金卓，蔣凱，金珂，梁晨，梁琳潔，丁濱

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053）

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、人口的增長，城市污水、養(yǎng)殖業(yè)及相關(guān)制藥產(chǎn)業(yè)垃圾等含有的固醇類化合物對生態(tài)平衡破壞的問題逐漸突顯[1-2]。膽固醇、糞固醇、膽汁酸、甚至雌二醇等固醇類化合物已經(jīng)被作為生物標(biāo)志物來評價(jià)環(huán)境污染物的類型及污染程度[2-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每個人每天排出固醇類化合物的總量在0.2～1 g[3]。糞固醇的長側(cè)鏈在化學(xué)或生物因素的作用下極易斷裂，形成固醇類激素。2014年，Sistiaga和Goldberg等人從遠(yuǎn)古人類生活遺跡的化石中分離到了固醇類化合物[5]。加拿大學(xué)者跟蹤調(diào)查的結(jié)果表明，此類化合物可在土壤中沉積超過1年[3]。

細(xì)菌細(xì)胞中缺乏固醇類化合物，卻可以利用這類化合物作為唯一碳源生長繁殖。有研究證明，在有氧條件下，活性污泥中的微生物需要約20天才可以降解掉生活污水中的固醇類污染物，包括固醇類激素[3,6]。2003年，Tarlera和Denner從環(huán)境中分離到1株能夠在反硝化條件下降解膽固醇的細(xì)菌，經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)其為β-變形菌門的一個新屬，被命名為Sterolibacteriumdenitrificans Chol-1ST（DSMZ 13999）[7]，與已知能夠降解單苯環(huán)類化合物的Thauera屬和Azoarcus屬[8]細(xì)菌的親緣關(guān)系比較近。該細(xì)菌能夠利用的碳源有限，目前發(fā)現(xiàn)它僅能利用膽固醇以及少量的結(jié)構(gòu)類似物為碳源生長。該屬至今僅有兩個成員，另一株是尚未鑒定和命名的菌株72Chol[9]。豐富的研究對象是研究膽固醇在無氧環(huán)境中代謝過程的前提，筆者從以膽固醇為底物的生活污水富集物中分離到了一株細(xì)菌，并對該細(xì)菌進(jìn)行了系統(tǒng)分類鑒定。

1 試劑及儀器

用于培養(yǎng)基配制的化學(xué)及生化試劑均購自華東醫(yī)藥股份有限公司（杭州），16s rDNA細(xì)菌鑒定PCR試劑盒由寶生物工程（大連）有限公司提供；PCR儀由美國伯樂公司提供；電泳儀（DYY-6B）購自北京市六一儀器廠；分光光度計(jì)（ZF-2）購于上海嘉鵬科技有限公司；生化培養(yǎng)箱由寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)菌的無氧富集、分離與純化

將土壤樣品富集在以硝酸鹽為電子受體、含1 g膽固醇的MS培養(yǎng)基中1年。將富集培養(yǎng)物混勻后連續(xù)梯度稀釋純化4次，顯微鏡下觀察富集物中的細(xì)菌形態(tài)均一、一致。上述過程及使用的培養(yǎng)基均經(jīng)過充CO2保持無氧環(huán)境。

2.2 克隆PCR及細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

將離心收集的菌泥重新懸浮于無菌水中，加熱煮沸后迅速冰浴，反復(fù)兩次使細(xì)胞溶解，制成細(xì)菌裂解液。加入含一對序列為27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和519R GWATTACCGCGGCKGCTG的引物的PCR反應(yīng)體系中，依次經(jīng)過94℃變性、55℃退火、72℃延伸，循環(huán)35次，體外擴(kuò)增該菌落的16s rDNA序列。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測，并由上海生物工程有限公司（上海）測序。獲得的序列在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站進(jìn)行比對分析。

2.3 革蘭氏染色及細(xì)菌形態(tài)觀察

以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照，先后經(jīng)過結(jié)晶紫初染、碘液媒染、酒精脫色、番紅復(fù)染4個步驟，干燥載玻片，在油鏡下觀察。

2.4 最適培養(yǎng)條件

（1）將細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物按1∶20比例分別接種于pH為4、5、6、7、8、9和10的MS培養(yǎng)基中，放入搖床中30℃、180 r/min培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物OD600的變化判斷細(xì)菌生長最適pH值。（2）將細(xì)菌接種于最適pH的MS培養(yǎng)基中，分別放置在20、30、40℃及50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)物OD600的變化判斷細(xì)菌生長最適溫度。（3）將細(xì)菌接種于含不同濃度梯度底物的培養(yǎng)基中，根據(jù)培養(yǎng)物OD600值的變化判斷細(xì)菌生長最適底物濃度。以上實(shí)驗(yàn)每組各設(shè)重復(fù)3個。將細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物按1∶50比例接種于最適培養(yǎng)基中，于最適溫度下?lián)u床培養(yǎng)，并確保硝酸鹽過量，在不同時(shí)間段取出培養(yǎng)物，測培養(yǎng)物OD600值，計(jì)算代時(shí)。

2.5 底物代謝能力實(shí)驗(yàn)

將細(xì)菌分別接種于含0.5%果糖、0.5%乳糖、0.5%棉子糖、0.5%葡萄糖、0.5%阿拉伯糖、0.5%木糖、0.5%乳糖、1 mmol/L苯酚、1 mmol/L膽酸鈉、0.5%甘油、10 mg膽固醇、1 mg苯并芘、1 mmol/L苯甲酸、1%辛烷（V/V）和1%環(huán)己烷（V/V）的最適培養(yǎng)基中，根據(jù)渾濁度變化判斷細(xì)菌是否具有代謝能力。

3 結(jié)果和分析

Thau-01為細(xì)小桿狀，革蘭氏陰性細(xì)菌。培養(yǎng)基最適pH為8，最適培養(yǎng)溫度為30℃，最佳底物濃度為4～8 mg/mL。在最適條件下底物濃度為8 mg/ml時(shí)細(xì)菌代時(shí)為56min。該細(xì)菌在反硝化條件下不能代謝甘油、果糖、乳糖、棉子糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、乳糖、苯酚、苯甲酸、膽酸鈉和苯并芘等化合物，能代謝1%辛烷和環(huán)己烷。該細(xì)菌16s RNA編碼序列的前500個堿基與Thaueraaromatica和Sterolibacteriumdenitrificans strain Chol-1S同源性最高，為94%。此外，該菌與Georgfuchsiatoluolica strain G5G6，反硝化富集物中分離的兩個克隆NOA 1 F6和NOB 2 A10有92%的同源性。其中Strain Chol-1S是由澳大利亞的一個實(shí)驗(yàn)室分離到的，該細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，短棒狀，細(xì)菌的一端有鞭毛一根，可運(yùn)動，菌體上附著有纖毛，除固醇類化合物，該細(xì)菌僅可以代謝長鏈飽和脂肪酸[7]。T.aromatica是一類能夠在有氧和反硝化條件下降解代謝芳香類化合物的細(xì)菌，不善于利用糖類和固醇類化合物。Strain G5G6是2009年由荷蘭的實(shí)驗(yàn)室在甲苯為底物、多種電子受體存在的厭氧條件下分離到的，該菌分別以三價(jià)鐵、硝酸為電子受體、以甲苯為底物生長，雖然也代謝固醇類化合物，卻不利用膽固醇[10]。將Thau-01與上述三個屬的細(xì)菌進(jìn)行對比，認(rèn)為Thau-01與Sterolibacteriumdenitrificans更相似，當(dāng)然這一推測還需要經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證。

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