吳丹 孟娜娜 韓楊 李玲玉 唐春銀

[摘要]目的 研究松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，為揭示松針油的抗胃癌作用機制提供理論和實驗基礎(chǔ)。方法 采用水蒸氣蒸餾法提取松針油。向?qū)?shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞中加入等體積不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h后進行細胞形態(tài)學(xué)觀察；采用MTT法檢測松針油對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，將對數(shù)期細胞分為陰性對照組、不同濃度給藥組，加入不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h后每孔加MTT 20 μL，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長測光密度值（OD值）。 結(jié)果 松針油給藥濃度越高，存活細胞越少，細胞發(fā)生體積變小、變圓、核固縮等形態(tài)學(xué)變化；MTT實驗結(jié)果表明：與對照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與對照組的細胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL。 結(jié)論 松針油對胃癌SGC-7901細胞增殖有抑制作用，且隨松針油濃度升高抑制作用明顯增強。

[關(guān)鍵詞] 松針油；胃癌；細胞增殖；MTT法

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）03-0001-04

Influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901

WU Dan MENG Na'na HAN Yang LI Lingyu TANG Chunyin

Mudanjiang Medical University， Mudanjiang 157011， China

[Abstract] Objective To investigate the influence of essential oil extracted from pine needles on cell proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901， and to provide a theoretical and experimental basis for revealing the mechanism of anticancer effects of essential oil extracted from pine needles against gastric cancer. Methods Essential oil from pine needles was collected by steam distillation. Equal volume of oil with different concentrations was added into human gastric cancer cell line SGC-7901 during its logarithmic phase， cell morphology was observed after 24 h of cell culture； cell proliferation was detected by MTT assay， cells in logarithmic phase were divided into negative control group and different concentrations groups， oil with different concentrations was added， after 24 hours of cell culture， 20 μL MTT was added into each hole， then after 4 hours of incubation in 37℃， 200 μL of 0.04 mol/L DMSO was added into each hole， optical density（OD） at 490 nm was measured by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The higher the concentration of essential oil extracted from pine needles， the fewer the survival cells， morphological changes including the reduction of volume， turning round， karyopyknosis could be observed in the cells. The result of MTT indicated that the OD of 1：200， 1：300 and 1：400 groups decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the OD of 1：500 group also decreased with statistically significant difference（P<0.01）. The survival rate of cells in 1：200， 1：300， 1：400 and 1：500 decreased significantly compared with the control group（P<0.001）， the inhibitory concentration 50（IC50） was 1.9 mg/mL. Conclusion The essential oil extracted from pine needles can inhibit the proliferation of human gastric cancer cell line SGC-7901 in a concentration-dependent manner.

[Key words] Oil of pine needles； Gastric cancer； Cell proliferation； MTT assay

胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤。全球每年大約有90多萬新發(fā)的胃癌患者，其中70萬以上死于胃癌及其相關(guān)疾病，是嚴重威脅人類生命的惡性腫瘤，胃癌致死率僅次于肺癌，居全球癌癥死亡原因的第二位[1-3]。我國屬胃癌高發(fā)區(qū)，中國每年新發(fā)胃癌患者超過40萬例，每年因胃癌及其相關(guān)疾病死亡的人數(shù)超過20萬人，已成為我國位居首位的惡性腫瘤。近年來新發(fā)胃癌患者逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢[4，5]。因此，胃癌已成為嚴重危害人類健康的重大疾病。目前手術(shù)、化療仍是治療胃癌的主要方法[6-8]，但中西醫(yī)結(jié)合治療胃癌將是一個必然的發(fā)展方向。中醫(yī)藥在治療胃癌的臨床工作中發(fā)揮著日益重要的作用，尤其在改善癌前病變[9-11]、減輕放化療毒副作用[12-15]、防止癌癥的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面已經(jīng)顯示出其廣闊的應(yīng)用前景[16，17]。

