偏頭痛模型大鼠三叉神經(jīng)脊束核和三叉神經(jīng)節(jié)中PACAP及CGRP表達(dá)的變化

(1 中國人民解放軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100853； 2 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

偏頭痛是一種嚴(yán)重的具有致失能性的腦功能異常疾病，其特征為單側(cè)、搏動樣中重度疼痛，常伴有惡心、嘔吐、畏光、畏聲等癥狀，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為了全球第七大失能性疾病[1]。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，全球每年偏頭痛的患病率為15%～18%，我國的患病率為9.3%[2]，該病對于病人本身及社會經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了巨大的影響。目前研究認(rèn)為，三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)的激活[3]、皮質(zhì)擴(kuò)布性抑制以及神經(jīng)源性炎癥是參與偏頭痛發(fā)病的重要機(jī)制。三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活同時引起許多神經(jīng)肽類物質(zhì)如降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的釋放[4]，最終引起腦膜血管擴(kuò)張及神經(jīng)源性炎癥。垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽(PACAP)作為一種神經(jīng)肽類物質(zhì)在偏頭痛的病理生理機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。TUKA等[5]研究顯示，偏頭痛病人血漿PACAP水平在發(fā)作期較發(fā)作間期升高，偏頭痛病人發(fā)作間期血漿PACAP水平低于健康受試者。給予偏頭痛病人 PACAP 會引起偏頭痛樣頭痛發(fā)作[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射PAC1受體拮抗劑可抑制硬腦膜三叉神經(jīng)血管傷害感受引起的血管擴(kuò)張效應(yīng)，表明PACAP的特異性受體PAC1在偏頭痛發(fā)病過程中扮演重要角色[7]。本實(shí)驗擬構(gòu)建偏頭痛大鼠模型，測定大鼠三叉神經(jīng)脊束核(TNC)和三叉神經(jīng)節(jié)(TG)內(nèi)PACAP、CGRP表達(dá)變化情況，進(jìn)一步探究PACAP及CGRP參與偏頭痛發(fā)病和慢性化過程的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物分組

選取健康成年雄性SD大鼠共32只，體質(zhì)量為160～180 g，由解放軍第302醫(yī)院動物實(shí)驗中心提供。大鼠隨機(jī)分4組，分別為炎癥湯連續(xù)刺激7 d組(IS-7d組)、14 d組(IS-14d組)、21 d組(IS-21d組)以及生理鹽水連續(xù)刺激21 d組(NS-21d組)。

1.2 炎癥湯的配制

炎癥湯為含有1 mmol/L的組胺、1 mmol/L的5-HT、1 mmol/L的緩激肽、0.1 mmol/L前列腺素E的復(fù)方炎性制劑。

1.3 偏頭痛模型大鼠的制備

以50 mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠，剃毛消毒后切開皮膚，暴露顱骨。在大鼠顱骨上用立體定位儀于前囟后1 cm，左旁開2 cm處標(biāo)記，用牙科鉆鉆透顱骨不損傷硬腦膜。安置給藥管，使之輕微接觸硬腦膜表面。在其周圍用3個螺絲加固。用502膠水等固定給藥管。消毒皮膚，縫合傷口，暴露給藥置管管帽，紅霉素外涂傷口防止術(shù)后感染。

1.4 各組的處理

手術(shù)恢復(fù)3 d后，通過微量注射器連接PE管抽取炎癥湯，以緩慢注藥的方式每日給予IS-7d組、IS-14d組、IS-21d組大鼠炎癥湯10 μL，按組別分別連續(xù)注藥7、14、21 d。以同樣方式每日給予NS-21d組大鼠生理鹽水10 μL，連續(xù)21 d。每日刺激前記錄大鼠疼痛閾值，按照分組時間取材進(jìn)行組織學(xué)染色并分析實(shí)驗結(jié)果。

1.5 觀察指標(biāo)及測定方法

1.5.1大鼠痛覺閾值的測定 每日用Von Frey纖維絲垂直接觸大鼠的鼻周、內(nèi)眥和外眥皮膚，保持3～5 s，觀察大鼠的反應(yīng)，依次更換小克數(shù)的纖維絲，直到大鼠測試陰性，臨界的陽性纖維絲的克數(shù)即為疼痛閾值。

1.5.2免疫組化染色 大鼠過量麻醉后處死，完整剝離整個腦組織及TNC、TG，4 ℃生理鹽水沖洗，吸干水分后置于充填好的O.C.T塑料管中，液氮速凍。速凍后立即置于-20 ℃冰箱，全部取材完畢后置于-80 ℃冰箱長期保存。將組織從-80 ℃冰箱取出，放入-20 ℃切片機(jī)復(fù)溫后切片，組織切片厚度20 μm，切片完成后放入-20 ℃冷丙酮中固定20 min，通風(fēng)櫥風(fēng)干后放入-20 ℃冰箱保存。切片復(fù)溫后用0.882 4 mol/L過氧化氫孵育，檸檬酸修復(fù)，內(nèi)源性生物素阻斷，血清封閉，一抗4 ℃過夜，二抗室溫孵育，DAB顯色，蒸餾水洗滌，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.6 圖像分析

