不同施氮量對花生葉片衰老和產量的影響

李海東 張艷艷 康濤 陳建生 張利民 任志紅 李文金

摘要：以花生品種山花108為材料，探討了5個施氮水平N0（不施氮，CK）、N37.5（施純氮37.5 kg/hm2，下同）、N75、N112.5、N150對花生葉片活性氧產生途徑米勒反應和光呼吸、H2O2含量、葉片衰老、葉斑病發(fā)生程度及產量的影響。結果表明，隨著施氮量的增加，在N0到N75處理范圍內，米勒反應、光呼吸、H2O2含量、葉片衰老和葉斑病發(fā)生呈現(xiàn)降低的趨勢，而產量呈升高趨勢；在N75到N150處理范圍內，產量呈降低趨勢，以上其它指標呈現(xiàn)增加趨勢。施氮量可通過調控活性氧的清除和產生對花生衰老和葉斑病的發(fā)生以及產量進行影響。

關鍵詞：花生；衰老；葉斑病；活性氧；光呼吸；米勒反應

中圖分類號：S565.201文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）02-0093-05

Abstract The effects of different nitrogen application rates on the Mehler reaction， photorespiration， H2O2 content， leaf senescence， incidence of leaf spot disease and yield were studied with the peanut cultivar Shanhua 108 as material. Five nitrogen application rates were designed as no nitrogen （N0）， 37.5 kg/hm2 （N37.5）， 75.0 kg/hm2 （N75.0）， 112.5 kg/hm2 （N112.5） and 150.0 kg/hm2 （N150）. The results showed that in the range of 0～75 kg/hm2， the Mehler reaction， photorespiration， H2O2 content， leaf senescence and incidence of leaf spot disease decreased， while the yield increased with the increase of nitrogen application rates.But in the range of 75～150 kg/hm2， the yield decreased while the other characters increased.In conclusion， nitrogen application rate regulated the peanut senescence，incidence of leaf spot disease and yield via affecting both the elimination and generation of reactive oxygen species （ROS）.

Keywords Peanut； Senescence； Leaf spot disease； ROS； Photorespiration； Mehler reaction

花生是我國重要的經濟作物和油料作物。前人研究表明，花生生育后期的衰老是導致其產量下降的重要原因，延緩衰老可以提高花生產量[1，2]?；ㄉ笃诎l(fā)生的葉斑病是花生生產中最普遍、危害最大的病害，是產量下降的另一重要因素，一般使花生減產10%～20%[3，4]。

植物的衰老是一種程序化死亡過程[5，6]，受多種信號分子的調控，如活性氧、Ca2+、一氧化氮和多胺等[7-10]。葉斑病的發(fā)生也需要眾多信號分子的調控，包括Ca2+、活性氧和水楊酸等[11-14]?；钚匝跫饶苷{控葉片的衰老，也能調控葉斑病的發(fā)生。光合作用中的光呼吸和米勒反應產生的活性氧占葉片產生活性氧的絕大部分[15]，其中光呼吸在過氧化物體中產生H2O2[16]，米勒反應產生O·-2，O·-2受SOD的作用轉化為H2O2[17]。研究光合機構活性氧的產生與花生衰老、葉斑病發(fā)生的關系具有重要理論意義和現(xiàn)實意義。

施氮量會影響花生的衰老[1]，而葉斑病往往和衰老同時發(fā)生[2]，但是由于測定方法的限制，前人對活性氧的清除研究較多，對活性氧的產生過程米勒反應和光呼吸的變化了解較少。

本試驗采用較成熟的氣體交換和熒光方法，測定米勒反應和光呼吸，為延緩花生衰老和降低葉斑病發(fā)生的研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2016年在泰安市邱家店試驗站進行，供試土壤為中壤土，土壤肥力為有機質含量17.2 g/kg，全氮 1.2 g/kg，堿解氮 110.1 mg/kg，速效磷 35.2 mg/kg，速效鉀 103.5 mg/kg。

供試材料為花生品種山花108。設置5個施氮水平：N0（不施氮肥，CK）、N37.5（施純氮37.5 kg/hm2，下同）、N75、N112.5、N150，磷（P2O5 120 kg/hm2）、鉀（K2O 150 kg/hm2）用量相同。隨機區(qū)組排列，重復3次，小區(qū)面積13.3 m2。6月10日麥收后貼茬種植花生，666.7m2種植密度為9 000穴 ，每穴2粒。

