張建霞，張寧，李子涵

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南　250000)

近年來隨著二胎政策的全面放開，高齡女性生育二胎的要求增加，其面臨的不孕和高流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)成為國內(nèi)外學(xué)者探討的熱點(diǎn)。卵母細(xì)胞的質(zhì)量是直接影響正常妊娠和造成反復(fù)流產(chǎn)的主要因素。人成熟的卵母細(xì)胞是人體含有線粒體最多的細(xì)胞，內(nèi)含有超過10萬個(gè)線粒體。線粒體在卵母細(xì)胞中，不僅是“能量工廠”，也是卵母細(xì)胞內(nèi)除細(xì)胞核以外唯一攜帶DNA的細(xì)胞器，在促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟、精卵結(jié)合和胚胎發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄與翻譯提供能量等方面有重要作用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞線粒體與卵母細(xì)胞激活、鈣振蕩、凋亡程序啟動等生命過程密切相關(guān)[1]。且在哺乳動物的胚胎中，因精子的線粒體在受精的過程中被損壞了，胚胎中的線粒體全部依賴于卵母細(xì)胞[2]。針對ART中存在胚胎質(zhì)量優(yōu)良卻移植失敗的現(xiàn)象和線粒體遺傳疾病，現(xiàn)對卵母細(xì)胞線粒體病變在生殖領(lǐng)域的治療進(jìn)行綜述。

一、卵母細(xì)胞線粒體簡介

1.結(jié)構(gòu)和空間分布：線粒體是雙層膜的細(xì)胞器，電鏡下由內(nèi)膜和外膜、基質(zhì)和嵴構(gòu)成。不同細(xì)胞內(nèi)的線粒體有不同的結(jié)構(gòu)，卵母細(xì)胞線粒體多呈圓形。在卵母細(xì)胞成熟過程中，其空間分布可作為評估卵母細(xì)胞質(zhì)量的一項(xiàng)指標(biāo)。在生發(fā)泡期(germinal vesicle，GV期)，線粒體處于幼稚狀態(tài)，多呈圓形、少嵴，分布在細(xì)胞質(zhì)中；在生發(fā)泡破裂期(germinal vesicle breakdown，GVBD)，線粒體已成熟，聚集于細(xì)胞核周圍，呈長梭形，多嵴；第二次減數(shù)分裂(Meiosis，MⅡ)，線粒體沿紡錘體分布，以輔助紡錘體的形成和染色體的分離。

2.線粒體DNA(mtDNA)：人成熟卵母細(xì)胞中每個(gè)線粒體含有1～2個(gè)mtDNA，而mtDNA拷貝數(shù)范圍在3萬～100萬[3]，在卵母細(xì)胞中mtDNA拷貝數(shù)與受精、胚胎發(fā)育潛能成正相關(guān)[4]。與細(xì)胞核DNA相比，mtDNA 因缺乏組蛋白的保護(hù)和必要的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)[5]，且處于高自由基的環(huán)境中，更容易突變或受損，從而影響受精率和胚胎發(fā)育潛能。因卵母細(xì)胞成熟后(MⅡ期)mtDNA停止復(fù)制，直至囊胚期才恢復(fù)，卵胞漿中的線粒體對胚胎的發(fā)育顯得尤為重要。

3.代謝途徑：哺乳動物的卵母細(xì)胞線粒體主要是通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生ATP[6]。卵母細(xì)胞中，線粒體在限制最低水平活性氧(reactive oxygen species，ROS)的條件下，迅速有效地為細(xì)胞“定點(diǎn)”提供能量，低劑量的ROS能調(diào)控卵母細(xì)胞成熟，若線粒體能量產(chǎn)生過程中釋放過多ROS，卵母細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，會造成mtDNA的氧化損傷、突變和缺失，從而影響卵母細(xì)胞成熟與受精。

