劉林麗 張良晨 朱思遠(yuǎn) 齊碧如 黃勉

[摘要] 目的 探討膽鹽輸出泵（BSEP）在ART助孕和正常受孕妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）患者胎盤(pán)組織中的表達(dá)及意義。 方法 采用Western blot和RT-PCR方法檢測(cè)我院收治的15例自然受孕ICP患者（ICP組）、15例ART助孕ICP患者（ART組）及9例正常妊娠患者（對(duì)照組）胎盤(pán)組織中 BSEP蛋白和mRNA 的表達(dá)情況，分析三組ICP胎盤(pán)中BSEP表達(dá)的差異。 結(jié)果 Western blot和RT-PCR法顯示BSEP蛋白和mRNA在自然受孕ICP胎盤(pán)中表達(dá)分別為（0.443±0.102）和（8.139±4.490），在ART來(lái)源胎盤(pán)中表達(dá)分別為（0.490±0.117）和（9.992±5.253），而正常妊娠胎盤(pán)組織中表達(dá)明顯減少（0.161±0.013）和（1.038±0.271），ICP組和ART組差異無(wú)明顯差異（P>0.05），而這兩組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。 結(jié)論 BSEP 蛋白在正常妊娠胎盤(pán)組織中微量表達(dá)，而在 ICP 患者胎盤(pán)組織中高表達(dá)，可能與 ICP的發(fā)病有關(guān)，但自然受孕ICP胎盤(pán)和ART助孕ICP胎盤(pán)中BSEP 蛋白無(wú)差異，提示ART助孕并不增加子代妊娠期ICP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

[關(guān)鍵詞] 輔助生殖技術(shù)；蛋白質(zhì)印跡法 ；妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥；反轉(zhuǎn)錄·聚合酶鏈反應(yīng)；膽鹽輸出泵

[中圖分類(lèi)號(hào)] R715.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2018）03-0008-04

Significance and expression of BSEP in placenta of ICP patients treated with assisted reproductive technology

LIU Linli ZHANG Liangchen ZHU Siyuan QI Biru HUANG Mian

Department of Obstetrics and Gynecology， Fuzhou First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350004， China

[Abstract] Objective To explore the significance and the expression of bile salt export pump（BSEP） in placenta of patients with intrahepatic cholestasis of pregnancy（ICP） of natural conception or pregnancy through ART treatment. Methods The expression of BSEP proteion and mRNA in placenta of 15 ICP patients of natural conception（ICP group）， 15 ICP patients treated with ART（ART group） and 9 normal cases of natural conception（control group） attended our hospital was detected by Western blot and RT-PCR. The difference of BSEP expression in three groups of ICP placenta was analyzed. Results The Western blot and RT-PCR showed that the expression of BSEP protein and mRNA in ICP placenta of natural conception was （0.443±0.102） and （8.139±4.490）， respectively. The expression in the placenta of ART group was （0.490±0.117） and （9.992±5.253）， respectively. The expression in the placenta of control group was significant less， which was （0.161±0.013） and （1.038±0.271）， respectively. There was no significant difference between ICP group and ART group（P>0.05）， but both of them showed statistically significant difference compared to control group（P<0.001）. Conclusion Trace expression of BSEP protein was found in placenta tissue of normal pregnancy， while high expression in placenta tissue of ICP patients implicated that BSEP protein may related to the occurence of ICP. There was no difference in expression of BSEP protein in ICP placenta between natural conception and pregnancy with ART treatment， which suggested that ART will not increase the risk of ICP in offspring.

[Key words] Assisted reproductive technology； Western blot； Intrahepatic cholestasis of pregnancy； RT-PCR； Bile salt export pump

輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）廣泛應(yīng)用于臨床，其大量超生理的操作是否會(huì)增加子代不良健康風(fēng)險(xiǎn)目前仍無(wú)定論。和自然妊娠相比，ART可能造成妊娠期合并癥、出生缺陷、低出生體質(zhì)量?jī)?、早產(chǎn)、神經(jīng)發(fā)育異常甚至癌癥等不良妊娠結(jié)局[1-2]。胎盤(pán)是連接母胎的重要器官，對(duì)ART來(lái)源胎盤(pán)的研究，有利于我們更好地評(píng)估ART安全性。數(shù)據(jù)顯示，妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（Intrahepatic cholestasis of pregnancy，ICP）是對(duì)母兒危害極大，世界各地發(fā)病率差異較大，中國(guó)女性似乎更高發(fā)，提醒我們必須要重視ICP與ART的研究。BSEP基因是肝細(xì)胞毛細(xì)膽管側(cè)的膽汁酸載體，有數(shù)據(jù)表明膽鹽輸出泵（bile salt export pump，BSEP）是ICP的易感基因，可能參與ICP的發(fā)病[3-4]。目前關(guān)于ART和ICP的研究甚少[5]，本研究以ART胎盤(pán)為切入點(diǎn)，探索ART助孕后ICP患者胎盤(pán)BSEP的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年3月～2017年7月在本院分娩的自然單胎妊娠ICP患者15例（ICP組），年齡（29.12±3.13）歲，產(chǎn)次（1.82±0.71）次，孕周（37.77±5.13）周；同年溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院分娩的IVF/ICSI助孕妊娠單胎ICP患者15例（ART組），年齡（30.52±2.91）歲，產(chǎn)次（1.78±0.32）次，孕周（37.13±6.39）周。另選正常單胎妊娠孕婦9例（對(duì)照組），年齡（30.77±4.35）歲，產(chǎn)次（1.90±0.22）次，孕周（37.19±7.95）周，ICP及ART組患者均無(wú)其他引起肝功能異常的疾病，無(wú)妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、心臟病等妊娠期并發(fā)癥，對(duì)照組肝功能正常。ICP診斷依據(jù)2015年中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)制定的ICP癥診療指南[7]。各組一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 胎盤(pán)收集

在胎兒娩出后5 min內(nèi)留取新鮮母體面中央組織胎盤(pán)2 cm×2 cm×1 cm數(shù)塊，取樣避開(kāi)臍帶組織、胎膜蛻膜及壞死鈣化區(qū)。組織獲取后，立即并快速液氮凍存，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

取100 mg標(biāo)本，加入1000 μL RIPA裂解液，提取總蛋白后用碧云天的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，40 μg樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamidegel electropheresis，SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜（美國(guó)Abcam公司），轉(zhuǎn)移膜室溫封閉2 h，一抗4℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST 洗滌3次，加入二抗（按照抗體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行稀釋?zhuān)┲芯徛龘u動(dòng)120 min，TBST洗膜1次，ECL化學(xué)發(fā)光成像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Image J軟件分析灰度值，待測(cè)蛋白的表達(dá)水平可用其條帶的總灰度值與其內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的總灰度值的相對(duì)值大小來(lái)表示。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

總RN A提?。簭?80°冰箱中提取100 mg組織加入1 mL TRIzol（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），靜置10 min，按試劑盒步驟提取總RNA。RNA純度及濃度的檢測(cè)：在全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Mini Trans-Blot Cell）上測(cè)定260 nm、280 nm處的吸光度值并得到比值，若其范圍在1.8～2.0之間說(shuō)明純度尚可。RNA逆轉(zhuǎn)錄：按試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）步驟制備20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：基因BSEP引物序列：上 游5CCTGGTCATCT-TGTGCTTCTTC3，下游5TCAATGAACCGCCTCTCCTT 3。β-actin為內(nèi)參照，引物序列：上游5GCTATCCCTGTACGCCTCTG3，下游5TTAATGTCACGCACGATTTCCC3（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。PCR擴(kuò)增體系50 μL；擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94℃ 15 s PCR反應(yīng)，62℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后利用系統(tǒng)自帶的軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR法檢測(cè)BSEP mRNA在三組胎盤(pán)組織中的表達(dá)

BSEP在自然受孕ICP和ART胎盤(pán)中表達(dá)分別為（8.139±4.490）和（9.992±5.253），在正常妊娠胎盤(pán)組織中表達(dá)明顯減少（1.038±0.271），ART組較ICP組表達(dá)量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而這兩組與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)封三圖3。

2.2 Western blot檢測(cè)BSEP蛋白在三組胎盤(pán)組織中的表達(dá)

BSEP在自然受孕ICP和ART胎盤(pán)中表達(dá)分別為（0.443±0.102）和（0.490±0.117），在正常妊娠胎盤(pán)組織中表達(dá)明顯減少（0.161±0.013），ART組較ICP組表達(dá)量增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而這兩組與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。見(jiàn)封三圖4。