1.2 測定項目與方法

分別于播種后27、47、81、96、111 d取樣，測定葉片H2O2含量，SOD、CAT、APX 活性，葉綠素含量、丙二醛（MDA）含量，于上午9∶00—11∶00測定米勒反應和光呼吸速率，播種后96、111 d測定葉斑病的病級，于收獲期（播種后120 d）以小區(qū)為單位收獲，自然風干，測定花生莢果產量。

過氧化氫含量、CAT活性和MDA含量參照趙世杰等[18]的方法測定，SOD參照王愛國等[19]的方法，APX活性參照Nakano等[20]的方法測定。

米勒反應以Miyake等[17]的方法進行測算。根據公式Je=PFD×ΦPSII×α計算總電子流Je，其中α=4×（Pn+Rd）/（PFD×ΦPSII）；碳代謝的電子流（Jg）根據公式Jg=（Pn+Rd）×（4Ci + 8Γ）/（Ci-Γ）測定，其中Rd為暗呼吸速率，Γ為CO2補償點。額外電子流（Ja）根據公式Ja=Je-Jg計算。通過光合儀與熒光儀聯(lián)用分別測定和計算出大氣條件（21% O2，360 μmol/mol CO2）與自配低氧氣體（2% O2，360 μmol/mol CO2）條件下的Ja和Ja′，根據下式計算米勒反應：米勒反應=Ja-Ja′。

采用PP-Systems公司生產的Ciras-1便攜式光合測定系統(tǒng)分別測定大氣（21% O2，360 μmol/mol CO2）與自配低氧氣體（2% O2，360 μmol/mol CO2）條件下葉片的光合速率Pn，每次測定選取3株，重復3次。計算光呼吸速率Pr=Pn2-Pn1，式中Pn2為低氧氣體下的Pn，Pn1為大氣條件下的Pn[21]。

病情分級參照劉風珍等[22]的標準，小區(qū)內單株病級加權平均為小區(qū)病級。

1.3 數據處理

用Microsoft Excel 2007和DPS軟件對數據進行分析作圖。

2 結果與分析

2.1 不同施氮量對花生葉片H2O2含量、米勒反應和光呼吸的影響

圖1A顯示，隨著花生生育期的推進，葉片H2O2含量呈增加趨勢。在播種后27 d不同氮處理的H2O2含量差異不顯著，到生育期后期差異逐漸明顯。施氮75 kg/hm2處理葉片產生的H2O2含量最少，施氮量增加或減小都會導致葉片H2O2含量的增加，比如在播種后111 d，N0、N37.5、N112.5和N150處理葉片的H2O2含量分別是N75處理的1.89、1.29、1.22倍和1.63倍。

圖1B顯示，在整個生育期內，米勒反應呈增加趨勢，播種后111 d米勒反應的大小為播種后27 d的4～9倍。在生育期初期，不同施氮處理的米勒反應差異并不明顯，至生育期后期，差異逐漸顯著。在播種后111 d時，當施氮量小于75 kg/hm2時，米勒反應表現(xiàn)為N75N112.5>N75，表明在此范圍內，隨著施氮量的增加，米勒反應呈增加趨勢。

圖1C顯示，在整個生育期內，光呼吸速率呈增加趨勢，至播種后111 d，光呼吸速率為播種后27 d的2～4倍。在播種后111 d，N75處理下的光呼吸速率最小，在N0到N75處理范圍內，隨著施氮量的增加，光呼吸速率呈減小趨勢，在N75到N150處理范圍內，隨著施氮量的增加，光呼吸速率呈增加趨勢。

2.2 不同施氮量對花生葉片抗氧化酶活性的影響

圖2A顯示，在花生整個生育期內，SOD活性的最大值出現(xiàn)在播種后81 d，呈現(xiàn)出單峰曲線變化趨勢。N75處理SOD活性處于最高位置，施氮量增加或減少都會導致SOD活性的降低。

圖2B顯示，在整個生育期內，CAT活性的最大值出現(xiàn)在播種后47 d，為單峰曲線。在N0到N75處理范圍內，隨著施氮量的增加，CAT活性呈現(xiàn)增加趨勢，在N75到N150處理范圍內，隨著施氮量的增加，CAT活性呈下降趨勢。

