高通量測(cè)序在尸體微生物及死亡時(shí)間推斷中的應(yīng)用

2018-03-30 22:49:46符曉亮郭娟娟劉卓鷹蔡繼峰

法醫(yī)學(xué)雜志 2018年5期

符曉亮，郭娟娟，劉卓鷹，沈肖，蔡繼峰

（1.中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖南長(zhǎng)沙 410013；2.拉薩市柳梧新通站拉薩鐵路公安處，西藏拉薩850000）

法醫(yī)微生物學(xué)（forensic microbiology）通過各種微生物學(xué)分析方法推測(cè)特定微生物的來源、親緣關(guān)系或傳播途徑，針對(duì)生物恐怖襲擊與生物犯罪，為追蹤犯罪實(shí)施者提供科學(xué)依據(jù)[1]。同時(shí)，通過探索尸體腐敗過程中腐生生物的菌群結(jié)構(gòu)及其演替規(guī)律，法醫(yī)微生物學(xué)也可為死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI）推斷提供依據(jù)。PMI是指死后所經(jīng)歷的時(shí)間，即發(fā)現(xiàn)、檢查尸體距死亡發(fā)生的時(shí)間間隔[2]，準(zhǔn)確推斷PMI，在劃定偵查范圍、提供偵查線索、確定犯罪嫌疑人有無作案時(shí)間、闡明作案過程及案件性質(zhì)等方面均有重要意義。目前，通過尸冷、胃內(nèi)容物及法醫(yī)昆蟲學(xué)等方法可較為準(zhǔn)確地判斷一定范圍內(nèi)的PMI，然而，影響尸體腐敗的環(huán)境因素極為復(fù)雜，在檢案過程中，仍需將多種推斷方法結(jié)合實(shí)際案情才能獲得較為可信的PMI。尋求多元線性的PMI推斷指標(biāo)仍是當(dāng)前法醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

1 當(dāng)前PMI研究熱點(diǎn)

傳統(tǒng)的PMI推斷方法主要依賴于死后尸冷、尸斑、尸僵等尸體現(xiàn)象的觀察[3-5]，僅通過主觀經(jīng)驗(yàn)的判斷，無法對(duì)死后尸體現(xiàn)象進(jìn)行綜合性定量分析，尤其在腐敗晚期，尸體現(xiàn)象難以辨認(rèn)，使PMI的推斷更為困難。探索新的PMI推斷方法，已不只是法醫(yī)學(xué)者的研究方向，同時(shí)也得到了醫(yī)學(xué)物理學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)、昆蟲學(xué)、微生物學(xué)等多學(xué)科研究者的關(guān)注。例如，近年來，有關(guān)研究利用體液（腦脊液、心包液、玻璃體液等）中生物化學(xué)成分的變化來推斷PMI[6-9]，尤以運(yùn)用玻璃體液中鉀離子濃度的報(bào)道[10-11]較多。玻璃體因鞏膜等解剖結(jié)構(gòu)對(duì)其內(nèi)容物的保護(hù)，在腐敗早期不易受到外界污染及影響，因此，玻璃體內(nèi)容物因其狀態(tài)較為穩(wěn)定，可作為研究PMI較好的指標(biāo)。目前研究[12]結(jié)果表明，玻璃體液中鉀離子濃度與早期PMI之間有較好的相關(guān)性。DING等[13]已建立玻璃體液鉀離子濃度的熒光檢測(cè)方法，從而快速推斷PMI。而對(duì)于更晚期的PMI，不論是玻璃體還是心包、血腦屏障等，其解剖結(jié)構(gòu)依然會(huì)受到腐敗破壞，體液樣本將難以采集，對(duì)推斷干擾較大。

法醫(yī)昆蟲學(xué)（forensic entomology）作為一門特色鮮明的交叉性學(xué)科，通過對(duì)尸體內(nèi)、外或附近環(huán)境采集到的昆蟲標(biāo)本進(jìn)行檢驗(yàn)、鑒定、分類，明確昆蟲種類和地理分布、確定生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)，結(jié)合昆蟲在尸體上的群落演替規(guī)律推斷PMI[14]。雖然該方法已有效地用于實(shí)際檢案[15]，但受到昆蟲地理分布的差異，其推廣應(yīng)用還需要大量昆蟲學(xué)資料的積累。另外，不論在科學(xué)研究還是實(shí)際檢案中，培養(yǎng)更多專業(yè)的法醫(yī)昆蟲學(xué)者來對(duì)采集到的昆蟲標(biāo)本進(jìn)行鑒定、分類是必不可少的。