3 討論

隨著國(guó)家二胎政策放開(kāi)、生育大波的來(lái)臨，帶給產(chǎn)科醫(yī)師和生殖醫(yī)師巨大的挑戰(zhàn)，產(chǎn)科面臨疑難危急重癥越來(lái)越多，生殖醫(yī)學(xué)面臨ART子代及妊娠風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)憂。其中ICP是妊娠期危急重癥里發(fā)生圍產(chǎn)兒死胎、死產(chǎn)比例很高且病因不明的并發(fā)癥，孕期的嚴(yán)密監(jiān)護(hù)和個(gè)體化的治療是ICP監(jiān)管的有力措施。BSEP是膽汁酸的特異轉(zhuǎn)運(yùn)體，可調(diào)節(jié)膽汁酸的代謝，胎盤(pán)承載著大量妊娠相關(guān)訊息，是連接母兒的重要橋梁，ICP時(shí)母體膽汁酸升高經(jīng)胎盤(pán)的膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)送經(jīng)過(guò)臍血，導(dǎo)致胎兒血清膽汁酸明顯升高，其毒性對(duì)胎兒有致命的危害。因此，ICP胎盤(pán)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能的建立可能是造成ICP胎兒預(yù)后不良的環(huán)節(jié)之一。大量數(shù)據(jù)已表明BSEP可能參與ICP的發(fā)生發(fā)展[3-4]，本研究從與母兒均相關(guān)的胎盤(pán)出發(fā)，研究BSEP是否在ICP胎盤(pán)中表達(dá)，探索ICP可能的發(fā)病機(jī)制。我們應(yīng)用Westren blot、RT-PCR等方法對(duì)正常妊娠、自然妊娠ICP胎盤(pán)及ART助孕ICP胎盤(pán)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估ART子代胎盤(pán)是否存在發(fā)育機(jī)制異常。

結(jié)果顯示，Westren blot和RT-PCR法均提示正常胎盤(pán)中BSEP mRNA和蛋白表達(dá)水平基因微量表達(dá)甚至不表達(dá)，而在ICP胎盤(pán)中高表達(dá)，其中ART來(lái)源胎盤(pán)較自然妊娠ICP胎盤(pán)表達(dá)量高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Maeias等[6]研究發(fā)現(xiàn)母胎體內(nèi)膽汁酸的合成、代謝及膽汁酸的胎盤(pán)運(yùn)輸是妊娠期膽汁酸循環(huán)的關(guān)鍵，Mazzella[7]研究報(bào)道ICP患者臍血中膽汁酸成分的變化與母血中變化一致，但濃度低于母血，提示胎兒體內(nèi)這些升高的膽汁酸的母源性，更是在一系列研究中證實(shí)ICP存在經(jīng)胎盤(pán)由母體向胎兒的膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)。目前的研究提出哺乳動(dòng)物肝臟膽汁分泌及運(yùn)輸主要由于BSEP介導(dǎo)的，考慮ICP胎盤(pán)中膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程可能有BSEP的參與，但我國(guó)學(xué)者刑愛(ài)耕等研究顯示正常孕晚期胎盤(pán)中沒(méi)有BSEP mRNA的表達(dá)，本研究結(jié)果顯示正常胎盤(pán)中BSEP mRNA微量表達(dá)，而ICP胎盤(pán)中高表達(dá)，分析原因可能是由于BSEP基因突變或缺失所致BSEP mRNA上調(diào)，但國(guó)外學(xué)者[8-9]的研究認(rèn)為BSEP基因突變對(duì)于ICP意義不大，故目前結(jié)論仍有爭(zhēng)議。

ART的超生理劑量E2、黃體酮的使用，可能造成合體滋養(yǎng)層細(xì)胞血管重塑受限，胎盤(pán)缺血、缺氧，出現(xiàn)功能及結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局發(fā)生[11-15]。研究顯示，ICP高發(fā)病率和ART妊娠有關(guān)，本研究通過(guò)三種不同的方法驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)ART助孕ICP組的胎盤(pán)中BSEP蛋白表達(dá)較自然妊娠ICP組偏高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，似乎提示我們ART助孕并不增加子代妊娠期ICP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，筆者分析ART的超促排卵、體外培養(yǎng)及胚胎移植等過(guò)程，阿司匹林、肝素的抗凝物的應(yīng)用，改善了早期胎盤(pán)形成的需氧環(huán)境，并且ART中宮腔內(nèi)操作和胚胎移植的準(zhǔn)確定位可能對(duì)胎盤(pán)的發(fā)育和正常功能產(chǎn)生有利影響，然后從母源角度，在移植前治療一切不利疾病背景，如：子宮內(nèi)膜異位癥患者GnRHa的應(yīng)用或者腹腔鏡下大量生理鹽水的腹腔沖洗改善體內(nèi)微環(huán)境，易栓癥患者移植前進(jìn)行免疫及抗凝治療，高同型半胱氨酸之前的抗氧化治療，宮腔鏡處理宮腔內(nèi)膜、息肉、粘連，輸卵管積水的切除等均為胎盤(pán)的功能正常發(fā)揮提供了條件，兩組結(jié)果雖有輕微差異，可能是本研究樣本量少，而國(guó)內(nèi)外鮮有相關(guān)報(bào)道，今后本課題組將會(huì)擴(kuò)大樣本量繼續(xù)探索。

