權(quán)春善，劉靜，周偉，鄭維，金黎明，趙晶，趙朋超，范圣第

1 大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 遼寧 大連 116600

2 河南科技大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽 471023

環(huán)脂肽是由微生物發(fā)酵產(chǎn)生的一類雙親性化合物，其一端由多個(gè)氨基酸組成肽環(huán)形成親水基，另一端由脂肪烴鏈形成親油基。它們具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能。環(huán)脂肽的理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，在高溫高壓處理后仍可保持較高的抗菌活性，對氯仿等有機(jī)溶劑有一定的耐受力，抗紫外線，對蛋白酶類不敏感。環(huán)脂肽類化合物主要由革蘭氏陽性芽孢桿菌代謝產(chǎn)生，具有抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗支原體、降低膽固醇等生物活性[1]。

芽孢桿菌產(chǎn)生的環(huán)脂肽化合物主要分為三大類，即表面活性素家族 (Surfactins)、芬枯草菌素家族 (Fengycin family) 和伊枯草菌素家族 (Iturin family)。表面活性素 Surfactin是由 Arima等[2]首次在Bacillus subtilis發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得，具有抗病毒、抗腫瘤、抗支原體、抗真菌以及抗細(xì)菌活性，具有很強(qiáng)的表面活性[3]。它的化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是一個(gè)3-羥基脂肪酸連接在由7個(gè)氨基酸形成的肽鏈上，并以內(nèi)酯鍵的形式構(gòu)成環(huán)狀。又由于其2位 (Leu/Ile/Val)、4位 (Val/Leu/Ile/Ala) 和7位(Leu/Val/Ile) 氨基酸殘基的不同和脂肪酸鏈長短(C12–C16) 的不同，出現(xiàn)了較多的類似物(包括同系物)[4]。芬枯草菌素由 3-羥基脂肪酸與 10個(gè)氨基酸形成的肽鏈組成，由肽鏈的第10位氨基酸上的羧基和第 3位 Tyr上的羥基縮合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[5-7]，已發(fā)現(xiàn) 6種類型 (Fengycin A、B、A2、B2、C和S)[8-9]。它對絲狀霉菌有良好的抑制作用，但對酵母和細(xì)菌僅有微弱的活性[10-11]。伊枯草菌素家族包括伊枯草菌素 (Iturin) A、C、D、E及其類似物芽孢菌霉素 (Bacillomycin) D、L、F，芽孢菌肽素 (Bacillopeptin) 和抗霉枯草菌素(Mycosubtilin)[12-14]。它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)中都含有一個(gè) C14–C17脂肪酸鏈和由 7個(gè)氨基酸組成的肽鏈，由脂肪酸上的氨基和肽鏈中C末端氨基酸的羧基形成酰胺鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。

Bacillomycin D是Iturin家族中的主要成員，1980年由Peypoux等首次從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中分離提取并確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)[15]。Bacillomycin D是由非核糖體肽合成酶 (Non-ribosomal peptide synthetases，NRPSs) 通過一種稱為“多載體硫模板機(jī)制 (Multiple carrier thiotemplate mechanism)”的方式合成[16-17]。芽孢桿菌全基因組序列分析結(jié)果表明，很多菌株都攜帶有Bacillomycin D合成酶基因序列，但其生物合成和調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Bacillomycin D對酵母菌和絲狀真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對細(xì)菌抑菌活性較弱，對于其抗病毒、抗腫瘤活性還鮮有報(bào)道。由于其對很多植物病原真菌具有很好的抑制作用，因此很多研究將其焦點(diǎn)放在生物防治的應(yīng)用中。

