王亞楠, 王曉斐,王自良*

1(河南科技學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003) 2(河南科技學(xué)院 新科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)，453003)

黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)是由黃曲霉(Aspergillusflavu)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)經(jīng)聚酮途徑所產(chǎn)生的含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰?fù)Y(jié)構(gòu)相似的一組有毒次生代謝產(chǎn)物[1]。AF對人體健康具有急性、慢性、致癌、免疫抑制等多種毒性危害作用，自然條件下產(chǎn)生的AF主要包括B1、B2、G1、G2四種，且這4種毒素殘留對人體健康的毒性往往具有協(xié)同和加性效應(yīng)，實(shí)施黃曲霉毒素總量(total aflatoxins，TAFs)檢測已成為當(dāng)前食品質(zhì)量安全檢測領(lǐng)域發(fā)展的必然趨勢[2]。針對這一新的限量要求及在食品國際貿(mào)易中的作用，世界上許多國家都展開了TAFs最大殘留限量(maximum residue limit，MRL)及檢測方法的研究，至 2013 年已有 91 個國家制定了TAFs在不同食品中的MRL，如國際食品法典委員會(CAC)和美國食品與藥物監(jiān)督管理局(FDA)等規(guī)定食品中TAFs的MRL為15 μg/kg，日本為10 μg/kg，歐盟(EC)為4 μg/kg，我國現(xiàn)行的《GB 2761—2011 食品中真菌毒素限量》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了AFB1的限量標(biāo)準(zhǔn)，尚未涉及TAFs限量要求，但在《GB/T 5009.23—2006 食品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了TAFs限量檢測方法[3]。

食品中TAFs檢測方法目前主要有生物分析法(bioassay，BA)、理化分析法(physicochemical analysis，PCA)和免疫分析法(immunoassay，IA)三種，本文就食品中TAFs檢測方法的研究進(jìn)展、應(yīng)用情況、技術(shù)優(yōu)勢與缺陷及今后的發(fā)展趨勢進(jìn)行探討，旨在為食品TAFs檢測方法的選擇使用和發(fā)展完善提供借鑒和思路。

1 生物分析法

BA的基本原理是通過生物體實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證樣品的毒性部位和毒性機(jī)理，以染毒動物攝入后膽管異常增生程度為主要根據(jù)，判斷毒物含量的多少[4]。此法最早應(yīng)用于雛鴨，后經(jīng)不斷發(fā)展，派生出其他的生物分析法，主要包括雞胚法、軟體動物卵試驗(yàn)法、組織培養(yǎng)法、豚鼠鑒定法、皮膚毒性實(shí)驗(yàn)法、種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)法、微生物鑒定法等。BA的優(yōu)點(diǎn)是對樣品純度要求不高，設(shè)備要求簡單。其缺點(diǎn)是專一性不強(qiáng)，靈敏度較低，操作繁瑣，費(fèi)用較高，目前除在機(jī)體對毒素耐受性和毒理學(xué)研究應(yīng)用外，實(shí)際檢測中已很少使用[5]。

2 理化分析法

目前各國主要采用的理化分析方法有薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、時間分辨熒光分析法(time resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)等，分述如下。

2.1 薄層色譜法

TLC的基本原理是將樣品經(jīng)過提取、濃縮、薄層分離后，在365 nm紫外激發(fā)顯色，其中B1、B2產(chǎn)生藍(lán)紫色熒光，G1、G2產(chǎn)生黃綠色熒光，以此來確定TAFs，為半定量分析方法[6]。該方法于1963年由BROADBENT等[7]建立，后經(jīng)不斷發(fā)展，根據(jù)其展開方法又分為單向展開法和雙向展開法，后者靈敏性更好。TCL的優(yōu)點(diǎn)是所需儀器設(shè)備簡單，操作簡便，易于普及，是TAFs檢測較為經(jīng)典的方法，目前國內(nèi)外仍在使用。其缺點(diǎn)是樣品前處理復(fù)雜，操作繁瑣，耗時耗力，干擾因素多，測定結(jié)果的準(zhǔn)確性差。ROBB等[8]采用該方法檢測樣品中TAFs，B1、B2、G1、G2的檢測限(limit of detection，LOD)均可達(dá)到0.5 μg/kg。1990年，該方法被美國官方分析化學(xué)家協(xié)會(Association of Official Agricultural Chemists，AOAC)列為標(biāo)準(zhǔn)方法[9]。我國國家標(biāo)準(zhǔn)中《食品黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測定》仍采用TLC法[10]。OTTA等[11]于2000年研究報道了過壓薄層色譜法(overpressured-layer chromatography，OPLC)，可同時檢測食品中B1、B2、G1和G2，實(shí)現(xiàn)了TAFs檢測，檢測靈敏度達(dá)1 μg/kg，符合歐盟對食品TAFs的MRL標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 高效液相色譜法

