姚亞林， 羅強， 董夢書， 陳祥盛， 楊琳*

1. 貴州大學林學院，貴陽550025； 2. 貴州大學昆蟲資源開發(fā)利用省級特色重點實驗室，貴陽550025； 3. 貴州大學昆蟲研究所，貴陽550025； 4. 貴州大學貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害省級重點實驗室，貴陽550025)

葉蟬是半翅目Hemiptera葉蟬科Cicadellidae物種的統(tǒng)稱，其種類多、數(shù)量大，是農(nóng)林害蟲中的重要類群。西南地區(qū)是我國也是世界竹類生產(chǎn)和分布中心區(qū)域之一。近年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，西南地區(qū)慈竹Bambusaemeiensis葉蟬類害蟲種類多、數(shù)量大且分布廣，危害嚴重。對該地區(qū)竹林葉蟬類害蟲進行多樣性研究是林業(yè)生態(tài)系統(tǒng)保護和林業(yè)資源管理的共同需求，但葉蟬類害蟲的物種鑒定一直是多樣性研究的難點，主要原因有：(1)葉蟬類昆蟲體型和體色等鑒別特征的形態(tài)性狀復雜多變，易隨發(fā)育階段或生境的改變而產(chǎn)生較大變化，如額垠葉蟬屬Mukaria種類(Yang & Chen，2011)，傳統(tǒng)形態(tài)鑒定容易造成同種異名或異種同名等錯誤；(2)由于缺乏對竹類葉蟬整個生活史的了解，不同蟲態(tài)葉蟬物種的鑒定較困難。近年來，隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分子鑒定技術(shù)為物種分類與鑒定研究提供了有效手段。

DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)極大方便了物種鑒定工作(Hebertetal.，2003，2004a)。在大多數(shù)動物類群中，線粒體細胞色素C氧化酶第一亞基(COⅠ)基因被廣泛采納為通用的標準條形碼基因片段(Hebertetal.，2004b；Wardetal.，2005；Hajibabaeietal.，2006；Ratnasinghametal.，2007)。然而在有些動物類群中，COⅠ基因并不是唯一適合的條形碼片段，如Sinniger等(2008)對六放珊瑚目Zoanthidea及Stampar等(2012)對角海葵目Cerianthidea的研究發(fā)現(xiàn)，COⅠ和16SrRNA基因均可準確區(qū)分近緣種，實現(xiàn)物種的準確鑒定；亦有研究表明，一些類群(如角頂葉蟬類Deltocephalus-like、彎鉤葉蟬屬Flexamia、黃翅葉蟬屬Dalbulus)的16SrRNA基因序列片段可用于區(qū)分近緣種(Fangetal.，1993；Dietrich，1997)，可見不同動物類群的最適條形碼并非一致。在葉蟬類昆蟲的DNA條形碼研究中，相比于COⅠ基因，16SrRNA基因序列片段較易擴增，常被作為一種有效的分子標記，用于區(qū)分形態(tài)近似種或描述新發(fā)現(xiàn)的種類(Schuchert，2006；Migliettaetal.，2009；Mirandaetal.，2010；Mouraetal.，2011a，2011b)，然而，我國西南地區(qū)竹林葉蟬科昆蟲DNA條形碼的相關(guān)研究尚未有報道。

本文以中國常見竹種慈竹為寄主的葉蟬類昆蟲為研究對象，擴增其COⅠ和16SrRNA基因序列片段，比較兩者作為標準條形碼基因片段的適用性和潛力，同時，結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹和矢量分析法評估這2個基因序列片段在竹子葉蟬分子鑒定中的應用前景，為竹林葉蟬類昆蟲的準確快速鑒定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試葉蟬

實驗葉蟬于2014年5月—2016年11月采集于貴州、四川、云南、重慶4個省市的26個地區(qū)，傳統(tǒng)形態(tài)分類方法鑒定，采集及物種鑒定信息如表1所示。采集的成蟲浸泡于1.5 mL離心管中，第一個月更換無水乙醇3～4次(Sunetal.，2013)，后放置于-70 ℃超低溫冰箱中長期保存待用(Zhang & Kang，2001；Zhangetal.，2004)，其余未經(jīng)酒精浸泡的標本干燥處理后保存于貴州大學昆蟲研究所標本館。

1.2 試劑及儀器

昆蟲DNA提取試劑盒購于Omega BioTek(D0926-01)；引物由生物工程(上海)股份有限公司合成；Olympus SZ2-ILST型光學體視顯微鏡(德國Leica)；T100TMThermal Cycler型PCR擴增儀(美國Bio-Rad)；170-8170型UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；Power PacTMHV Power Supply型電泳儀(美國Bio-Rad)；Mini-10K微型高速離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；HVE-50型自動高壓滅菌器(日本HIRAYAMA)。

