袁超

乳腺癌是女性最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前據(jù)全球女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，我國(guó)每年因乳腺癌死亡的病患超過(guò)7萬(wàn)例。近年來(lái)，乳腺癌不僅發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，而且發(fā)病人群越來(lái)越年輕化［1］。由于乳腺癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，所以早期診斷和治療是影響乳腺癌患者生存的關(guān)鍵，但目前常用的乳腺癌血清標(biāo)志物如CA153、CA125和CEA診斷的敏感度和特異度均較低［2-3］。

microRNA是一類(lèi)在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的、由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)對(duì)其靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控參與真核細(xì)胞的分化、增殖、生長(zhǎng)和凋亡的調(diào)節(jié)。目前隨著對(duì)miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅可以作為多種疾病治療的靶點(diǎn)［4-5］，而且在癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)［9-10］，由于受到內(nèi)源性RNA酶的保護(hù)作用，來(lái)源于腫瘤組織的miRNA可以穩(wěn)定地存在于血液中，這種miRNA對(duì)腫瘤具體較高的特異性，且與癌癥的臨床分期、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)以及無(wú)瘤生存期等有關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)比乳腺癌患者、乳腺良性病變患者和健康人群血清miR-6861-5p的表達(dá)，分析血清miR-6861-5p與乳腺癌患者臨床病理特征、診斷以及預(yù)后的關(guān)系，探討血清miR-6861-5p檢測(cè)對(duì)乳腺癌患者的臨床診斷價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2013年1月至2015年6月山東省德州市第二人民醫(yī)院112例乳腺癌患者外周血（乳腺癌組），并經(jīng)病理證實(shí)，同時(shí)隨機(jī)選取同時(shí)期乳腺良性病變女性患者外周血37例（良性病變組）（乳腺增生18例、乳腺囊腫12例以及乳腺纖維瘤7例），健康體檢女性外周血53例（健康組）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：1）所有研究對(duì)象年齡、性別以及體重等一般資料完整；2）健康組和良性病變組患者未合并其他惡性腫瘤；3）乳腺癌患者收集外周血前未經(jīng)任何放化療或者手術(shù)根除治療；4）年齡＞18周歲，且對(duì)本次研究知情并簽訂知情確認(rèn)書(shū)，并經(jīng)山東省德州市第二人民醫(yī)院倫理協(xié)會(huì)審查通過(guò)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）乳腺癌術(shù)后病理分期、分子分型不明確；2）合并胰腺癌、結(jié)腸癌等消化系統(tǒng)或其他惡性腫瘤的乳腺癌患者；3）健康研究對(duì)象納入前一年內(nèi)有手術(shù)治療病史或有既往腫瘤病史，采血前3個(gè)月內(nèi)有藥物服用史或住院治療病史；4）乳腺癌和乳腺良性病變患者在采集外周血前1周內(nèi)有藥物服用史。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-6861-5p的提取與檢測(cè) 采集研究對(duì)象外周血5～10 mL，EDTA抗凝，離心（1000×g）10 min（5810R，德國(guó)Eppendorf AG公司）收集血清。向200 μL血清中加入1 000 μL QIAzol溶解試劑（QI?GEN公司，德國(guó)），室溫靜置15 min，根據(jù)miRNeasy血清/血漿總RNA提取試劑盒（QIGEN公司，德國(guó)）說(shuō)明書(shū)提取血清總RNA，DEPC水溶解總RNA。通過(guò)One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，日本）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR參數(shù)設(shè)置：37℃60 min，85℃ 5s。

RT-qPCR：根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa公司，日本）說(shuō)明書(shū)制備20 μL RT-qPCR反應(yīng)體系，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國(guó)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR引物：mi-6861-5p上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGACTGGGTAGGTGGG C-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR參數(shù)設(shè)置：95℃，30 s，40個(gè)循環(huán)（90℃，5 s，65℃，30 s）。選擇U6作為內(nèi)參照，并用2-Δt法（Δt=CTmiRNA-CTU6）計(jì)算miR-6861-5p的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.2 乳腺癌患者血清學(xué)指標(biāo)的檢測(cè) 收集血清，通過(guò)自動(dòng)生化分析儀（AU680，Beckman Coulter公司，美國(guó)）檢測(cè)血清總膽固醇（total cholesterol，TC），甘油三酯（triglycerdes，TG），高密度膽固醇（high-density cholesterol，HDL-C）以及低密度膽固醇（low-density cholesterol，LDL-C）。