HPLC的原理是樣品經(jīng)過凈化后，在適宜的流動相下，采用反相C18色譜柱對TAFs進(jìn)行分離，依據(jù)每種AF的熒光特性，在熒光檢測器作用下，實(shí)現(xiàn)TAFs的定性和定量檢測[12]。該方法由RAO等于1973年建立，可同時檢測B1、B2、G1、G2，LOD為1 μg/kg，后經(jīng)不斷發(fā)展，派生出正相液相色譜法(normal phase HPLC，NP-HPLC)和反相液相色譜方法(reversed phase HPLC，RP-HPLC)，其中RP-HPLC 的靈敏性與穩(wěn)定性更好，RP-HPLC更受使用者青睞，但RP-HPLC對AF分子具有選擇性，即對B2、G2的靈敏度高，而B1和G1的熒光強(qiáng)度在含水的溶劑中容易發(fā)生淬滅致使靈敏度很低甚至無法檢出，需要進(jìn)行柱前或柱后衍生以增強(qiáng)其熒光性[13]。HPLC的優(yōu)點(diǎn)是分辨率高，結(jié)果可靠，靈敏度高，能夠自動化操作，適于大批量樣品的定性、定量和多元分析，是國內(nèi)外食品TAFs定量檢測方法中最權(quán)威、最易被接受的方法。其缺點(diǎn)是儀器設(shè)備昂貴，技術(shù)水平要求高，樣品需要進(jìn)行前處理，不適合快速、現(xiàn)場檢測[14]。朱鵬飛等[15]采用三氟乙酸柱前衍生-RP-HPLC測定食品中TAFs，結(jié)果表明，對B1、G1的LOD為0.1 μg/kg，對B2、G2的LOD為0.03 μg/kg，精密度為0.13%～9. 5%，加標(biāo)回收率為70%～106%。吳燕等[16]采用化學(xué)柱后衍生-RP-HPLC測定糧谷類食物中TAFs，結(jié)果表明，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.50 μg/kg、0.15 μg/kg、0.50 μg/kg和0.15 μg/kg，加標(biāo)回收率為86.7%～97.2%。無論柱前或柱后衍生，RP-HPLC靈敏度高，重現(xiàn)性好，能夠很好滿足食品中TAFs檢測的需要。

2.3 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

HPLC-MS/MS的基本原理是使用合適的接口技術(shù)將HPLC與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)結(jié)起來，它將HPLC的高效分離能力和MS的高靈敏度這兩種優(yōu)勢結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)多種化合物的定性和定量分析[17]。HPLC-MS/MS的優(yōu)點(diǎn)是具有快速，高效，分辨率高，微量進(jìn)樣和自動化，相比于HPLC，無需進(jìn)行柱前或柱后衍生處理，操作相對簡捷，有很大的優(yōu)勢，使用越來越廣泛。其缺點(diǎn)是儀器設(shè)備昂貴，專業(yè)技術(shù)人員水平要求高[18]。MCCULLUM等[19]用HPLC-MS/MS檢測食品TAFs，結(jié)果表明，檢測范圍為0.006～3.0 μg/kg，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.001 2、0.001 2、0.001 2 μg/kg和0.003 1 μg/kg，加標(biāo)回收率為97.0%～108.0%。王巖松等[20]用HPLC-MS/MS檢測谷物中TAFs，結(jié)果表明，對B1、B2、G1、G2的LOD分別為0.1、0.1、0.2 μg/kg和0.3 μg/kg，加標(biāo)回收率為74.6%～89.6%，通過實(shí)際檢測應(yīng)用，谷物樣品中B1、G1殘留量為5.86 μg/kg和8.6 μg/kg，B2、G2未檢出。