二、影響卵母細(xì)胞線粒體的因素

1.高齡：年齡是導(dǎo)致卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的直接因素[7]，主要表現(xiàn)在兩點(diǎn)：卵母細(xì)胞的數(shù)量隨著年齡的增長逐漸減少，mtDNA拷貝數(shù)下降、突變和缺失增加；卵母細(xì)胞的質(zhì)量逐漸降低，即卵母細(xì)胞老化，分為排卵前老化和排卵后老化。排卵前卵母細(xì)胞依靠卵泡壁顆粒細(xì)胞和卵丘細(xì)胞提供能量，而排卵后卵母細(xì)胞自身線粒體開始激活，線粒體嵴增多，通常認(rèn)為年齡與排卵前老化相關(guān)。

2.糖尿病、肥胖：肥胖和糖尿病患者體內(nèi)卵母細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，李俐琳等[8]用動物實(shí)驗(yàn)研究了肥胖對小鼠卵母細(xì)胞體內(nèi)老化的機(jī)制，證實(shí)肥胖會促進(jìn)卵母細(xì)胞排卵后老化，其中最主要的原因還是氧自由基對卵母細(xì)胞的損傷。肥胖小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAM)相關(guān)蛋白IP3R1和PACS-2的增加也會導(dǎo)致線粒體異常[9]。這表明MAM含量的增多可以成為卵母細(xì)胞線粒體異常的一個(gè)指標(biāo)，為肥胖導(dǎo)致的卵母細(xì)胞的線粒體損傷提供新的治療靶點(diǎn)。

三、卵母細(xì)胞線粒體缺陷引起的疾病

1.反復(fù)種植失敗和流產(chǎn)：高齡婦女的抗氧化能力下降，自由基減少，ROS堆積，同時(shí)伴隨供能的ATP減少，導(dǎo)致卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體分離障礙，形成非整倍體胚胎，而非整倍體胚胎是反復(fù)種植失敗和流產(chǎn)的主要因素。

2.卵巢儲備功能減退(decreased ovarian reserve，DOR)：Slotkin等[10]認(rèn)為ATP水平低下可激活卵的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號途徑，導(dǎo)致原始卵泡的異常激活、丟失增多，卵泡過早衰竭逐漸發(fā)展為DOR。

3.線粒體遺傳性疾病:線粒體遺傳性疾病是母系家族性疾病，是由于卵母細(xì)胞中的mtDNA突變引起[11]，其臨床表現(xiàn)多樣，包括：線粒體腦肌病、線粒體遺傳性糖尿病、胃腸綜合征、肌張力障礙等[12]。

四、卵母細(xì)胞線粒體病變在生殖領(lǐng)域的治療現(xiàn)狀

1.卵胞質(zhì)移植(ooplasmic transfer，OT)：將供體卵母細(xì)胞的部分細(xì)胞質(zhì)經(jīng)顯微操作技術(shù)移植到受體卵母細(xì)胞內(nèi)，再對重構(gòu)卵進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)單精子注射，稱為OT，尤其是年輕供者卵母細(xì)胞胞漿中的線粒體對高齡女性受者卵母細(xì)胞可能發(fā)揮補(bǔ)充作用。OT技術(shù)早已提出并被首次使用在大齡不孕不育患者中，且獲得了成功[13]。但有研究顯示外源性線粒體雖然對受體卵胞質(zhì)有一定活性和功能，但有功能的卵胞質(zhì)被引入的同時(shí)也會造成受精卵的異質(zhì)性[14]，造成極大潛在安全隱患。最近，一項(xiàng)隨訪研究報(bào)道，年齡在13至18歲的OT出生兒童身體大致健康，基本認(rèn)知能力正常，但有的小孩會伴有輕微的皮膚問題、輕微視覺障礙、輕度哮喘和慢性偏頭痛[15]。該項(xiàng)研究顯示大量捐贈者卵胞質(zhì)移植入受體卵母細(xì)胞，可能不是最可行的方法。

