋白合成前體途徑的碳代謝比例也如此低。因?yàn)榭紤]到不正確的蛋白折疊/糖基化修飾等因素，大部分合成前體并不能有效地轉(zhuǎn)化成目標(biāo)蛋白。

3 結(jié)論

畢赤酵母表達(dá)monellin過程中，在低細(xì)胞濃度下啟動(dòng)甲醇誘導(dǎo)，并將誘導(dǎo)溫度控制在30 ℃的發(fā)酵策略最優(yōu)，monellin濃度最高。我們分析了此誘導(dǎo)策略與其他誘導(dǎo)策略下的甲醇/能量代謝模式。結(jié)果表明，采用該最優(yōu)策略時(shí)，用于monellin前體物質(zhì)合成和NADH合成的碳流充足；用于支撐monellin合成的能量 (NADH) 利用效率最高；monellin合成與細(xì)胞生長(zhǎng)完全耦聯(lián)，耦聯(lián)系數(shù)α最大且細(xì)胞生長(zhǎng)速率較高，monellin合成速率最大。該誘導(dǎo)策略還可以緩解熱交換壓力和供氧負(fù)擔(dān)，有利于降低發(fā)酵成本。

[1]Kondo K, Miura Y, Sone H, et al.High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeastCandida utilis.Nat Biotechnol, 1997, 15(5): 453–457.

[2]Temussi PA.Why are sweet proteins sweet? Interaction of brazzein, monellin and thaumatin with the T1R2-T1R3 receptor.FEBS Lett, 2002, 526(1/3): 1–4.

[3]Masuda T, Kitabatake N. Developments in biotechnological production of sweet proteins.J Biosci Bioeng, 2006, 102(5): 375–389.

[4]Peon J, Pal SK, Zewail AH.Hydration at the surface of the protein monellin: dynamics with femtosecond resolution.Proc Nat Acad Sci USA, 2002, 99(17):10964–10969.

[5]Chen ZJ, Heng C, Li ZY, et al.Expression and secretion of a single-chain sweet protein monellin inBacillus subtilisbysacBpromoter and signal peptide.Appl Miocrobiol Biotechnol, 2007, 73(6): 1377–1381.

[6]Liu J, Yan DZ, Zhao SJ.Expression of monellin in a food-grade delivery system inSaccharomyces cerevisiae.J Sci Food Agric, 2015, 95(13): 2646–2651.

[7]Leone S, Sannino F, Tutino ML, et al.Acetate: friend or foe? Efficient production of a sweet protein inEscherichia coliBL21 using acetate as a carbon source.Microb Cell Fact, 2015, 14: 106.

[8]Spadiut O, Zalai D, Dietzsch C, et al.Quantitative comparison of dynamic physiological feeding profiles for recombinant protein production withPichia pastoris.Bioprocess Biosyst Eng, 2014, 37(6): 1163–1172.

[9]Ding J, Zhang CL, Gao MJ, et al.Enhanced porcine circovirus Cap protein production byPichia pastoriswith a fuzzy logic DO control based methanol/sorbitol co-feeding induction strategy.J Biotechnol, 2014, 177:35–44.

[10]Hong F, Meinander NQ, J?nsson LJ.Fermentation strategies for improved heterologous expression of laccase inPichia pastoris.Biotechnol Bioeng, 2002,79(4): 438–449.

[11]Lee CY, Lee SJ, Jung KH, et al.High dissolved oxygen tension enhances heterologous protein expression by recombinantPichia pastoris.Process Biochem, 2003,38(8): 1147–1154.

[12]Ding J, Gao MJ, Hou GL, et al.Stabilizing porcine interferon-α production byPichia pastoriswith an ethanol on-line measurement based DO-Stat glycerol feeding strategy.J Chem Technol Biotechnol, 2014,89(12): 1948–1953.

[13]Jin H, Liu GQ, Dai KK, et al.Improvement of porcine interferon-α production by recombinantPichia pastorisvia induction at low methanol concentration and low temperature.Appl Biochem Biotechnol, 2011, 165(2):559–571.

[14]Gao MJ, Dong SJ, Yu RS, et al.Improvement of ATP regeneration efficiency and operation stability in porcine interferon-α production byPichia pastorisunder lower induction temperature.Korean J Chem Eng, 2011, 28(6):1412–1419.

[15]Wang HL, Li JH, Liu L, et al.Increased production of alkaline polygalacturonate lyase in the recombinantPichia pastorisby controlling cell concentration during continuous culture.Bioresour Technol, 2012, 124:338–346.

[16]Jia DX, Liu L, Wang HL, et al.Overproduction of a truncated poly (vinyl alcohol) dehydrogenase in recombinantPichia pastorisby low-temperature induction strategy and related mechanism analysis.Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36(8): 1095–1103.

[17]Jin S, Ye KM, Shimizu K.Metabolic pathway analysis of recombinantSaccharomyces cerevisiaewith a galactose-inducible promoter based on a signal flow modeling approach.J Ferment Bioeng, 1995, 80(6):541–551.

[18]Bailey JE, Ollis DF.Biochemical Engineering Fundamentals.2nd ed.New York, USA: McGraw-Hill Co.Ltd., 1986: 390.

[19]山根恒夫.生物反応工學(xué).2nd ed.日本東 京: 産図書株式會(huì)社, 1991: 171.

[20]Blanch HW, Clark DS.Biochemical Engineering.New York, USA: Marcel Dekker Inc., 1996: 200–201.

[21]Jungo G, Schenk J, Pasquier M, et al.A quantitative analysis of the benefits of mixed feeds of sorbitol and methanol for the production of recombinant avidin withPichia pastoris.J Biotechnol, 2007, 131(1): 57–66.

[22]?el?k E, ?al?k P, Oliver SG.Metabolic flux analysis for recombinant protein production byPichia pastorisusing dual carbon sources: effects of methanol feeding rate.Biotechnol Bioeng, 2010, 105(2): 317–329.

[23]Fujiki Y, Kumada Y, Kishimoto M.Phase analysis in single-chain variable fragment production by recombinantPichia pastorisbased on proteomics combined with multivariate statistics.J Biosci Bioeng,2015, 120(2): 187–192.

[24]Katakura Y, Zhang WH, Zhuang GQ, et al.Effect of methanol concentration on the production of human-β2-glycoprotein I domain V by a recombinantPichia pastoris: A simple system for the control of methanol concentration using a semiconductor gas sensor.J Ferment Bioeng, 1998, 86(5): 482–487.

[25]Gurramkonda C, Adnan A, Gaebel T, et al.Simple high-cell density fed-batch technique for high-level recombinant protein production withPichia pastoris:application to intracellular production of Hepatitis B surface antigen.Microb Cell Fact, 2009, 8: 13.DOI:10.1186/1475-2859-8–13.

[26]Trinh LB, Phue JN, Shiloach J.Effect of methanol feeding strategies on production and yield of recombinant mouse endostatin fromPichia pastoris.Biotechnol Bioeng, 2003, 82(4): 438–444.