1.2.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 收集根治性手術(shù)切除的乳腺癌組織，經(jīng)石蠟包埋后制成4 μm的組織切片，根據(jù)購(gòu)買(mǎi)的免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HER-2、孕激素受體（pro?gesterone receptor，PR）和雌激素受體（estrogen recep?tor，ER）的免疫組織化學(xué)檢測(cè)，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每張切片選取5個(gè)視野，請(qǐng)兩位副主任醫(yī)師以上的病理學(xué)專(zhuān)家在200×高倍鏡下進(jìn)行盲法讀片，以陽(yáng)性細(xì)胞所占總細(xì)胞比例作為陽(yáng)性細(xì)胞比例。PR和ER定位于細(xì)胞核，而HER-2則定位于細(xì)胞膜，以陽(yáng)性細(xì)胞比例≥10%為陽(yáng)性，＜10%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，t檢驗(yàn)比較組間或組內(nèi)差異；χ2檢驗(yàn)比較組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-6861-5p在不同患者血清中的表達(dá)

3組研究對(duì)象在年齡、BMI、TC、TG、HDL-C以及LDL-C等一般臨床資料或指標(biāo)上對(duì)比無(wú)顯著性差異（均P＞0.05，表1）；112例乳腺癌組患者血清miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量為（7.99±1.63），顯著高于良性病變組患者血清（6.45±1.06）（P＜0.05）和健康血清miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量（6.43±1.28）（P＜0.05），但miR-6861-5p在良性病變研究對(duì)象和健康研究對(duì)象血清中的相對(duì)表達(dá)量對(duì)比無(wú)顯著性差異（P＞0.05，圖1）。

2.2 血清miR-6861-5p表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

以血清miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量＞8為高表達(dá)，≤8為低表達(dá)：112例乳腺癌患者血清miR-6861-5p低表達(dá)患者40例，高表達(dá)患者72例；miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中表達(dá)與年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)（P＞0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR和HER-2表達(dá)、TNM分期、分子分型以及組織學(xué)分期顯著相關(guān)（均P＜0.05，表2）。

2.3 血清miR-6861-5p在乳腺癌腫瘤切除前后的變化

112例乳腺癌患者均經(jīng)手術(shù)切除腫瘤組織進(jìn)行治療。對(duì)比手術(shù)前后血清miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，111例乳腺癌患者術(shù)后血清miR-6861-5p表達(dá)下降，1例表達(dá)上升；術(shù)后112例乳腺癌患者miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量平均值為（6.76±1.60），顯著低于術(shù)前水平（P＜0.05，圖2）。

2.4 血清miR-6861-5p對(duì)乳腺癌臨床診斷的價(jià)值

miR-6861-5p診斷乳腺癌ROC曲線下面積（AUC）為0.781，當(dāng)血清miR-6861-5p相對(duì)表達(dá)量為7.75時(shí)，約登指數(shù)取最大值，此時(shí)miR-6861-5p診斷乳腺癌敏感度為69.6%，特異度為77.8%（圖3）。

2.5 miR-6861-5p與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

所有患者術(shù)后均進(jìn)行為期2年的隨訪，記錄患者術(shù)后乳腺癌腫瘤復(fù)發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，血清miR-6861-5p低表達(dá)的乳腺癌患者術(shù)后1年、2年復(fù)發(fā)率分別為10.0%和22.5%，均顯著低于血清miR-6861-5p高表達(dá)乳腺癌患者（22.2%和38.9%，P＜0.05，圖4）。

表1 3組研究對(duì)象一般資料比較 例

圖1 miR-6861-5p在不同研究對(duì)象血清中的表達(dá)