1.3 DNA提取及PCR擴增

標本解凍后，將腹部放入甘油中保存，剩余的蟲體取頭、胸、足等部分研磨至粉末狀，然后用Omega BioTek生產(chǎn)的E.Z.N.A.TMInsect DNA kit試劑盒提取總DNA，產(chǎn)物-20 ℃保存。

表1 物種采集信息Table 1 Information of sampling

注： BB3. 重慶北碚， LC7. 云南綠春， LD1. 貴州黔南羅甸， LS2. 四川樂山， PD4. 貴州安順普定， WS4. 云南文山， YB3. 四川宜賓

Notes： BB3. Beibei district of Chongqing， LC7. Lvchun county， Yunnan province， LD1. Luodian county， Guizhou province， LS2. Leshan city， Sichuan province， PD4. Puding county， Guizhou province， WS4. Wenshan city， Yunnan province， YB3. Yibin city， Sichuan province

以提取的總DNA為模板進行序列的PCR擴增，反應程序參照Folmer等(1994)，擴增引物分別為：16SrRNA-F：5’-CCGGTYTGAACTCARATCAWGT-3’，16SrRNA-R：5’-CTGTTTAWCAAAAACATTTC-3’；COⅠ-F：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3’，COⅠ-R：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAAT-3’。PCR反應體系為30 μL：模板DNA 3 μL，上下游引物各1 μL，Taq PCR Master Mix 15 μL，ddH2O補至30 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物取3 μL采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化步驟參照DNA凝膠回收試劑盒Omega BioTek(D0926-01)程序。回收產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得的測序峰圖利用DNAstar 5.0進行正反鏈校對和編輯，手動去除序列兩端的引物區(qū)，獲得有效片段的樣本序列。Meglign進行排序后利用Clustal X進行多序列比對，采用DnaSP v5計算信息位點、變異位點數(shù)，通過MEGA 6.06分析堿基組成、變異位點，基于Kimura-2-parameter(K2P)模型進行遺傳距離分析，采用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，節(jié)點支持率采用自展值進行估計，重復檢驗1 000次。選取蟬總科蟬科Cicadoidea的日本寒蟬Meimunaopalifera(16SrRNA基因序列GenBank登錄號為AY139968.1)及蠟蟬總科Fulgoroidea飛虱科Delphacidae的四刺小頭飛虱Malaxellatetracantha(COⅠ基因和16SrRNA基因序列GenBank登錄號分別為HM233883.1和HM233744.1)和黃小頭飛虱Malaxellaflava(COⅠ基因和16SrRNA基因序列GenBank登錄號分別為HM233896.1和HM233772.1)共6條序列作為外群。參照Sirovich等(2009，2010)的矢量分析方法，構(gòu)建中國慈竹常見葉蟬科昆蟲條形碼Klee-diagram矢量圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

經(jīng)通用引物PCR擴增、序列測定，共獲得COⅠ和16SrRNA基因序列45條，其中，COⅠ基因序列4科 5屬8種21條，GenBank登錄號為MG376677～MG376697；16SrRNA基因序列3科7屬9種24條，GenBank登錄號為MG376698～MG376721。利用MEGA 6.06對21條竹類葉蟬COⅠ基因序列進行比對后保留了590個的同源性序列，分析表明，在590個位點中沒有插入和缺失，總體序列的T、C、A、G平均含量分別為36.20%、12.70%、41.10%、10.00%，A+T含量較高，為77.30%；保守位點、變異位點和簡約信息位點分別為310個、280個和237個，在590個位點中分別占52.54%、47.46%和40.17%。對24條16SrRNA基因序列進行比對后保留了463 bp的同源性序列，分析表明，在463個位點中存在59個插入/缺失位點，總體序列的T、C、A、G平均含量分別為35.60%、15.10%、41.20%、8.10%，A+T含量較高，為76.80%；保守位點、變異位點和簡約信息位點分別為235個、221個和192個，在463個位點中分別占50.76%、47.73%和41.47%。COⅠ基因和16SrRNA基因的T、C、A、G含量不同，但均呈現(xiàn)出明顯的A+T偏向性，特別是COⅠ基因密碼子第三位C、G平均含量在不同物種間差異很大。