3 免疫分析法

目前已建立的TAFs免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbant ssay，ELISA)、膠體金免疫層析法(gold immunochromatographic assay，GICA)、熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay，F(xiàn)IA)和免疫傳感器法(immunosensor，IS)等。

3.1 酶聯(lián)免疫吸附法

ELISA檢測小分子半抗原的原理是將抗原(或抗體)包被于酶標(biāo)板，同時加入抗體與待測半抗原(或酶標(biāo)半抗原與待測半抗原)，抗原與待測半抗原(或酶標(biāo)半抗原與待測半抗原)共同競爭抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，洗板后酶標(biāo)板上僅留下抗原與抗體(或酶標(biāo)半抗原與抗體)反應(yīng)結(jié)合的抗原抗體復(fù)合物，復(fù)合物的量與待測半抗原的量呈負(fù)相關(guān)，通過酶底物催化顯色，根據(jù)顏色的深淺有無對待測半抗原進(jìn)行定性和定量檢測。分析方法包括間接競爭ELISA(indirect competitive ELISA，icELISA)和直接競爭ELISA(direct competitive ELISA，dcELISA)兩種技術(shù)模式。ELISA的優(yōu)點(diǎn)是快速方便、操作簡單、成本較低、篩檢樣品量大。缺點(diǎn)是由于抗體與酶均屬生物活性物質(zhì)，需要低溫保存，易受環(huán)境和反應(yīng)條件影響，穩(wěn)定性差；存在非特異性反應(yīng)，檢測結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題；樣品萃取需要脫脂、脫鹽、調(diào)節(jié)pH等，樣品前處理復(fù)雜。LI等[21]用篩選出的10C9細(xì)胞株所分泌的mAb建立了TAFs ciELISA檢測方法，檢測范圍為2.1～3.2 μg/kg，添加回收率為87.5%～102.0%。KIM等[22]用篩選出的8H10細(xì)胞株所分泌的mAb建立了TAFs dcELISA檢測方法，檢測范圍為0.2～25 μg/kg，添加回收率為79.18%～91.27%。計融等[23]用自制的TAFs mAb研制出食品TAFs快速檢測ELISA試劑盒，其對FAFs B+G標(biāo)準(zhǔn)品的LOD為0.26 μg/kg，檢測范圍為0.26～20.00 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的CR分別為100%、57.5%、104.0%和19.0%，對玉米3個加標(biāo)回收率分別為98.63%、94.56%和112.05%，對花生的3個加標(biāo)回收率分別為88.66%、87.50%和85.60%。目前，國內(nèi)外許多公司研發(fā)出商品化、標(biāo)準(zhǔn)化的TAFs檢測ELISA試劑盒，在靈敏性、特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、適用性等方面均有良好的表現(xiàn)，已成為TAFs檢測的重要手段。如ZHENG等[24]用新加坡Biomin公司的TAFs ELISA試劑盒檢測玉米、高粱、小麥、大米、大豆、花生和棉籽等樣品，LOD為4.0 μg/kg，檢測范圍為4.0～40.0 μg/kg。IQBAL等[25]用美國Romer Labs科技公司的TAFs ELISA試劑盒對120個糙米樣品進(jìn)行檢測，并用TLC、HPLC和LC-MS/MS進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，ELISA試劑盒的LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～40.0 μg/kg，加標(biāo)回收率范圍為83.2%～90.4%，實(shí)際檢出陽性88個，樣品TAFs值為1.24～11.68 μg/kg，檢測結(jié)果與TLC、HPLC和LC/MS-MS的檢測結(jié)果完全一致，檢測靈敏度ELISA試劑盒優(yōu)于TLC，但稍低于HPLC和LC/MS-MS。