表2 血清miR-6861-5p表達(dá)與乳腺癌臨床病理資料的關(guān)系例（%）

圖2 乳腺癌腫瘤切除前后血清miR-6861-5p變化

圖3 ROC曲線分析血清miR-6861-5p對(duì)乳腺癌臨床診斷價(jià)值

圖4 miR-6861-5p與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

3 討論

在血清/血漿中穩(wěn)定的microRNA被認(rèn)為是最具潛力的腫瘤生物標(biāo)志物，在乳腺癌的研究中，多種miRNA被證實(shí)可以用于乳腺癌的臨床診斷［11-14］。同時(shí)，典輝等［15］研究指出miR-127-3p在乳腺癌患者外周血中表達(dá)上調(diào)，并且其在乳腺癌患者血漿中的表達(dá)與乳腺癌腫瘤標(biāo)志物CA153表達(dá)呈正相關(guān)，是一個(gè)乳腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物。鐘婧等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在乳腺癌患者血清中不僅表達(dá)上調(diào)，而且與乳腺癌患者TNM分期和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等有關(guān)，診斷乳腺癌的敏感性高達(dá)80%，特異度70%。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達(dá)量顯著高于健康女性和乳腺良性病變女性患者（P＜0.05），并且健康女性和乳腺良性病變女性患者血清 miR-6861-5p表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。miR-6861-5p定位于人類(lèi)染色體12q24.13，目前鮮見(jiàn)研究報(bào)道m(xù)iR-6861-5p的功能，僅Shimomura等［17］在日本人群中篩查可用于乳腺癌早期診斷microRNA組合時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達(dá)顯著高于健康女性，并且與血清miR-1246、miR-1307-3p、miR-6875-5p、miR4634聯(lián)合診斷乳腺癌的敏感度和特異度分別高達(dá)97.3%和82.9%。而本研究miR-6861-5p單獨(dú)診斷乳腺癌敏感度為69.6%，特異度為77.8%，由此提示血清miR-6861-5p檢測(cè)對(duì)乳腺癌篩查具有一定的臨床價(jià)值。

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和組織學(xué)分期均可描述乳腺癌嚴(yán)重程度和受累范圍。本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移乳腺癌患者血清miR6861-5p高表達(dá)比例高達(dá)80.4%（37/46），而淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移比例僅為53.0%（35/66）。有研究指出［18］，由于乳腺并不是人體維持生活活動(dòng)所必須的器官，所以原位乳腺癌的及時(shí)發(fā)現(xiàn)與治療可以取得較好的臨床療效，并不危及患者的生命安全；但是與其他癌細(xì)胞一樣，乳腺癌細(xì)胞也失去了正常細(xì)胞的生物學(xué)特性，細(xì)胞之間的黏連能力較低，容易出現(xiàn)脫落。一旦乳腺癌細(xì)胞出現(xiàn)脫落，游離的癌細(xì)胞可經(jīng)血液或淋巴液播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危及患者生命，降低生存率。同時(shí)，血清miR-6861-5p高表達(dá)患者比例隨臨床分期升高而升高。左婷婷等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期乳腺癌5年生存率高達(dá)90%，但Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌卻低于70%；乳腺癌患者5年生存率隨臨床分期升高而降低。

根據(jù)乳腺癌腫瘤組織ER、PR和HER-2的表達(dá)可將乳腺癌分為L(zhǎng)uminia A型、Luminia B型、HER-2過(guò)表達(dá)型和Basal-like型。乳腺癌分子分型不僅可以指導(dǎo)乳腺癌患者的臨床治療，而且與患者臨床治療效果和預(yù)后有關(guān)，HER-2（+）過(guò)表達(dá)型和Basal-like型乳腺癌預(yù)后最差，Luminia B型次之，Luminia A型乳腺癌預(yù)后最好［19-20］。本研究中miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達(dá)與乳腺癌腫瘤組織ER、PR、HER-2表達(dá)以及乳腺癌分子分型有關(guān)，并且手術(shù)切除乳腺腫瘤組織miR-6861-5p表達(dá)會(huì)顯著下調(diào)，低表達(dá)miR-6861患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)率較低，這提示檢測(cè)乳腺癌患者血清miR-6861-5p對(duì)乳腺癌患者臨床治療和預(yù)后預(yù)測(cè)具有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中表達(dá)上調(diào)，是術(shù)前乳腺癌診斷、腫瘤分期、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和術(shù)后監(jiān)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物。

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