在普通光學(xué)顯微鏡下，切片背景為淡黃色或無色，陽性細(xì)胞呈黃褐色圓形或橢圓形，核深染，易與背景區(qū)分。采用Image pro plus 6.0軟件計數(shù)陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)行正態(tài)性檢驗，若符合正態(tài)分布則行單因素方差分析(ANOVA)，然后進(jìn)行Levene方差齊性檢驗，多重比較選用LSD檢驗或者Dunnett T3檢驗；若不符合正態(tài)分布行秩和檢驗，用獨(dú)立樣本的Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)進(jìn)行多重比較。以P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠痛覺閾值變化

炎癥湯刺激天數(shù)對大鼠內(nèi)眥、外眥和鼻周機(jī)械痛閾的影響差異有顯著性(P<0.05)。IS-21d組與NS-21d組內(nèi)眥、外眥、鼻周機(jī)械痛閾從第7天起相比差異有顯著性(P<0.001)。見表1。

部位 組別1d7d14d21d內(nèi)眥NS?21d組22．5±4．6524．43±4．1626．00±0．0023．64±4．33IS?21d組19．94±6．791．83±2．401．89±2．591．12±1．52外眥NS?21d組26．01±0．0026．02±0．0026．11±0．0023．64±4．33IS?21d組24．63±3．642．67±4．691．89±2．591．12±1．52鼻周NS?21d組25．21±2．0826．02±0．0026．11±0．0023．64±4．33IS?21d組19．94±6．791．60±1．731．89±2．590．99±1．21

2.2 免疫組化結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色顯示，TG中IS-14d組(圖1B)PACAP的陽性細(xì)胞數(shù)目較IS-7d組(圖1A)、IS-21d組(圖1C)明顯增多；IS-21d組(圖1C)PACAP的陽性細(xì)胞數(shù)目較NS-21d組(圖1 D)明顯減少。TNC中IS-21d組(圖1G)PACAP的陽性細(xì)胞數(shù)目較IS-7d組(圖1E)、IS-14d組(圖1F)和NS-21d組(圖1H)明顯減少。TG和TNC中IS-21d組(圖2 C、G)CGRP的陽性細(xì)胞數(shù)目較IS-7d組(圖2A、E)、IS-14d組(圖2B、F)和NS-21d組(圖2D、H)明顯減少。隨著炎癥湯刺激時間的延長，TG中PACAP的陽性細(xì)胞數(shù)先增高后降低，TNC中PACAP的陽性細(xì)胞數(shù)隨刺激時間的延長逐漸降低，刺激21 d時IS-21d組TG、TNC中PACAP陽性細(xì)胞數(shù)低于NS-21d組，差異具有顯著性(P<0.05)。TG和TNC中CGRP陽性細(xì)胞數(shù)逐漸降低，刺激21 d時IS-21d組CGRP陽性細(xì)胞數(shù)低于NS-21d組，差異有顯著性(P<0.05)。見表2。

組別PACAPTNCTGCGRPTNCTGNS?21d組41．71±8．2464．00±9．2141．57±5．5327．17±5．19IS?7d組59．60±11．6852．25±8．0839．00±5．4519．50±4．54IS?14d組48．29±8．9458．80±11．8138．86±5．7018．88±5．06IS?21d組31．00±3．5941．13±8．2232．17±5．2715．13±2．59

A：IS-7d組TG中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；B：IS-14d組TG中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；C： IS-21d組TG中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；D : NS-21d組TG中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；E：IS-7d組TNC中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；F：IS-14d組TNC中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；G：IS-21d組TNC中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)；H : NS-21d組TNC中PACAP陽性細(xì)胞表達(dá)。

圖1PACAP免疫組化陽性細(xì)胞表達(dá)情況

A：IS-7d組TG中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；B：IS-14d組TG中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；C：IS-21d組TG中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；D:NS-21d組TG中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；E：IS-7d組TNC中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；F：IS-14d組TNC中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；G：IS-21d組TNC中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)；H:NS-21d組TNC中CGRP陽性細(xì)胞表達(dá)。