3.2 膠體金免疫層析法

GICA檢測小分子半抗原的原理是當(dāng)樣品中不含小分子半抗原時，游離的金標(biāo)抗體與固定在膜上的半抗原結(jié)合形成紅色條帶，檢測結(jié)果呈陰性；當(dāng)樣品中含有小分子半抗原時，其與游離的金標(biāo)抗體結(jié)合，抑制了金標(biāo)抗體與固定在膜上的半抗原結(jié)合，樣品中小分子半抗原的含量決定了膜上紅色條帶的深淺或有無，檢測結(jié)果呈陽性。GICA的優(yōu)點(diǎn)是快速、簡便、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可現(xiàn)場檢測、篩檢樣品量大。缺點(diǎn)是只能定性或半定量檢測，無法準(zhǔn)確定量；檢測靈敏度不及ELISA、HPLC和LC/MS-MS[26]。ANFOSSI等[27]利用自主研制的B族、G族混合單抗研制出TAFs檢測試紙(test strip)，LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～40.0 μg/kg，用test strip對25個玉米樣品進(jìn)行檢測，并用HPLC進(jìn)行確證，檢測結(jié)果與HPLC完全相符。ZHANG等[28]用自主制備的1C11雜交瘤所分泌的單一通用單抗研制出TAFs test strip，LOD為0.46 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的LOD分別為0.03 μg/kg、0.06 μg/kg、0.12 μg/kg和0.25 μg/kg，用test strip檢測花生樣品，對檢出的20個陽性樣品分別測定TAFs污染組分，并用HPLC進(jìn)行確證，結(jié)果表明，同時檢出Bl、B2、Gl和G2污染樣品0個，同時檢出Bl、B2和Gl污染樣品3個，同時檢出Bl和B2污染樣品18個，只檢出Bl污染樣品1個，只檢出B2污染樣品1個，檢測與HPLC完全一致。徐振斌等[29]應(yīng)用美國Clover Icheck公司的TAFs test strip對市售96個玉米樣品進(jìn)行篩檢，檢出的5個陽性樣品用HPLC確證，Test strip的LOD為1.0 μg/kg，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于15.2%，加標(biāo)回收率范圍為82.4%～95.8%，test strip的檢測結(jié)果與HPLC的檢測結(jié)果完全一致。

3.3 熒光免疫分析法

FIA的原理是基于熒光未標(biāo)記的抗原(Ag)和熒光標(biāo)記抗原(Ag-F)共同競爭結(jié)合抗體(Ab)的有限位點(diǎn)而實(shí)現(xiàn)的免疫分析方法，目前已建立的用于TAFs檢測的FIA主要包括熒光偏振免疫分析法(fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA)和時間分辨熒光免疫分析法(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)兩種。

3.3.1 熒光偏振免疫分析法

FPIA檢測小分子半抗原的原理是用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體，抗原抗體進(jìn)行特異性結(jié)合反應(yīng)后，依據(jù)抗原抗體結(jié)合物熒光偏振程度的差異，用競爭性方法測量待測樣品中小分子化合物的含量。分析方法包括置換(single-reagent FPIA)、停流FPIA(stopped-flow FPIA)和有機(jī)介質(zhì)FPIA(organic medium FPIA)三種技術(shù)模式。FPIA的優(yōu)點(diǎn)是高通量、速度快、操作簡便、檢測成本低、定量檢測和可大批量快速篩選樣本。缺點(diǎn)是由于存在基質(zhì)效應(yīng)導(dǎo)致有假陽性、由于需要專門熒光偏振設(shè)備導(dǎo)致儀器成本高、由于多采用杯式檢測裝置導(dǎo)致試劑用量大且檢測效率低[30]。NASIR等[31]用研制的TAFs族特異性單抗建立FPIA，檢測谷物樣品包括玉米、高粱、花生油、花生醬中TAFs殘留，并與HPLC比較確證，添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明，TAFs混合物Bl/B2/Gl/G2按重量比為7/1/3/1，F(xiàn)PIA的LOD為1.0 μg/kg，檢測范圍為1.0～32.0 μg/kg，檢測結(jié)果與HPLC的檢測結(jié)果完全一致，研究結(jié)論為FPIA可用于TAFs檢測。SHENG等[32]用廣譜性較強(qiáng)的抗AFB1單抗建立FPLA，其對AFB1的IC50值為23.33 μg/kg，LOD為13.12 μg/kg，對Bl、B2、Gl和G2的CR分別為100%、65.7%、143%和23.5%，所建立的FPLA可用于TAFs的檢測。