由于環(huán)脂肽化合物具有廣譜抗菌活性，其抗菌機(jī)理不同于目前上市的任何一類抗生素，臨床上表現(xiàn)出高效、低毒、不易產(chǎn)耐藥性的特點(diǎn)，使其在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。另外，多種環(huán)脂肽化合物表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。但是，由于環(huán)脂肽類化合物的表面活性顯著，發(fā)酵液中同時(shí)存在多種環(huán)脂肽及其同系物，并且溶液中的環(huán)脂肽所表現(xiàn)出的溶解性、極性和膠束狀態(tài)會隨著樣品濃度、雜質(zhì)種類和雜質(zhì)數(shù)量的變化而變化，因此獲得高純度的產(chǎn)品難度很大[18]。目前，僅放線菌來源的環(huán)脂肽化合物達(dá)托霉素的開發(fā)較為成功，2003年9月首次在美國上市，用于萬古霉素抗性的糞腸球菌 (VRE) 及對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA) 等革蘭氏陽性細(xì)菌感染導(dǎo)致的并發(fā)性皮膚感染和皮膚結(jié)構(gòu)感染[19]。

解淀粉芽孢桿菌Q-426菌株由本研究室從堆肥中分離所得，能夠代謝產(chǎn)生至少7種環(huán)脂肽化合物，對多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的生物活性。前期研究中，我們鑒定了Q-426菌株基因組中存在的芬枯草菌素 (Fengycins) 和伊枯草菌素(Iturins) 合成酶基因序列，并用生物信息學(xué)以及分子生物學(xué)軟件對其合成酶序列進(jìn)行了詳細(xì)的分析。同時(shí)，綜合利用抑菌活性、HPLC、HPLC-MS、隨機(jī)突變、定向基因敲除和雙向電泳等方法研究了對Bacillomycin D和Fengycins生物合成影響較顯著的內(nèi)外調(diào)控因子[20-23]。然而，由于該菌株同時(shí)產(chǎn)生多種環(huán)脂肽化合物，并且由于環(huán)脂肽的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得獲得單一種類的高純度的環(huán)脂肽樣品較為困難，限制該菌及其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用。因此，本文對原有Q-426菌株環(huán)脂肽的分離純化方法進(jìn)行了改進(jìn)，最終分別獲得C-15 Bacillomycin D和C-16 Bacillomycin D，純度均達(dá)到90%以上，同時(shí)，對其抗腫瘤活性及機(jī)制進(jìn)行了初步探討，為其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌Q-426為本實(shí)驗(yàn)室從堆肥樣品中篩選分離獲得并保藏。宮頸癌細(xì)胞Hela由大連醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究中心王麗娜饋贈，人神經(jīng)膠質(zhì)癌細(xì)胞MG由大連醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院馮斌教授饋贈，人肝癌細(xì)胞Hep-G2、人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29購于上海細(xì)胞庫。

1.2 環(huán)脂肽粗提樣品的制備

將解淀粉芽孢桿菌Q-426劃線培養(yǎng)于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)16 h，挑取生長較好的單菌落活化于20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12–14 h，按1%接種于500 mL FM液體培養(yǎng)基 (g/L；胰蛋白胨12.4，葡萄糖20，氯化鈉5，K2HPO41.5，MnSO4·H2O 0.04，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.7，MgCl2·6H2O 1.2，pH 9.0)，30 ℃、180 r/min 振蕩發(fā)酵72–76 h。離心去除菌體，用6 mol/L鹽酸溶液將上清液pH調(diào)至2.0，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心15 min去掉上清，用pH 1.8超純水洗滌沉淀3次，以10% (V/V) 的甲醇分別抽提3次，每次抽提2 h，離心收集甲醇抽提液。42 ℃減壓蒸干，加入5 mL超純水溶解，pH調(diào)至中性，12 000 r/min離心10 min除去沉淀，上清液經(jīng)0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾保存于4 ℃。

1.3 環(huán)脂肽的分離與純化

將上述環(huán)脂肽粗品通過雙樹脂聯(lián)合層析去除大部分雜質(zhì)，最后利用高效液相色譜分離純化得到純品，具體過程如下。向填有 HD-8樹脂的層析柱中加入500 μL環(huán)脂肽粗提樣品，用50%甲醇以0.5 mL/min的流速沖洗樹脂。沖洗過程中，當(dāng)柱子流出端出現(xiàn)白色渾濁狀流出液時(shí)開始收集，當(dāng)流出液變澄清透明時(shí)停止收集。將收集的白色渾濁流出液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，pH調(diào)至2.0，12 000 r/min離心5 min，除去上清，用500 μL的超純水溶解，保存于4 ℃。