圖2C顯示，隨著生育期的推進，APX活性呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，峰值出現(xiàn)在播后81 d。隨著施氮量的增加，APX活性的變化趨勢與SOD一致。

2.3 不同施氮量對花生葉片MDA含量的影響

MDA含量高低代表膜脂過氧化程度，是植物衰老的重要指標。隨著生育期的推進，MDA含量呈增加趨勢，但是在不同施氮量處理中，N75處理下的MDA含量一直最低（圖3），顯示N75處理膜脂過氧化程度最輕，最有利于延緩花生的衰老。

2.4 不同施氮量對花生生育后期葉斑病發(fā)病程度的影響

由圖4看出，花生生育后期葉斑病呈增加趨勢，隨著施氮量的增加，在N0至N75處理范圍內，葉斑病發(fā)生呈降低趨勢，在N75至N150處理范圍內，葉斑病發(fā)生呈上升趨勢。

2.5 不同施氮量對花生產量的影響

圖5顯示，隨著施氮量的增加，花生產量呈現(xiàn)出先增高后下降的趨勢，其中以N75處理花生莢果產量最高，達5 882.63 kg/hm2。以上結果表明，適宜的施氮量可以抑制活性氧的產生，提高花生產量。

3 討論與結論

試驗結果顯示，在整個生育期中，光呼吸速率和米勒反應均呈增加趨勢，表明活性氧一直在增加。抗氧化酶活性一般會隨著活性氧的增多呈現(xiàn)出增長趨勢[23-25]，但在本試驗中，SOD活性和APX活性在播種后81 d出現(xiàn)峰值，CAT活性在播種后47 d出現(xiàn)峰值，表明抗氧化酶活性在生育后期并沒有隨活性氧的增多而增加，這勢必會進一步造成活性氧含量的增大，圖1A中H2O2含量變化也證實了這一點。活性氧的增多可以使細胞膜受到傷害，本試驗中MDA含量的變化也印證了這一事實，而細胞膜的傷害是細胞衰老的重要指標[26，27]。以上結果顯示，在花生葉片中，活性氧（米勒反應和光呼吸）的增多以及抗氧化酶活性的降低共同導致了花生葉片的衰老。而施氮量調控著活性氧的產生和清除，在施氮量為75 kg/hm2時，米勒反應和光呼吸速率最小而活性氧清除酶活性最高，MDA含量最低，衰老最緩慢，產量也最高。

葉斑病是花生生育后期普遍發(fā)生的一種病害[3，4]，但是關于施氮量與葉斑病發(fā)生的研究較少。本研究顯示，適宜的施氮量（75 kg/hm2）可以顯著抑制花生葉斑病的發(fā)生，而施氮量的增多或減少都會不同程度地加重葉斑病的發(fā)生。鑒于活性氧是調控葉斑病發(fā)生的重要信號分子，我們推測施氮量很可能通過調控活性氧的產生和清除來調控葉斑病的發(fā)生，從而使葉斑病的發(fā)生與花生葉片的衰老具有同一變化趨勢。但是施氮量通過何種信號途徑影響到抗氧化酶的活性、米勒反應和光呼吸的大小還需要進一步研究。

參 考 文 獻：

[1] 李向東，王曉云，張高英，等. 花生衰老的氮素調控[J]. 中國農業(yè)科學，2000， 33（5）：1-7.

[2] 郭慶，馮鍇，張曉軍，等. 斷根深度對花生根系生長分布和衰老特性及產量的影響[J]. 華北農學報，2015，30（3）：140-145.

[3] 萬書波.中國花生栽培學[M].上海：上?？茖W技術出版社，2003.

[4] Zhang S， Rcddy M S， Kokalis-Burcllc N， et al. Lack of induced systemic resistance in peanut to late leafspot disease by plant growth-promoting rhizobacteria and chemical elicitors [J]. Plant Disease， 2001，85（8）： 879-884.

[5] 王亞琴，梁承鄴，黃江康，等. 植物葉片衰老的特性、基因表達及調控[J]. 華南農業(yè)大學學報，2002，23（3）：87-90.

[6] Permar V， Singh A， Pandey V， et al. Tospo viral infection instigates necrosis and premature senescence by micro RNA controlled programmed cell death in Vigna unguiculata[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 2014（88）：77-84.