圖2CGRP免疫組化陽性細(xì)胞表達(dá)情況

3 討 論

近年來有研究顯示，可能是由于硬腦膜的無菌性炎癥刺激三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)，血管周圍軸突釋放血管活性肽，激活內(nèi)皮細(xì)胞，使肥大細(xì)胞脫顆粒增多和花生四烯酸代謝產(chǎn)物增加，從而激活腦膜傷害感受器而引發(fā)偏頭痛。本實(shí)驗應(yīng)用炎癥湯連續(xù)21 d刺激大鼠上矢狀竇旁硬腦膜，構(gòu)建偏頭痛大鼠模型，并在此模型基礎(chǔ)上研究血管周圍神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽類物質(zhì)對偏頭痛影響的機(jī)制。有實(shí)驗應(yīng)用此方法觀察大鼠疼痛閾值變化，單次給予炎癥湯5 min后即可引發(fā)腦部機(jī)械性痛覺過敏，腦部痛覺閾值下降[8]。OSHINSKY等[9]研究顯示，每周3次連續(xù)4周給予大鼠硬腦膜注射炎癥湯，隨著給藥次數(shù)的增多，大鼠的疼痛閾值逐漸降低。僅僅給予3次炎癥湯刺激的大鼠痛覺閾值會恢復(fù)到和生理鹽水組同一水平，連續(xù)4周給予炎癥湯組的大鼠痛覺閾值不會恢復(fù)并且會出現(xiàn)三叉神經(jīng)節(jié)高敏化的現(xiàn)象。

硬腦膜的傷害性感受器是由三叉神經(jīng)眼支支配的，大部分偏頭痛病人疼痛集中在腦的上部[10]，并且有大量報道稱偏頭痛痛覺過敏的部位在三叉神經(jīng)眼支支配區(qū)域。本實(shí)驗結(jié)果顯示，隨著反復(fù)的炎癥湯化學(xué)刺激，造成了大鼠內(nèi)眥、外眥和鼻周的痛覺敏化，我們認(rèn)為21 d反復(fù)炎癥湯刺激大鼠上矢狀竇這一模型較好地模擬了偏頭痛病人廣泛而持續(xù)的中樞敏化現(xiàn)象，這種現(xiàn)象隨后有加劇偏頭痛進(jìn)展的風(fēng)險，而痛覺異常過敏在此環(huán)節(jié)中具有提示性的意義。

PACAP是血管活性腸肽(VIP)、促胰液素、胰高血糖素肽家族中的一員[11]。與CGRP釋放類似，PACAP廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織，它具有強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用。本實(shí)驗結(jié)果顯示，慢性反復(fù)刺激后TG神經(jīng)元胞漿內(nèi)的PACAP陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸增多達(dá)到高峰，而后隨著刺激時間的延長PACAP陽性細(xì)胞數(shù)出現(xiàn)了下降的趨勢，提示在偏頭痛慢性化的過程中存在著遞質(zhì)先釋放增多后逐漸耗竭的現(xiàn)象。這與臨床試驗中慢性偏頭痛病人外周血PACAP水平偏低結(jié)果一致[12]。

CGRP是一種由降鈣素基因選擇性表達(dá)的含有37個氨基酸的神經(jīng)肽類物質(zhì)，具有強(qiáng)效的血管舒張作用[13]。有研究表明，偏頭痛病人頭痛發(fā)作期頸靜脈、唾液中的CGRP含量增多[14-15]，曲普坦藥物治療后CGRP的含量相應(yīng)減少[16]。外源性靜脈注射CGRP可導(dǎo)致遲發(fā)性偏頭痛樣頭痛發(fā)作[17]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，炎癥湯刺激7 d后CGRP表達(dá)出現(xiàn)峰值，我們考慮在慢性偏頭痛模型中由于PACAP的釋放增加引起神經(jīng)元的激活和中樞的敏化，進(jìn)而促進(jìn)CGRP的釋放增多，加重頭痛的程度。這也提示PACAP與CGRP在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中存在相互作用和影響，二者很有可能在分子水平上共享一個RAMP1亞基[18]，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

5-HT1B/1D受體激動劑(曲普坦類藥物)和最近研發(fā)的CGRP受體拮抗劑[19]可以有效緩解偏頭痛急性發(fā)作癥狀，但不產(chǎn)生持久的抑制三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活的作用。因此，偏頭痛的藥物治療仍然是一個亟待解決的問題。PACAP是三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)激活的重要神經(jīng)肽類物質(zhì)，特別是針對PACAP特異性受體的研究可能為未來新的偏頭痛藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

綜上，本實(shí)驗的研究表明，炎癥湯反復(fù)化學(xué)刺激大鼠可導(dǎo)致偏頭痛慢性化和痛覺敏化的現(xiàn)象，在偏頭痛慢性化的過程中，PACAP先大量釋放然后慢性耗竭，并且炎癥湯刺激7 d時TNC內(nèi)PACAP與CGRP表達(dá)最多，說明PACAP與CGRP在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中存在相互影響，對于二者的共存釋放關(guān)系以及受體拮抗劑的研究可以為未來偏頭痛治療藥物的開發(fā)提供依據(jù)。

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