向已預(yù)處理好的HZ-20ss樹脂中加入500 μL經(jīng)HD-8處理過環(huán)脂肽粗樣品，室溫、100 r/min靜態(tài)吸附 8 h，將吸附樣品的樹脂進(jìn)行裝柱。用5 BV的50%甲醇以6 BV/h的流速沖洗柱子，再用12 BV的90%甲醇以3 BV/h的流速洗脫環(huán)脂肽，收集洗脫液。將洗脫液經(jīng)42 ℃、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，用500 μL的超純水溶解，經(jīng)0.22 μm醋酸纖維素膜過濾保存于4 ℃。

經(jīng)過HZ-20ss樹脂處理的樣品利用制備型高效液相色譜進(jìn)一步純化。所用色譜柱為ShodexAsahipak ODP-50 6D，檢測波長為210 nm，進(jìn)樣量20 μL，所使用的流動相A為水(0.08% 三氟乙酸，TFA)；流動相 B為 80% 乙腈水溶液(0.08% TFA)。流動相流速：0.7 mL/min；洗脫流程：0–31 min，流動相A含量變化從50%到13%，流動相B含量變化從50%到87%。

1.4 環(huán)脂肽的ESI-MS/MS分析

質(zhì)譜條件：氣體溫度350 ℃；VCap 3.5 kV，Capillay 0.078 μA，Chamber 14.58 μA；碰撞電壓75 V，Slimmer 65 V，OCT 射頻電壓峰值 750 V。MS 范圍：100–1 500m/z，acquisition rate/time：1 spectra/s，1 000 ms/spectrum，transients/ spectrum：5 976。MS/MS 范圍：50–1 100m/z，acquisition rate/time：1 spectra/s、1 000 ms/spectrum，transients/spectrum：5 976。

1.5 MTS法檢測環(huán)脂肽對腫瘤細(xì)胞增殖的影響

將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h，按梯度濃度加入環(huán)脂肽作用48 h，每孔加入20 μL MTS工作液，37 ℃孵育4 h，在490 nm讀取吸光值。每個(gè)樣品重復(fù)3次，對照組以1 mmol/L DMSO代替樣品。細(xì)胞存活率=1–(對照組平均值–空白)–(實(shí)驗(yàn)組–空白)/(對照組平均值–空白)

1.6 Hela細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測環(huán)脂肽對 Hela細(xì)胞遷移的影響。取12孔板，每孔加入約5×105細(xì)胞，其數(shù)量以過夜鋪滿為佳，隔日用移液器槍頭在每孔中央縱軸及橫軸方向各劃一條創(chuàng)傷區(qū)域，用PBS清洗細(xì)胞3次，加入無血清培養(yǎng)液稀釋不同濃度的環(huán)脂肽，每隔一段時(shí)間觀察兩側(cè)細(xì)胞向中間遷移的情況并拍照。

1.7 PI染色法檢測Hela細(xì)胞凋亡與周期

取對數(shù)生長期的 Hela細(xì)胞接種于 6孔板(105個(gè)/mL)，培養(yǎng) 24 h，分別加入 50 μg/mL 和70 μg/mL的 C-16 Bacillomycin D，對照組加入DMSO(與最高濃度樣品等量)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到1.5 mL無菌離心管內(nèi)，再將胰酶消化收集的貼壁細(xì)胞懸液至同一離心管內(nèi)，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清。加入1 mL提前預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL無菌離心管，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次，最后用1 mL PBS重懸細(xì)胞。加入1 mL的70%冰乙醇，輕輕吹打混勻，4 ℃固定24 h。于4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，用PBS洗細(xì)胞沉淀數(shù)次。在每個(gè)待檢細(xì)胞樣品中，加入500 μL PI染色工作液，輕輕重懸細(xì)胞沉淀，置于37 ℃避光水浴30 min。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm波長處檢測紅色熒光，同時(shí)檢測光散射情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌Q-426環(huán)脂肽的分離純化