2.線粒體替代療法[16](mitochondrial replacement therapy，MRT)：用外源性健康的線粒體補(bǔ)充或替代發(fā)育阻滯的卵母細(xì)胞或受精卵中的異常線粒體。(1)原核移植(pronuclear transfer，PNT)：是先使攜帶異常線粒體的卵母細(xì)胞受精，然后將受精卵的細(xì)胞核移植到捐贈者去核的卵細(xì)胞內(nèi)，再植入攜帶異常線粒體的母體內(nèi)。2010年首次報(bào)道了PNT，此移植后的胚胎中3%～8%可發(fā)育到卵裂期，且遺留少量受體卵母細(xì)胞的mtDNA，其安全性和有效性還無法得到保證[17]。2016年Hyslop等[18]在該P(yáng)NT的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂完成后立刻(ICSI后8 h內(nèi)，早期PNT)進(jìn)行PNT，而不是在受精卵第一次有絲分裂前(ICSI后16 h，晚期PNT)進(jìn)行PNT。改進(jìn)后，遺留的mtDNA比絕大多數(shù)卵裂期的PNT減少至2%，此方法降低了線粒體遺傳病的發(fā)生。(2)紡錘體移植(spindle transfer，ST)：是將母親和捐獻(xiàn)者卵母細(xì)胞中MⅡ期細(xì)胞核先移走，再將母親卵細(xì)胞的核注入捐獻(xiàn)者卵細(xì)胞中，用獲得的新卵母細(xì)胞與精子受精。紐約新希望生殖中心Zhang等[19]在2016年9月首次利用ST將捐獻(xiàn)者的卵母細(xì)胞線粒體取代攜帶Leigh syndrome變異基因的卵母細(xì)胞線粒體，幫助一對夫妻順利生產(chǎn)出健康男嬰?？茖W(xué)家們對該男嬰的線粒體進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示含有變異基因的線粒體不到1%，該比例不會造成任何健康問題。他們還會繼續(xù)對該男嬰跟蹤檢測，以確保保持該比例。該技術(shù)減少了mtDNA的突變量，但因該方法首次使用且考慮mtDNA的異質(zhì)性漂移，持續(xù)追蹤該男孩的健康狀況很有意義。

3.自體生殖細(xì)胞線粒體移植(autologous germiline mitochondrial energy transfer，AUGMENT)：自體生殖細(xì)胞包括卵母干細(xì)胞(oogonial stem cells，OSCs)和成熟卵母細(xì)胞。據(jù)報(bào)道[20]人類的OSCs需要通過皮質(zhì)活檢從卵巢中分離出來，再通過差異離心的方法離心出卵母干細(xì)胞的線粒體，再結(jié)合ICSI技術(shù)把線粒體注入卵母細(xì)胞來改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量，可解決卵胞質(zhì)移植出現(xiàn)的細(xì)胞異質(zhì)性問題，但是否通過了遺傳瓶頸且適合下一代目前未得到證明[21]。通過自體卵母細(xì)胞線粒體移植使有缺陷卵母細(xì)胞恢復(fù)高質(zhì)量的線粒體，已經(jīng)應(yīng)用于少數(shù)不孕不育夫婦[22]。相比于OSCs，利用IVF、未成熟卵體外培養(yǎng)成熟(IVM)和原始卵泡體外激活術(shù)(IVA)剩余的成熟卵母細(xì)胞更簡單易獲取，且通過了線粒體基因瓶頸[23]，有望移植后改善卵母細(xì)胞線粒體的質(zhì)量。

4.自體間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)線粒體卵母細(xì)胞移植：MSC是來源于中胚層的一種具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能的成體干細(xì)胞[24]，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。它不僅能夠向多種組織和細(xì)胞分化，而且易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，易于外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)，在體外長期培養(yǎng)時(shí)能始終保持多向分化的潛能。與成體細(xì)胞線粒體相比，干細(xì)胞線粒體具有球形、嵴數(shù)目少、ATP通過糖酵解轉(zhuǎn)化等與卵母細(xì)胞線粒體相似的特征[25]。據(jù)此姚元慶[26]在2017年“上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會”上分享了新的研究思路和臨床策略，將自體脂肪組織MSC線粒體移植到高齡不孕女性的卵母細(xì)胞，來糾正線粒體功能不全，改善ART的臨床結(jié)局，已在小鼠身上證實(shí)了線粒體注射后，老齡MⅡ卵細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)顯著升高。它的優(yōu)勢在于：采取自體線粒體移植不存在線粒體異質(zhì)性；其次，避免第三方基因組所帶來的倫理問題；第三，不需要第三方供卵，提高臨床應(yīng)用的可行性。目前該方法已應(yīng)用在動物上，證明自體間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體移植能夠改善高齡卵母細(xì)胞質(zhì)量，相關(guān)在人體上的研究正在后期進(jìn)行中。