綜上所述，BSEP蛋白在正常妊娠胎盤(pán)組織的低表達(dá)，而在ICP胎盤(pán)組織中高表達(dá)，可能是ICP發(fā)病原因之一，但自然受孕ICP胎盤(pán)和ART來(lái)源ICP胎盤(pán)中BSEP蛋白表達(dá)無(wú)差異，提示ART助孕并不增加子代ICP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。鑒于上述結(jié)論，筆者所在課題組下一步將探索三組胎兒臍血膽汁酸與母血膽汁酸之間的聯(lián)系，觀察ART子代膽汁酸代謝途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cedars MI. In vitro fertitilitation and risk of autistic disorder and mental retardation[J]. AMA，2013，310（1）：42-43.

[2] Hyrapetian，Loucaides EM，Sutcliffe AG.Heahh and disease in children bom after assistive reproductive therapies[J]. Reprod Immunol，2014，10（6）：21-26.

[3] Stauiniekls，BullL N，Knisely AS，et al.Ageneeneodinga liver-sPeeific ABCtrans porter 15 mutatedin progressive familial intrahe patieeho lestasis[J].Nature Genetics，1998， 20（3）：233-238.

[4] Eloranta ML，Hakli T，Hiltunen M，et al.Assoeiation of singlenueleotide Polymorphisms of the bilesaltex Port Pum Pgene within trahePatie eholestasis of Pregnaney[J].Seandinavian Joumal of Gastroenterology，2003，38（6）：648-652.

[5] Davidson KM. Intrahepatic cholestasis of pregnancy[J]. Semin Perinatol，1998，22（3）：104-111.

[6] Maeias RIR，Paseual MJ，Bravo A，et al.Effeet of maternal cholestasison bile aeid transfer aeross the rat Plaeenta matemal liver tandem[J]. He Patology，2000，31（4）：975-983.

[7] Mazzella G，Nicola R，F(xiàn)rancesco A，et al.Ursodexyeholic aeid administration in patients with eholestasis of pregnaney：Effeetson primary bile aeids in babies and mothers[J].He Patology，2001，33（7）：504-508.

[8] Painier JN，Savander M，istonen P，et al.A known polymorphism in the bile salt export pumpgene is not a risk allele for intrallepatic cholestasis of pregnancy[J].Seandinavian Journal of Gastroenterology，2004，39（7）：694-695.

[9] Pauli-Magnus C，Lang T，Meier Y，et al.Sequenee analysis of bilesal exPort PumP（ABCB11） and multidrug resistance P-glyeoProtein3（ABCB4，MDR3） in patienis with intrahepatie cholestasis of pregnaney[J].Pharmacogeneties，2004，4（2）：91-102.

[10] Imudia AN，Awonuga AO，Doyle J，et al.Peak serum estradiol level during controlled ovarian hyperstimulation is associated with incre ased risk ofsmall for gestational age and preeclampsia in singletonpregnancies after in vitro fertilization[J].Fertil Steril，2012，97（6）：1374-1379.

[11] Bonagura TW，Pepe GJ.Suppression of extraviUous trophoblast vascular endothelial growth factor expression and uterine spiral artery invasion by estrogen during early baboon pregnancy[J]. Endocrinology，2008，149（10）：5078-5087.

[12] Lyall F，Robson SC，Bulmer JN. Spiral artery remodeling and trophoblast invasion in preeclampsia and fetal growth restriction：Relationship to clinical outcome[J]. Hypertension，2013，62（6）：1046-1054.

[13] Liévano S，Alarcón L，Chávez-Munguía B，et al. Endothelia of term human placentae display diminished expression of tight junction proteins during preeclampsia[J].Cell Tissue Res，2006，324（3）：433-448.

[14] Jansson T，Ylvén K，Wennergren M，et al.Glucose transport and system A activity in syncytiotrophoblast microvillous and basal plasma membranes in intrauterine growth restriction[J].Placenta，2002，23（5）：392-399.

[15] Martin F，Malergue F，Pitari G，et al.Vanin genes are clustered（human 6q22-24 and mouse 10A2B1） and encode isoforms of pantetheinase ectoenzymes[J]. Immunogenetics，2001，53（4）：296-306.

（收稿日期：2017-10-28）