我們在之前建立的解淀粉芽孢桿菌Q-426環(huán)脂肽制備方法的基礎(chǔ)上，對其分離純化方法進(jìn)行了補(bǔ)充修改，增加了雙樹脂處理步驟。在第一步酸沉淀并甲醇抽提過程中，除環(huán)脂肽類物質(zhì)，還有一些易溶于有機(jī)溶劑的物質(zhì)、雜蛋白及色素溶于甲醇中，因此此時(shí)環(huán)脂肽提取液呈棕黃色 (圖1A-a)。粗提液接著用大孔型強(qiáng)酸陽離子交換樹脂(HD-8) 處理，由于環(huán)脂肽帶有負(fù)電荷，所以HD-8樹脂不能與環(huán)脂肽進(jìn)行離子交換，故在酸性環(huán)境中環(huán)脂肽經(jīng)過該樹脂后以白色渾濁液的狀態(tài)優(yōu)先被沖洗下來，而大部分的雜質(zhì)和色素類物質(zhì)被HD-8樹脂吸附，環(huán)脂肽粗品呈無色 (圖1A-b)。接著將環(huán)脂肽樣品經(jīng)過HZ-20ss色譜柱，用甲醇溶液將活性物質(zhì)洗脫下來，此步可進(jìn)一步除去雜質(zhì)和殘留色素。

圖1 解淀粉芽孢桿菌Q-426環(huán)脂肽樣品的分離純化Fig.1 Cyclic lipopeptides from B.amyloliquefaciens Q-426.(A) Products of lipopeptides.a: after methanol extraction; b: after treatment with HD-8 resin; c: after treatment with HD-8 and HZ-20ss resins.(B) HPLC chromatogram of cyclic lipopeptides purified by different method.a: after methanol extraction; b: after treatment with HD-8 resin; c: after treatment with HD-8 and HZ-20ss resins.Peaks 1–7 are main components with antifungal activity.

分別將甲醇抽提物、HD-8色譜柱流出液、HZ-20ss色譜柱流出液進(jìn)行了HPLC檢測，結(jié)果如圖1B所示，檢測到共7組活性組分，可明顯看出雙柱聯(lián)合處理后的樣品組分雜質(zhì)較少，分離度較好，基線穩(wěn)定。根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算得出組分1–7的產(chǎn)率分別為23.65%、36.29%、12.21%、9.80%、8.25%、7.79%和2.00%，相對于未純化的粗提樣品，活性組分產(chǎn)量 (峰面積) 均有提高，其中組分1和組分2的產(chǎn)率占總產(chǎn)一半以上，可將其單獨(dú)制備，作進(jìn)一步研究。

2.2 組分1和組分2的結(jié)構(gòu)鑒定

分別收集產(chǎn)率最大的組分1和組分2，HPLC檢測結(jié)果表明其純度分別為 95.7%和 93.1%，采用LC-ESI-MS方法測定分子量，如圖2所示，組分1得到兩個(gè)離子峰，其m/z分別為1 045.556 8和1 067.537 3，分別推測為[M+H]+和[M+Na]+的分子離子峰；組分2得到兩個(gè)離子峰，其m/z分別為 1 059.574 2和 1 081.556 8，分別推測為[M+H]+和[M+Na]+的分子離子峰。由于組分 1和組分2的m/z相差為14，即-CH2-，猜測兩個(gè)化合物互為同系物，且相差一個(gè)亞甲基。

如圖3所示，環(huán)狀肽鏈的斷開較易發(fā)生于蘇氨酸殘基 (Thr) 的C末端、天門冬酰胺殘基 (Asn) 和脯氨酸殘基 (Pro) 之間的酰胺鍵。當(dāng)前者發(fā)生斷裂時(shí)會產(chǎn)生一些碎片離子，其m/z分別為944.5 (b5)、857.4 (b4)、631.4 (b3/y3)、517.2 (b2)、355.2 (b1)、240.2 (b0) (圖3A和B)。相應(yīng)地，可以得到肽鏈的部分序列為 N-Asn-Tyr-Asn-Pro-Glu-Ser-Thr-C。與此同時(shí)，Asn和Pro殘基之間的肽鍵斷開，獲得了一些碎片離子(m/z)：769.4 (b6)、656.4 (b7)、415.6(b8)、947.5 (y1)、732.4 (y2) 和 392.2 (y4)。從而可以得到脂肪酸殘基C和N末端的氨基酸殘基序列，分別為N-Asn-Tyr-Asn-C和N-Pro-Glu-Ser-Thr-C (圖3A和 C)。根據(jù) b0，脂肪酸殘基的分子量 240.2，即CH3(CH2)11CHNHCH2CO-，因此可以確定為C-15 β(3)-氨基脂肪酸，最終確定組分 1為 C-15 Bacillomycin D，同理分析組分 2為 C-16 Bacillomycin D (圖 4)。

圖2 活性組分1和2的質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrometry of components 1 and 2.(A) Component 1.(B) Component 2.