5.口服藥物：(1)西藥：飲食中補(bǔ)充線粒體營養(yǎng)物能有效改善成熟卵母細(xì)胞和胚胎線粒體的能量[27]，α-亞麻酸通過增加卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)提高卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能。輔酶Q10可保護(hù)線粒體不受化學(xué)損傷，增加卵母細(xì)胞線粒體ATP合成，減少ROS水平，減少非整倍體卵母細(xì)胞的產(chǎn)生。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明52周鼠齡的ICR鼠，其補(bǔ)充輔酶Q10能明顯增加卵母細(xì)胞的數(shù)量和線粒體活性，是提高質(zhì)量受損的卵母細(xì)胞線粒體功能的一個(gè)途徑[27]。(2)中藥：林飛等[28]提出線粒體在某種意義上反應(yīng)了中醫(yī)“氣”的作用，即氣的物質(zhì)屬性可能是線粒體，有共同的物質(zhì)起源、都是構(gòu)成生命體的微小物質(zhì)、都負(fù)載著生命現(xiàn)象、功能相似等。邱林等[29]總結(jié)出中醫(yī)藥通過對線粒體的保護(hù)來影響能量代謝。郭穎等[30]實(shí)驗(yàn)得出：二至天癸顆粒可能通過改善小鼠胚胎線粒體膜電位來提高受精率、卵裂率，從而改善卵母細(xì)胞的質(zhì)量和早期胚胎的發(fā)育潛能。

五、總結(jié)

卵母細(xì)胞線粒體作為卵母細(xì)胞的能量工廠，其結(jié)構(gòu)和功能異常是妊娠失敗的重要因素。隨著科學(xué)家對卵母細(xì)胞線粒體病變的研究深入，其治療方案逐步接近自然生理狀態(tài)，包括中醫(yī)藥對人的整體改善作用，以期待中西醫(yī)結(jié)合來提高卵母細(xì)胞線粒體的質(zhì)量，對輔助生育技術(shù)有新的突破。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Van Blerkom J. Mitochondrial function in the human oocyte and embryo and their role in developmental competence[J].Mitochondrion，2011，11：797-813.

[2]Luo SM，Ge ZJ，Wang ZW，et al. Unique insights into maternal mitochondrial inheritance in mice[J].Proc Nati Acad Sci U S A，2013，110：13038-13043.

[3]Van Blerkom J. Mitochondria as regulatory forces in oocytes，preimplantation embryos and stem cells[J/OL].Reprod Biomed Online，2008，16：553-569.

[4]Ge H，Tollner TL，Hu Z，et al. The importance of mitochondrial metabolic activity and mitochondrial DNA replication during oocyte maturation in vitro on oocyte quality and subsequent embryo developmental competence[J].Mol Reprod Dev，2012，79：392-401.

[5]Fu X，Cheng J，Hou Y，et al. The association between the oocyte pool and aneuploidy：a comparative study of the reproductive potential of young and aged mice[J].J Assist Reprod Genet，2014，31：323-331.

[6]王元芬，郝建秀，王輝，等.線粒體功能在卵母細(xì)胞成熟中的作用綜述[J].解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，38：987-989.

[7]楊華，劉鋒，盧克煥.年齡、線粒體與女性生殖能力的關(guān)系[J].武警醫(yī)學(xué)，2008，19：272-274.

[8]李俐琳，任姿，曾海濤，等. 肥胖引起的線粒體功能及抗氧化異常促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞排卵后老化[J].中國病理生理雜志，2012，28：1841-1846.

