□ 李苗苗 烏海市檢驗(yàn)檢測(cè)中心

能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來判定實(shí)驗(yàn)室或檢查機(jī)構(gòu)能力的活動(dòng)，是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的一項(xiàng)重要渠道。實(shí)驗(yàn)室能夠利用能力驗(yàn)證這種外部質(zhì)量控制手段，識(shí)別與其他實(shí)驗(yàn)室之間的差別，監(jiān)督和改進(jìn)檢測(cè)人員的檢測(cè)能力，對(duì)所用方法和儀器進(jìn)行確認(rèn)，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的內(nèi)部質(zhì)控，為自身的不斷改進(jìn)和完善質(zhì)量管理體系提供重要信息。2018年7月份本中心微生物實(shí)驗(yàn)室參加了由中國(guó)食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)實(shí)施的“NIFD-PT-147食品中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢出能力驗(yàn)證”。2018年12月實(shí)施單位公布烏海市檢驗(yàn)檢測(cè)中心檢測(cè)結(jié)果為“首次滿意”（首次即非補(bǔ)測(cè)），本文通過探討食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗(yàn)證過程，為今后實(shí)驗(yàn)室致病性微生物的檢出能力提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

樣品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，樣品為兩個(gè)凍干細(xì)菌混合樣，編號(hào)：CODE106、CODE261。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

陰性對(duì)照菌英諾克李斯特氏菌，菌株編號(hào)ATCC33090；陽性對(duì)照菌1單增李斯特氏菌，菌株編號(hào)CICC 21635；陽性對(duì)照菌2伊氏李斯特氏菌，菌株編號(hào)ATCC 19119。

1.3 試劑與儀器

李斯特氏菌增菌肉湯（LB1、LB2）基礎(chǔ)（批號(hào)：180412）、吖啶黃素3.0 mg（批號(hào)：180418）、吖啶黃素5.0 mg（批號(hào)：180423）、萘啶酮酸5.0mg（批號(hào)：180419）、萘啶酮酸4.0mg（批號(hào)：180413）、PALCAM瓊 脂 平 板（ 批 號(hào)：180426）、TAS-YE平 板（ 批 號(hào)：171201）、血瓊脂平板（批號(hào)：180621）、SIM 培 養(yǎng) 基（ 批 號(hào)：180621），以上培養(yǎng)基均購(gòu)自北京路橋技術(shù)股份有限公司；李斯特氏菌顯色平板（批號(hào)：P 001190），購(gòu)自法國(guó)科馬嘉。所使用培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)。

革蘭氏陽性細(xì)菌鑒定卡（以下簡(jiǎn)稱GP卡），購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司（編號(hào)：2420501103）；VITEK 2 COMPACT全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀、電子比濁儀，購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。

1.4 方法

按NIFD-PT-147 食品中單增李斯特菌檢出能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.30-2016）進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.1 增菌

無菌操作將兩個(gè)西林瓶?jī)?nèi)小球分別加入到10mL LB1中，充分溶解并混勻，同時(shí)做空白對(duì)照，30℃培養(yǎng)24h，分別移取0.1mL，轉(zhuǎn)種于10mL LB2增菌液內(nèi)。

1.4.2 分離

取兩個(gè)樣品及空白對(duì)照樣的LB2二次增菌液劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，36℃培養(yǎng)24h，同時(shí)做陽性和陰性對(duì)照。

1.4.3 純化

自選擇性瓊脂平板上分別挑取典型或可疑菌落，在TSA-YE平板上劃線，36℃培養(yǎng)24h。

1.4.4 鑒定

(1)動(dòng)力試驗(yàn)：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌落，穿刺SIM動(dòng)力培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)72 h，詳見附表。

（2）生化鑒定：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌落，使用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

（3）溶血試驗(yàn)：從TSA-YE平板上挑取純培養(yǎng)菌刺種到血平板上，并刺種陽性對(duì)照菌（伊氏李斯特氏菌）和陰性對(duì)照菌（英諾克李斯特氏菌），36 ℃培養(yǎng) 48h。

1.4.5 結(jié)果

食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果見表1。

兩個(gè)樣品在科馬嘉顯色培養(yǎng)基上長(zhǎng)出兩種藍(lán)色菌落，其中一種帶有白色暈環(huán)，而另一種不帶有白色暈環(huán)，經(jīng)VITEK 2 COMPACT鑒定，帶有白色暈環(huán)的藍(lán)色菌落為單增李斯特氏菌（99% Listeria monocytogenes）,而不帶有白色暈環(huán)的藍(lán)色菌落為英諾克李斯特氏菌（99%Listeria innocua），所以兩個(gè)樣品均為檢出單增李斯特氏菌。

2 討論

（1）李斯特菌在環(huán)境中無處不在，在絕大多數(shù)食品中都能找到[2]實(shí)驗(yàn)過程中，樣品增菌、分離應(yīng)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)。溶血試驗(yàn)應(yīng)帶有陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，否則檢驗(yàn)者可能對(duì)GB 4789.30-2016中“狹窄、清晰明亮溶血圈”和“寬的、輪廓清晰的溶血區(qū)域”沒有相應(yīng)的衡量標(biāo)準(zhǔn)。

表1 食品中單增李斯特氏菌檢出能力驗(yàn)證結(jié)果

（2）單增李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌的菌落形態(tài)在PALCAM培養(yǎng)基上無明顯差異，均為圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，原因是PALCAM培養(yǎng)基中含有七葉甙的成分，上述兩種李斯特氏菌均能水解七葉甙，并且與鐵離子產(chǎn)生焰色反應(yīng)而使菌落為灰綠色，并帶有棕褐色水解圈，從而導(dǎo)致兩種李斯特氏菌無法被有效區(qū)分[3]。而科馬嘉顯色平板可以有效鑒別單增李斯特菌和英諾克李斯特氏菌，前者在科馬嘉顯色平板上為藍(lán)色菌落，帶有白色暈環(huán)，而后者為不帶白色暈環(huán)的藍(lán)色菌落。

（3）VITEK 2 COMPACT方法 是GB 4789.30-2016允許的鑒定方法，較傳統(tǒng)生化鑒定不僅方法更加準(zhǔn)確、快速，還減少了人為因素的干擾[4]。鑒定用菌落宜經(jīng)過純化培養(yǎng)，避免從顯色平板上直接挑取進(jìn)行鑒定。因?yàn)檫x擇平板中所含有的特殊化學(xué)成分對(duì)細(xì)菌有毒性，導(dǎo)致藥敏分析反應(yīng)不靈敏，可能使結(jié)果判讀有誤[5]。