圖3 組分1單分子離子在m/z 1 045.5 Da的MS/MS分析Fig.3 MS/MS analysis of a single peak obtianed at m/z 1 045.5 Da.(A) MS/MS profile.(B) Cleavage at C terminal of Thr.(C) Cleavage between Asn and Pro.

圖4 組分2單分子離子在m/z 1 059.6 Da的MS/MS分析Fig.4 MS/MS analysis of a single peak obtianed at m/z 1 059.6 Da.(A) MS/MS profile.(B) Cleavage at C terminal of Thr.(C) Cleavage between Asn and Pro.

2.3 環(huán)脂肽對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

MTS法檢測結(jié)果顯示，Bacillomycin D (C-15、C-16) 混合物均能抑制 Hela、MG、Hep-G2、HT-29四種腫瘤細(xì)胞的增殖。當(dāng)Bacillomycin D混合液濃度為 5 μg/mL 時(shí)，Hela、MG、Hep-G2、HT-29四種細(xì)胞的存活率分別為 75.00%、85.50%、33.15%和96.34%；當(dāng)樣品濃度為10 μg/mL時(shí)，存活率分別為64.50%、52.80%、33.09%和73.84%；當(dāng)濃度為25 μg/mL時(shí)，存活率分別為25.60%、29.40%、24.30%和44.0%；當(dāng)濃度為50 μg/mL時(shí)，存活率分別為5.30%、2.70%、20.24%和22.48%；當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，腫瘤細(xì)胞存活率均低于20%，細(xì)胞增殖依次呈濃度依賴抑制。MTS細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)表明，相較之下，環(huán)脂肽對Hela細(xì)胞、MG細(xì)胞增殖抑制作用更加呈現(xiàn)濃度依賴性，即在相同作用時(shí)間下，細(xì)胞活力隨著樣品濃度的增加而逐漸降低 (圖5)。

圖5 Bacillomycin D混合液對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of Bacillomycin D mixture on the proliferation of tumor cells.

表1 Hela細(xì)胞存活率(%)Table 1 Viability of Hela cells disposed by Bacillomycin D

由于Bacillomycin D混合物對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用明顯，因此，分別考察了C-15 Bacillomycin D、C-16 Bacillomycin D和兩者混合物對 Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 (表1)。C-16 Bacillomycin D的細(xì)胞抑制率略大于C-15 Bacillomycin D，而混合物的細(xì)胞抑制率又略大于 C-16 Bacillomycin D?？傊L鏈環(huán)脂肽的抑制率較短鏈環(huán)脂肽略高，濃度達(dá)50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞抑率可達(dá)55%以上，故后續(xù)試驗(yàn)選用C-16 Bacillomycin D進(jìn)行細(xì)胞凋亡研究。

2.4 C-16 Bacillomycin D對Hela細(xì)胞侵襲和遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)是測定腫瘤細(xì)胞運(yùn)動特性的方法之一。在體外培養(yǎng)的單層細(xì)胞上劃痕使細(xì)胞致傷，加入樣品后觀察其對腫瘤細(xì)胞遷移的影響。腫瘤細(xì)胞在轉(zhuǎn)移過程中需要侵襲和遷移能力使其順利進(jìn)入淋巴管和血管，并侵入其他器官與組織，細(xì)胞只能對相鄰組織或器官侵襲，若想轉(zhuǎn)移，還需特異性粘附因子等特異性物質(zhì)及其他復(fù)雜過程協(xié)助，所以劃痕實(shí)驗(yàn)可考察細(xì)胞致傷后是否還能愈傷，繼續(xù)具備相應(yīng)的侵襲與遷移能力。將不同濃度的C-16 Bacillomycin D作用于Hela細(xì)胞，如圖6所示，與DMSO相比，細(xì)胞的遷移能力明顯減弱，并呈現(xiàn)濃度依賴性，70 μg/mL樣品處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞遷移能力明顯被抑制。