[7] Pennel R H， Lamb C. Programmed cell death in plants[J]. The Plant Cell， 1997， 9：1157-1168.

[8] Kwak S H， Lee S H. The requirements for Ca2+， protein phosphorylation， and dephosphorylation for ethylene signal transduction in Pisum sativum L.[J]. Plant Cell Physiology， 1997， 38：1142-1149.

[9] 王曉云，李向東，鄒琦. 施氮對花生葉片多胺代謝及衰老的調控作用[J]. 作物學報，2001，27（4）：442-446.

[10]Chungopast S， Duangkhet M， Tajima S. Iron-induced nitric oxide leads to an increase in the expression of ferritin during the senescence of Lotus japonicas nodules[J]. Journal of Plant Physiology，2017，208：40-46.

[11]Chisholm S T， Coaker G， Day B， et al. Host-microbe interactions： shaping the evolution of the plant immune response[J]. Cell， 2006， 124（4）：803-814.

[12]Jones J D， Dangl J L. The plant immnnesystem [J]. Nature， 2006， 444： 323-329.

[13]Grant M， Lamb C. Systemic immunity [J].Current Opinion in Plant Biology， 2006， 9（4）：414-420.

[14]Zhang Y， Li D， Zhang H， et al. Tomato histone H2B monobiquitination enzymes SlHUB1 and SLHUB2 contribute to disease resistance against Botrytis cinerea through modulating the balance between SA-and JA/ET-mediated signaling pathways[J]. BMC Plant Biology， 2015，15（1）：1-20.

[15]Li H， Wang Y， Xiao J， et al. Reduced photosynthetic dark reaction triggered by ABA application increases intercellular CO2 concentration， generates H2O2 and promotes closure of stomata in ginger leaves[J]. Environmental and Experimental Botany， 2015， 113：11-17.

[16]Fahnenstich H， Scarpeci T E， Valle E M， et al. Generation of hydrogen peroxide in chloroplasts of Arabidopsis overexpressing glycolate oxidase as an induciblesystem to study oxidative stress[J]. Plant Physiology， 2008， 148：719-729.

[17]Miyake C，Yokota A. Determination of the rate of photoreduction of O2 in the water-water cycle in watermelon leaves and enhancement of the rate by limitation of photosynthesis[J].Plant and Cell Physiology， 2000， 41：335-343.

[18]趙世杰，史國安，董新純. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國農業(yè)科學技術出版社，2002.

[19]王愛國，羅廣華，邵從本，等. 大豆種子超氧化物歧化酶的研究[J]. 植物生理學報，1983，9（1）：77-84.

[20]Nakano Y， Asada K. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific peroxidase in spinach chloroplasts[J]. Plant Cell & Physiology，1981，22：867-880.

[21]Li P， Cai R， Gao H， et al. Partitioning of excitation energy in two wheat cultivars with different grain protein contents grown under three nitrogen application in the field[J]. Physiologia Plantarum，2007，129：822-829.

[22]劉風珍，萬勇善，薛其勤. 國槐DNA導入花生栽培品種選育抗葉斑病新種質的鑒定[J].華北農學報，2010，25（6）：113-117.

[23]魏國強，朱祝軍，方學智，等. NaCl脅迫對不同品種黃瓜幼苗生長、葉綠素熒光特性和活性氧代謝的影響[J]. 中國農業(yè)科學，2004，37（11）：1754-1759.

[24]井大煒，邢尚軍，杜振宇，等. 干旱脅迫對楊樹幼苗生長、光合特性及活性氧代謝的影響[J].應用生態(tài)學報，2013，24（7）：1809-1816.

[25]王芳，楊莎，郭峰，等. 鈣對花生幼苗生長、活性氧積累和光抑制程度的影響[J]. 生態(tài)學報，2015，35（5）： 1496-1504.

[26]沈法富，喻樹迅，范術麗，等. 棉花葉片衰老過程中激素和膜脂過氧化的關系[J]. 植物生理與分子生物學學報，2003，29（6）：589-592.

[27]鄭娜，翟偉卜，張珊珊，等. 棉花成熟與衰老的影響因素及其調控策略[J]. 植物生理學報，2014，50（9）：1310-1314.