[9]趙麗紅. 食源肥胖鼠卵母細(xì)胞線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)功能的研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

[10]Slotkin EK，Patwardhan PP，Vasudeva SD，et al. MLN0128，an ATP-Competitive mTOR Kinase Inhibitor，with Potent In vitro and In vivo Antitumor Activity as Potential Therapy for Bone and Soft-Tissue Sarcoma[J].Mol Cancer Ther，2015，14：395-406.

[11]Chinnery PF，Turnbull DM. Epidemiology and treatment of mitochondrial disorders[J].Am J Med Genet，2001，106：94-101.

[12]Chinnery PF，Elliott HR，Hudson G，et al. Epigenetics，epidemiology and mitochondrial DNA diseases[J].Int J Epidemiol，2012，41：177-187.

[13]Cohen J，Scott R，Schimmel T，et al. Birth of infant after transfer of anucleate donor oocyte cytoplasm into recipient eggs[J].Lancet，1997，350：186-187.

[14]St John JC. Ooplasm donation in humans：the need to investigate the transmission of mitochondrial DNA following cytoplasmic transfer[J].Hum Reprod，2002，17：1954-1958.

[15]Chen SH，Pascale C，Jackson M，et al. A limited survey-based uncontrolled follow-up study of children born after ooplasmic transplantation in a single center[J/OL].Reprod Biomed Online，2016，33：737-744.

[16]Wolf DP，Mitalipov N，Mitalipov S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine[J].Trends Mol Med，2015，21：68-76.

[17]Craven L，Tuppen HA，Greggains GD，et al. Pronuclear transfer in human embryos to prevent transmission of mitochondrial DNA disease[J].Nature，2010，465：82-85.

[18]Hyslop LA，Blakeley P，Craven L，et al. Towards clinical application of pronuclear transfer to prevent mitochondrial DNA disease[J].Nature，2016，534：383386.

[19]Zhang J，Liu H，Luo S，et al. Live birth derived from oocyte spindle transfer to prevent mitochondrial disease[J/OL].Reprod Biomed Online，2017，34：361-368.

[20]Woods DC，Tilly JL. Autologous germline mitochondrial energy transfer(AUGMENT)in human assisted reproduction[J].Semin Reprod Med，2015，33(6)：410-421.

[21]Gosden RG，Johnson MH. Can oocyte quality be augmented？[J/OL].Reprod Biomed Online，2016，32：551-555.

[22]Oktay K，Baltaci V，Sonmezer M，et al. Oogonial Precursor Cell-Derived Autologous Mitochondria Injection to Improve Outcomes in Women With Multiple IVF Failures Due to Low Oocyte Quality：A Clinical Translation[J].Reprod Sci，2015，22：1612-1617.

[23]Kristensen SG，Pors SE，Andersen CY. Improving oocyte quality by transfer of autologous mitochondria from fully grown oocytes[J].Hum Reprod，2017，32：725-732.

[24]張凱，王毅，邢國勝. 間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12：539-542.

[25]Lonergan T，Bavister B，Brenner C. Mitochondria in stem cells[J].Mitochondrion，2007，7：289-296.

[26]姚元慶.高齡對卵母細(xì)胞線粒體的影響及線料體示多植技術(shù)的新探索.上海市中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會生殖醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會資料匯編[C].上海；2017.

[27]Bentov Y，Esfandiari N，Burstein E，et al. The use of mitochondrial nutrients to improve the outcome of infertility treatment in older patients[J].Fertil Steril，2010，93：272-275.

[28]林飛，郭麗麗，王階. 基于線粒體的功能闡釋中醫(yī)“氣”的作用[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014，34：903-906.

[29]邱林，李美紅，夏洽思，等. 中醫(yī)藥對線粒體保護(hù)機(jī)制的研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)雜志，2017，33：214-215.

[30]郭穎，連方. 二至天癸顆粒對初老小鼠胚胎線粒體膜電位及發(fā)育潛能的影響[J].山東醫(yī)藥，2016，56：43-45.