2.5 C-16 Bacillomycin D對Hela細(xì)胞凋亡和周期的影響

利用細(xì)胞流式儀 PI染色法檢測 C-16 Bacillomycin D對人乳腺癌Hela細(xì)胞凋亡影響結(jié)果表明，未用環(huán)脂肽處理的細(xì)胞主要為活細(xì)胞，隨著藥物濃度的增大凋亡早期細(xì)胞所占比例不斷增加，凋亡晚期細(xì)胞所占比例也呈增加趨勢，當(dāng)達(dá)到一定濃度后凋亡早期細(xì)胞逐漸減少。

不同濃度 C-16 Bacillomycin D作用于 Hela細(xì)胞后，隨濃度增加，G0G1期細(xì)胞比例逐漸減少，S期細(xì)胞比例逐漸增多，G2M期比例變化不大。在樣品濃度為 50 μg/mL時(shí)，G0G1期細(xì)胞比例從對照組的89.03%減至74.07%，濃度為70 μg/mL時(shí)，急劇減至22.81%，說明C-16 Bacillomycin D誘導(dǎo)G0G1期阻滯 (圖7)。

3 討論

圖6 C-16 Bacillomycin D對Hela細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 Effect of C-16 bacillomycin D on Hela cell migration ability.(A) 0 h.(B) 24 h.

圖7 流式細(xì)胞術(shù)檢測C-16 Bacillomycin D對Hela細(xì)胞周期影響Fig.7 Cell cycle distribution of Hela cells treated with C-16 Bacillomycin D.

解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens是芽孢桿菌Bacillus屬中的一員，與枯草芽孢桿菌B.subtilis親緣性很高。多株解淀粉芽孢桿菌已被報(bào)道能夠代謝產(chǎn)生多種環(huán)脂肽化合物，還有一些菌株的全基因測序結(jié)果表明其攜帶環(huán)脂肽合成基因[24]。截至目前，對解淀粉芽孢桿菌環(huán)脂肽的研究主要集中于其化合物結(jié)構(gòu)的鑒定、發(fā)酵液或混合物的生物活性的測定以及發(fā)酵液或菌液在生物農(nóng)藥領(lǐng)域的應(yīng)用等方面[25]。由于芽孢桿菌往往在其生長過程中代謝產(chǎn)生多種環(huán)脂肽或同類環(huán)脂肽的同系物，因此，對其單一化合物的生物活性的研究遇到瓶頸，阻礙了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究和應(yīng)用。環(huán)脂肽化合物由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性及生物活性，已成為各大醫(yī)藥公司爭相開發(fā)的對象，而目前只有達(dá)托霉素成功應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域。達(dá)托霉素是玫瑰孢鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物脂肽類化合物A21978C的N-癸?；苌铮瑸樗嵝原h(huán)脂肽類抗生素，含有13個(gè)氨基酸，其中10個(gè)氨基酸形成環(huán)十脂肽，另外3個(gè)氨基酸與癸?；噙B形成側(cè)鏈，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，很難進(jìn)行化學(xué)合成。

為了獲得純度較高的環(huán)脂肽單體，本文對以前的制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)過發(fā)酵、兩步酸沉淀法、甲醇抽提、雙樹脂聯(lián)合層析，從 500 mL發(fā)酵液中分離純化得到61 mg環(huán)脂肽混合物 (主要成分為Iturins和Fengycins)，7種環(huán)脂肽組分的產(chǎn)率分別為23.65%、36.29%、12.21%、9.80%、8.25%、7.79%和 7.00%。其中，組分1與組分 2的產(chǎn)率最大，經(jīng)HPLC-MS和MS/MS分析鑒定為C-15 Bacillomycin D與C-16 Bacillomycin D。