2.2 遺傳差異

以K2P模型計算序列間遺傳距離，并按照分類階元進行統(tǒng)計分析(表2～表4)。結(jié)果顯示，16SrRNA基因序列的種內(nèi)遺傳距離為0～0.010(均值為0.003)，而同科不同種間的遺傳距離為0.151～0.396(均值為0.257)，其中，斑翅額垠葉蟬M.maculata和白斑額垠葉蟬Mukariaalbinotata間的遺傳距離最小，為0.151，叉突平額葉蟬Flatfrontapronga和緬甸安小葉蟬Anakaburmensis間的遺傳距離最大，為0.396。COⅠ基因的種內(nèi)遺傳距離為0～0.013(均值為0.004)，其中84%的種內(nèi)遺傳距離小于0.003(圖2)，這可能與擴增的葉蟬樣本中緬甸安小葉蟬和額垠葉蟬群體的序列所占比重大，而其他葉蟬只有單條序列有關(guān)；緬甸安小葉蟬云南綠春種群(LC7)與其他種群間出現(xiàn)種內(nèi)遺傳距離的最大值(0.013)；COⅠ基因的種間遺傳距離為0.159～0.341(均值為0.283)，斑翅額垠葉蟬和白斑額垠葉蟬間的遺傳距離最小(0.159)；2個基因序列在所調(diào)查種類中，種內(nèi)遺傳差異均小于種間遺傳差異，存在明顯的條形碼間隔(圖1，圖2)。

2.3 基于系統(tǒng)發(fā)育樹的物種鑒定

基于COⅠ和16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹中，2個基因片段所有同種的序列都能形成具有較高支持度的單分支(圖3，圖4)。小葉蟬亞科Typhlocybinae、圓痕葉蟬亞科Megophthalminae、離脈葉蟬亞科Coelidiinae和角頂葉蟬亞科Deltocephalinae的分支證明COⅠ和16SrRNA基因序列均能很好地區(qū)分物種。在更高的分類階元中，16SrRNA基因序列可將額垠葉蟬族Mukariini中的額垠葉蟬屬(斑翅額垠葉蟬、白斑額垠葉蟬、白足額垠葉蟬M.pallipes、竹額垠葉蟬Mukariabambusana)成功分為單性孔組和雙性孔組兩大支，二點顏脊葉蟬Xenovartaacuta與(叉突平額葉蟬+峨眉條背葉蟬Tiaobeiniaemaiensis+雙帶痕葉蟬Mohuniabifasciana)這一支系也能較好分開(圖3)；而COⅠ基因序列在額垠葉蟬族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中(圖4)，額垠葉蟬屬與叉突平額葉蟬、峨眉條背葉蟬、雙帶痕葉蟬也能很好分開，且也成功分為單性孔組和雙性孔組兩大支，證明COⅠ基因序列亦能有效區(qū)分物種。

表2 葉蟬類各分類階元遺傳距離統(tǒng)計Table 2 Genetic distance on different taxonomic levels of leafhoppers

圖1 16S rRNA基因序列片段的種內(nèi)與種間K2P遺傳距離的分布頻率Fig. 1 Frequency distribution of the K2P intra- and inter-species genetic distances for 16S rRNA gene sequences

圖2 COⅠ基因序列片段的種內(nèi)與種間K2P遺傳距離的分布頻率Fig. 2 Frequency distribution of the K2P intra- and inter-species genetic distances for COⅠ gene sequences

2.4 基于Klee-diagram的矢量分析

基于西南地區(qū)常見慈竹葉蟬的矢量分析發(fā)現(xiàn)，COⅠ和16SrRNA基因片段均顯示明顯的種內(nèi)序列比對“熱區(qū)”，即種內(nèi)序列相似程度明顯高于種間序列，直觀顯示出種內(nèi)、種間遺傳距離差異；2個片段的緬甸安小葉蟬序列均表現(xiàn)為獨立的“熱區(qū)”，顯示出其與角頂葉蟬亞科額垠葉蟬族、大葉蟬亞科Cicadellinae序列的明顯差別，這與NJ樹分析結(jié)果一致(圖5，圖6)。

3 討論

理想的條形碼種內(nèi)遺傳差異會小于近緣物種種間差異(Del-Pradoetal.，2010)，即種內(nèi)、種間遺傳差異的幅度確定了物種的界限(K?hler，2007)。若種內(nèi)、種間遺傳差異存在重疊，則說明該分子標記無法準確區(qū)分物種。理論上，有效的DNA條形碼應存在條形碼間隔，即種內(nèi)、種間遺傳距離差異明顯。

圖3 基于16S rRNA基因序列的鄰接樹Fig. 3 Neighbor-Joining clustering based on 16S rRNA gene sequences