中藥松針（pine needle）為松科（pinaceae）松屬（pinus）植物的葉[18]，松針中含有豐富的化學(xué)成分，包括氨基酸、黃酮類、木質(zhì)素、粗蛋白、葉綠素、維生素、粗纖維、可溶性多糖、礦質(zhì)元素等[19，20]。多項研究表明，松針提取物具有抗氧化[21，22]、抗菌[23]、降血脂[24]、降血糖[25]及抑制腫瘤[26]等藥理作用，有很高的藥用價值和良好的應(yīng)用前景。因此松針的深度研發(fā)具有重大意義。

研究表明：松針油可以誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2參與了松針油誘導(dǎo)的肝癌HepG 2細胞凋亡過程中端粒酶活性的調(diào)控[26]。而松針抑制胃癌細胞增殖的研究未見報道。本實驗旨在研究松針油對人胃癌SGC7901細胞增殖的影響，為研究松針油抗胃癌的作用機制提供理論和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥物、細胞系

中藥松針購自牡丹江市大藥房，人胃癌SGC-7901細胞株由本實驗室提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 松針油提取 采用水蒸氣蒸餾法，松針在實驗室陰干后切成小于2 cm的小段，取松針100 g加到1000 mL的圓底燒瓶中，加入750 mL蒸餾水，置于水蒸氣蒸餾裝置中進行提取，蒸餾4 h，取上層精油，用無水乙醚溶解，無水硫酸鈉脫水，得到淡黃色油狀液體。

1.2.2 細胞形態(tài)學(xué)觀察 用1640培養(yǎng)基稀釋已配好的松針油母液，依據(jù)松針油濃度分為1∶200組（4.40 mg/mL）、1∶300組（2.93 mg/mL）、1∶400組（2.20 mg/mL）、1∶500組（1.76 mg/mL）、1∶600組（1.47 mg/mL）；收集對數(shù)期的人胃癌SGC-7901細胞配成1×105個/mL細胞懸液，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)24 h，吸出培養(yǎng)液，加入等體積的不同濃度的松針油，培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.2.3 MTT法檢測松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響 MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，已廣泛用于大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗等。MTT法檢測：將對數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細胞用 0.25% 胰酶消化，離心去上清，用培養(yǎng)基重懸，細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為106/mL。種96孔板，按每孔104個細胞種板，37℃ 5%CO2 培養(yǎng)24 h。將細胞分為對照組、不同濃度松針油給藥組[1∶200組（4.40 mg/mL）、1∶300組（2.93 mg/mL）、1∶400組（2.20 mg/mL）、1∶500組（1.76 mg/mL）、1∶600組（1.47 mg/mL）]；每孔設(shè)3個復(fù)孔，加入不同濃度的松針油，37℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/mL的MTT 20 μL，并增設(shè)陰性對照，37℃孵育4 h，每孔加入0.04 mol/L DMSO 200 μL，用吸管反復(fù)吹打使接近結(jié)晶顆粒溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長測光密度值（OD值）。

1.3觀察指標

在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，包括細胞存活與死亡情況、存活細胞間空隙大小的改變、胞漿中變化、細胞形態(tài)與體積的改變。通過MTT法檢測松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響。細胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計學(xué)軟件，計量資料以（x±s）表示，多組間比較使用One Way Anova進行統(tǒng)計學(xué)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松針油的提取

提取得到淡黃色油狀液體，用1640培養(yǎng)基配制稀釋濃度為1∶100的松針油母液100 mL，質(zhì)量濃度為8.8 mg/mL，冷藏備用。

2.2 松針油對人胃癌SGC-7901細胞形態(tài)的影響

經(jīng)倒置顯微鏡觀察松針油作用24 h后，1∶200給藥組細胞基本死亡；其他濃度給藥組也有部分細胞死亡。給藥濃度越高，存活細胞越少。存活細胞間空隙變大，胞漿中出現(xiàn)顆粒樣和空泡樣變化，細胞變形伸展，體積變小、變圓，有的呈懸浮狀態(tài)，見封三圖1。

2.3 松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖的影響

2.3.1 松針油對不同組別細胞OD值的影響 與對照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見表1。

2.3.2 松針油對不同組別細胞存活率的影響 與對照組的細胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），見表2。