Surfactin是由 Arima從枯草芽孢桿菌IFO3039發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)的脂肽化合物，具有很強(qiáng)的表面活性，故命名為 Surfactin。Surfactin也是由7個(gè)氨基酸和1個(gè)C13-C16脂肪酸鏈組成，但是與Bacillomycin D不同，其由脂肪酸的3位羥基和肽鏈C末端亮氨酸形成內(nèi)酯鍵而構(gòu)成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。Surfactin除具有較強(qiáng)的表面活性外，還具有抗菌、抗病毒、抗支原體、抗腫瘤和抗炎活性。Kim等報(bào)道Surfactin對人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞增殖具有很強(qiáng)的抑制活性，其抑制活性呈濃度和時(shí)間依賴性，其IC50(作用48 h) 值為26 μmol/L，在80 μmol/L濃度下處理24 h可使80%以上的細(xì)胞發(fā)生凋亡。LoVo細(xì)胞經(jīng)30 μmol/L Surfactin處理24 h后，G0/G1期的細(xì)胞增多10%，25%-30%的細(xì)胞被阻滯于細(xì)胞周期 G0/G1期內(nèi)。RT-PCR和Western blotting實(shí)驗(yàn)證明，Surfactin是通過抑制ERK和PI3K/Akt活性從而使LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡和細(xì)胞周期阻滯。Vollenbroich等測定了來源于枯草芽孢桿菌的 Surfactin 對 Molt、HeP2、H9、Vero、MT-4等細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)它們的 IC50值在30-65 μmol/L[26]。Cao等研究了 Surfactin對乳腺癌 MCF-7細(xì)胞的增殖與凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)Surfactin對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC50值 (作用48 h)為27.3 μmol/L，可引發(fā)細(xì)胞周期G2/M的阻滯，并且通過ROS/JNK信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[27-28]。

目前除Surfactins外，還沒有其他環(huán)脂肽化合物單體是否具有抗腫瘤活性的報(bào)道。為研究解淀粉芽孢桿菌 Q-426環(huán)脂肽對腫瘤細(xì)胞的抑制活性，本文選用MTS法檢測C-15 Bacillomycin D、C-16 Bacillomycin D及兩種環(huán)脂肽1∶1混合液對不同腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。將環(huán)脂肽混合液以不同濃度作用于 Hela、MG、Hep-G2、HT-29細(xì)胞，經(jīng)MTS法檢測，樣品對Hela和MG細(xì)胞呈濃度依賴性。C-16 Bacillomycin D的細(xì)胞抑制率略大于C-15 Bacillomycin D，而混合液的細(xì)胞抑制率又略大于C-16 Bacillomycin D。總之，長鏈肽的抑制率較短鏈肽的略高。Bacillomycin D混合液對 Hela、MG、HT-29細(xì)胞的 IC50值(作用48 h)分別為 13.4、11.5、15.4 μmol/L，其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效率略高于Surfactin。

以MTS法檢測C-16 Bacillomycin D對宮頸癌細(xì)胞 Hela的增殖抑制，當(dāng)其濃度為 50 μg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率可達(dá)55%以上，細(xì)胞凋亡率達(dá)59.1%；濃度為70 μg/mL時(shí)，細(xì)胞的遷移能力明顯被抑制，細(xì)胞凋亡率達(dá)71.1%，G0G1期細(xì)胞的比例減少，S期細(xì)胞的比例增多，G2M期細(xì)胞的比例變化不大，則初步證實(shí)Bacillomycin D誘導(dǎo) G0G1期阻滯。Bacillomycin D引發(fā) Hela細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制和信號通路還有待進(jìn)一步研究。

新抗生素達(dá)托霉素的上市，使環(huán)脂肽類化合物成為醫(yī)藥研發(fā)的熱點(diǎn)。但是目前對于環(huán)脂肽的研究主要集中在其抗菌活性的研究上，對其抗腫瘤活性的研究比較少。同時(shí)，不同種類環(huán)脂肽及其同系物與其生物活性之間的相互關(guān)系也不清楚，主要原因是由于很難得到純度高且成分單一的產(chǎn)物。若利用基因編輯技術(shù)規(guī)劃其生物合成路徑，或利用代謝調(diào)控和分離技術(shù)可得到單一組分純品，將加快環(huán)脂肽化合物在醫(yī)藥領(lǐng)域的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究。

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