Hebert等(2003)提出，種間遺傳差異應達到種內(nèi)遺傳差異的10倍。有研究證實，水螅綱Hydrozoa多個類群的COⅠ基因序列片段種內(nèi)、種間遺傳距離并不重疊(Zemlaketal.，2009；Ortmanetal.，2010；Sunetal.，2012)。本研究所涉及種類的COⅠ和16SrRNA基因序列片段均有明顯條形碼間隔，未出現(xiàn)種內(nèi)、種間遺傳差異存在重疊的種群。2個片段同屬種間的遺傳距離均比種內(nèi)高出30倍，證實了它們作為慈竹葉蟬類昆蟲DNA條形碼標準基因的可行性。結(jié)果出現(xiàn)高30倍的主要原因可能是本研究是對寄主慈竹上有分布的葉蟬科昆蟲標本進行采樣擴增，而葉蟬科昆蟲還有其他寄主，因受寄主范圍的限制致使出現(xiàn)這一結(jié)果。

本研究針對西南地區(qū)慈竹常見葉蟬類昆蟲，基于K2P遺傳距離和NJ樹的方法證明了COⅠ和16SrRNA基因序列片段均可有效運用于DNA條形碼研究，這一結(jié)果可促進葉蟬類的生物多樣性研究。但基于NJ樹鑒定物種時，應考慮該方法是基于距離類的建樹方法，在序列分歧較大的數(shù)據(jù)中估計的序列間遺傳距離方差較大，這將對系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲分

圖4 基于COⅠ基因序列的鄰接樹Fig. 4 Neighbor-Joining clustering based on COⅠ gene sequences

支結(jié)構(gòu)和支長估計帶來影響(Yang & Rannala，2010)，而本文研究對象類群跨度也較大，可能存在類似的影響。自Sirovich等(2009，2010)引入矢量分析后，Klee-diagram有效地促進了DNA條形碼的應用，但Klee-diagram矢量分析只將未知序列劃歸到確定的種、屬等動物類群，并未對序列的演化狀態(tài)做出推斷(Sirovichetal.，2009；Stoeckle & Coffran，2013)，因此，不能從系統(tǒng)發(fā)育與演化的角度來評價和討論Klee-diagram矢量分析的鑒定效率。依本研究中Klee-diagram矢量分析結(jié)果，16SrRNA基因序列的鑒定效率較優(yōu)于COⅠ基因，因樣本量限制等原因，這種結(jié)果可能不具有普遍性，下一步還需竹類葉蟬科昆蟲大樣本數(shù)據(jù)驗證。盡管該方法并未給出明晰的譜系關(guān)系，但因適宜大樣本數(shù)據(jù)和可視化界面等，其在農(nóng)林昆蟲的準確鑒定中仍有較大的應用潛力。

盡管如此，基于種內(nèi)種間遺傳差異、矢量分析的類群劃分和系統(tǒng)發(fā)育樹分析等方法在農(nóng)林葉蟬類昆蟲的多樣性研究中還將發(fā)揮更大的作用。由于本研究獲取的基因片段數(shù)量和寄主范圍局限，未能在更廣泛的地理范圍內(nèi)討論竹類葉蟬科昆蟲的遺傳差異和隱種分化對這2個片段鑒定效率的影響。今后隨著調(diào)查和采集的深入，竹類葉蟬科昆蟲標本的增加以及其他候選條形碼基因片段的加入，可能呈現(xiàn)出不同遺傳差異，出現(xiàn)種內(nèi)、種間遺傳差異存在重疊的種群，因此，使用種內(nèi)種間遺傳差異達到10倍閾值鑒定不同物種的方法受到限制；若利用不同候選條形碼基因片段構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定物種，有可能出現(xiàn)基因樹沖突問題，因此，應當考慮多種方法整合分析和評價不同候選條形碼基因片段的鑒定功效。

圖5 16SrRNA基因條形碼矢量圖
Fig. 5 Klee-diagram for the 16SrRNAgene

橫縱坐標均為序列編號； 彩色圖例自冷色至暖色表示序列相似性增加； 白色虛線框內(nèi)分別表示緬甸安小葉蟬、額垠葉蟬族和外群等； 下同

Horizontal and vertical coordinates indicate the sequence numbers； color gradation in red indicates high correlation values； white dash line box indicate sequences ofAnakaburmensis， Mukariini and outgroup； the same below

1.Mukariamaculata； 2.Mukariaalbinotata； 3.Mukariabambusana； 4.Mohuniabifasciana； 5.Flatfrontapronga； 6.Tiaobeiniaemaiensis； 7.Xenovartaacuta； 8.Anatkinaillustris； 9.Anakaburmensi； 10.Malaxellaflava； 11.Malaxellatetracantha； 12.Meimunaopalifera

圖6 COⅠ基因條形碼矢量圖Fig. 6 Klee-diagram for the COⅠ gene

1.Mukariabambusana； 2.Dryodurgadeslamellaris； 3.Mukariapallipes； 4.Mukariaalbinotata； 5.Mukariamaculata； 6.Olidianahuangmina； 7.Anakaburmensi； 8.Tiaobeiniaemaiensis； 9.Malaxellaflavai； 10.Malaxellatetracantha

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