2.3.3 松針油對胃癌細胞SGC-7901的半數(shù)抑制濃度（IC50） 松針油對胃癌細胞SGC-7901的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL，見封三圖2。松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖有較強的抑制作用，隨著給藥濃度的升高，對胃癌細胞抑制作用增強。

3 討論

目前癌癥死亡率僅次于心血管疾病，而且呈逐年上升的趨勢，胃癌占全球癌癥死亡原因的第二位，具有發(fā)病率高、轉(zhuǎn)移率高、死亡率高的三高特點。胃癌的早期診斷率很低，很多患者在就診時已處于胃癌中后期，即使進行手術(shù)切除患處，仍有一半以上的患者會發(fā)生局部復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因此，胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是治療的主要難點。當(dāng)前胃癌的常用治療手段包括手術(shù)治療、化學(xué)藥物治療、放射治療及新近發(fā)展起來的分子靶向藥物治療等。然而，外科手術(shù)、放療、化療等胃癌治療手段在治療的同時帶來了如肝腎損傷、骨髓抑制等一系列醫(yī)源性疾病，胃癌的臨床治療面臨著巨大挑戰(zhàn)。因此，積極探索與開發(fā)胃癌治療新途徑，對胃癌的治療及改善胃癌患者的生存質(zhì)量、延長胃癌患者的生存期具有重要的臨床意義。

目前的化學(xué)合成藥物雖然抗腫瘤作用確切，療效顯著，但有不良反應(yīng)大、長期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥性等缺點。近年來，中醫(yī)藥在腫瘤治療領(lǐng)域的巨大應(yīng)用潛力引起人們廣泛的關(guān)注。中醫(yī)認為胃癌是由于肝胃不和，氣郁血逆，脾運失常，濕痰凝聚，瘀熱內(nèi)蓄成毒，結(jié)于胃腑而成癌腫。研究表明：中藥扶正祛邪，健脾和胃，補氣養(yǎng)血，能夠有效保護各器官組織的正常功能，增強機體的免疫力，能明顯減輕放療、化療的副反應(yīng)，并且能顯著增強腫瘤對放、化療的敏感性；同時，中藥的扶正抗癌作用能夠有效抑制癌細胞的增殖、浸潤、分化、轉(zhuǎn)移，緩解癥狀，減輕痛苦，延長患者的生存期，提高患者的生存質(zhì)量。中醫(yī)藥具有獨特的理論體系和用藥方式，與傳統(tǒng)的手術(shù)、放療及化療相比，具有多成分、多環(huán)節(jié)、多靶點、毒副作用小等特點，在腫瘤治療方面具有西藥所不具備的優(yōu)勢，具有廣闊的發(fā)展前景。

已有研究表明：松針油可以誘導(dǎo)肝癌細胞的凋亡，并抑制端粒酶活性，bcl-2參與了松針油誘導(dǎo)的肝癌HepG 2細胞凋亡過程中端粒酶活性的調(diào)控。本實驗研究松針油對人胃癌SGC7901細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：松針油給藥后胃癌細胞產(chǎn)生胞間間隙變大、體積變小、變圓、核固縮等形態(tài)學(xué)變化；另外，MTT實驗結(jié)果表明：與對照組的OD值相比較，1∶200、1∶300和1∶400給藥組的OD值明顯下降（P<0.001），1∶500給藥組的OD值也有下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與對照組的細胞存活率相比較，1∶200、1∶300、1∶400和1∶500給藥組細胞存活率明顯下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.9 mg/mL。松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖有抑制作用，且隨松針油濃度升高，抑制作用明顯增強。

綜上所述，松針油對人胃癌SGC-7901細胞增殖有顯著抑制作用，這為進一步研究松針油抑制胃癌細胞增殖的作用機制奠定了實驗基礎(chǔ)，也為研究中藥及其提取物抗胃癌的應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù)。采用松針油抑制胃癌細胞增殖可能是胃癌治療的一種新策略，為中藥抗腫瘤研究開辟了新的途徑。

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（收稿日期：2017-11-21）