3.3.2 時間分辨熒光免疫分析法

TRFIA檢測小分子半抗原的原理是使用鑭系元素(Eu、Tb、Sm、Dy等)長效熒光標(biāo)記物，在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度的分析方法。TRFIA的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便、靈敏度高、檢測線性范圍寬、重復(fù)性好、試劑保存時間長、無污染危害等，TRFIA是目前公認(rèn)的最為敏感的免疫學(xué)分析方法。缺點(diǎn)是試劑純度要求較高、鑭系元素離子螯合物的合成難度較大、標(biāo)記多個靶標(biāo)物難度大進(jìn)而多元檢測受到局限等[33]。DEGAN等[34]最早研究報道，以Eu3+標(biāo)記廣譜性的AFB1多克隆抗體，建立TRFIA用于TAFs檢測，并與ELISA方法進(jìn)行了比較，對TAFs的LOD為0.004 μg/kg，檢測范圍為0.004～4 μg/kg，其靈敏度高于ELISA。WANG等[35]用Eu3+納米球標(biāo)記廣譜性的TAFs單抗，建立了用于TAFs檢測的金納米TRFIA(Eu-Nano-TRFIA)，該方法檢測TAFs包括Bl、B2、Gl和G2四種，檢測時間12 min，LOD為0.16 μg/kg，檢測范圍為0.16～30.0 μg/kg，加標(biāo)回收率為83.9%～113.9%，變異系數(shù)(CVs)為3.5%～8.8%，對397個飼料原料樣本進(jìn)行實(shí)際檢測，陽性檢出率為78.3%，陽性樣本TAFs濃度值為0.50～145.30 μg/kg，其中棉籽餅種TAFs含量最高為18.48 μg/kg。該方法與HPLC、ELISA、GICA相比，具有靈敏、準(zhǔn)確、快速等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地滿足食品FA總量污染殘留檢測的需求。

3.4 免疫傳感器法

IS檢測小分子半抗原的原理是IS由抗原或抗體與換能器組成，待測樣品中小分子半抗原與固化在傳感器表面的特異性抗體反應(yīng)形成抗原抗體結(jié)合物，結(jié)合物量的大小決定IS的電荷信號，換能器根據(jù)電荷信號的強(qiáng)弱變化，達(dá)到檢測待檢半抗原的目的。IS根據(jù)傳感技術(shù)原理可分為光學(xué)免疫傳感器、電化學(xué)免疫傳感器、熱量免疫傳感器和質(zhì)量免疫傳感器四種技術(shù)模式[36]，目前已建立了用于TAFs檢測的光學(xué)免疫傳感器[37]和電化學(xué)免疫傳感器[38]。IS用于TAFs檢測的優(yōu)點(diǎn)是攜帶方便、操作簡單、成本較低、可自動化檢測。其缺點(diǎn)是抗原抗體固化技術(shù)不夠成熟、靈敏度與精密度需要進(jìn)一步提高、難以實(shí)現(xiàn)多元檢測和難以實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)[39]。KONG等[40]用納米金研制出半定量和定量IS，實(shí)現(xiàn)了霉菌毒素的多元IS檢測，可同時檢測霉菌毒素20種，其中選擇敏感、特異的TAFs族廣譜性單抗，可同時檢測Bl、B2、Gl和G2，LOD為0.25 μg/kg，檢測范圍為0.25～4.0 μg/kg。

4 結(jié)語

比較各種食品中TAFs檢測方法，BA法專一性差，靈敏度低，主要用于定性分析，現(xiàn)已很少應(yīng)用；PCA 法具有靈敏、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但存在儀器設(shè)備昂貴、技術(shù)要求高、成本高、周期長，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測與快速檢測的行業(yè)需求；IA法具有快速、簡便、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、可現(xiàn)場檢測、篩檢樣品量大等優(yōu)勢，是實(shí)現(xiàn)TAFs檢測的主要技術(shù)手段和發(fā)展趨勢。在IA法的選擇與建立方面，隨著抗體標(biāo)記技術(shù)如酶標(biāo)記、納米金標(biāo)記、熒光標(biāo)記、量子點(diǎn)標(biāo)記等的逐步完善和新的標(biāo)記技術(shù)如鑭系元素標(biāo)記等的不斷出現(xiàn)，IA技術(shù)正向靈敏、快速、準(zhǔn)確、高效、操作簡單的方向發(fā)展，將在TAFs檢測中發(fā)揮重要作用，對于推動我國食品安全免疫檢測技術(shù)的快速發(fā)展具有積極意義。

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