小分子遺傳物質(zhì)DNA[16-17]或RNA[18]相對(duì)于生物大分子而言更易于檢測(cè)，并具有較高的特異性。其降解與腐敗相關(guān)，LV等[19]研究發(fā)現(xiàn)，99%的小分子遺傳物質(zhì)隨PMI進(jìn)展呈下降趨勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外研究較多的有 18S rRNA、β-actin mRNA、microRNA[20-22]等。而在尸體腐敗的過程中，微生物的繁殖也會(huì)產(chǎn)生大量DNA和RNA，并且微生物的代謝會(huì)引起這些遺傳物質(zhì)數(shù)量的改變，無論對(duì)于血液還是組織樣本均會(huì)產(chǎn)生較大影響。尋找組織特異性更高的遺傳序列的研究仍在進(jìn)行中，利用遺傳物質(zhì)推斷腐敗尸體PMI有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

此外，還有通過氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)死后尸體代謝產(chǎn)物改變（0～48 h）[23-24]、基于磁共振波譜學(xué)分析不同PMI尸體光譜差異（0～10 h）[25]、利用掃描電鏡檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨晶體變化（3～6周）[26]以及監(jiān)測(cè)腐敗過程中尸體組織生物力學(xué)指標(biāo)改變（2～230 h）[27]等多學(xué)科交叉性研究，這些研究基于尸體本身物質(zhì)的降解或物理性改變，利用現(xiàn)代方法更深入地探索了尸體的微觀改變，具有重要的法醫(yī)學(xué)意義。

2 法醫(yī)微生物學(xué)在PMI研究中的應(yīng)用

腐敗是最重要的死后現(xiàn)象，無論尸體結(jié)構(gòu)還是物質(zhì)組成均會(huì)發(fā)生巨大改變。法醫(yī)微生物學(xué)從尸體腐敗本質(zhì)入手，探索腐敗過程中微生物的演替規(guī)律，挖掘微生物菌群結(jié)構(gòu)及代謝改變，分析優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度變化等，為PMI的推斷提供了新的突破口[28]。HEIMESAAT等[29]使用培養(yǎng)法、生物化學(xué)及免疫組織化學(xué)等方法分析了大鼠腸道菌群改變，發(fā)現(xiàn)腸球菌數(shù)量在死后72h內(nèi)增加了2～3倍。LIU等[30]通過生物發(fā)光快速檢測(cè)法檢測(cè)尸體微生物ATP含量，發(fā)現(xiàn)在大鼠肌肉、肝、脾、腎中，微生物的腐敗代謝作用使ATP含量發(fā)生改變，其規(guī)律性與PMI顯著相關(guān)。PECHAL等[31-32]使用Biolog-Eco微平板分析尸體菌群對(duì)不同碳源的代謝差異，發(fā)現(xiàn)死后尸體微生物在春季、夏季及冬季代謝率增加，而秋季降低，同時(shí)，在有昆蟲參與的腐敗過程中代謝率更高，基于Biolog-Eco微平板的尸體微生物代謝分析可為死后0～240 h的PMI推斷提供參考。HAUTHER等[33]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)擬桿菌屬（Bacteroides）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus）細(xì)菌進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)其相對(duì)豐度隨PMI的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

目前，各學(xué)科利用現(xiàn)代技術(shù)方法對(duì)尸體菌群進(jìn)行了研究[8，29-30，32]，然而，在尸體腐敗過程中挖掘微生物的變化規(guī)律，其數(shù)據(jù)的積累依賴于在不同環(huán)境中重復(fù)大量尸體實(shí)驗(yàn)以及對(duì)腐敗過程中尸體腐敗菌群整體動(dòng)態(tài)變化的系統(tǒng)分析。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法在微生物學(xué)研究中僅能進(jìn)行半定量分析，并且大量的未知菌種尚無法進(jìn)行人工培養(yǎng)，在尸體微生物的研究中覆蓋面較窄。腐敗過程中微生物的代謝規(guī)律也極為復(fù)雜，僅探索個(gè)別代謝通路不足以支撐對(duì)整個(gè)腐敗過程的了解。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)可檢測(cè)腐敗過程中某一種微生物的豐度變化，然而，實(shí)際案例中尸體所處環(huán)境復(fù)雜，腐敗菌群多樣性極高，僅對(duì)一種或幾種細(xì)菌豐度變化的了解難以解釋菌群的整體改變。隨著高通量測(cè)序（high-throughput sequencing，HTS）技術(shù)的成熟與發(fā)展，不同環(huán)境中的微生物多樣性被逐一解讀，大樣本量、高通量的測(cè)序可對(duì)復(fù)雜環(huán)境下的微生物變化進(jìn)行系統(tǒng)而動(dòng)態(tài)的分析，甚至使人們重新認(rèn)識(shí)和定義不同的微生物群落。在法醫(yī)學(xué)界，尸體微生物季節(jié)性變化[34]、特定腐敗時(shí)期尸體菌群結(jié)構(gòu)的變化[35]、水中或陸地尸體微生物多樣性研究[36-37]以及尸體骨骼、腸道等器官微生物差異[38-39]等研究，通過使用動(dòng)物尸體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或采集實(shí)際案例中人尸體微生物樣本進(jìn)行HTS分析，測(cè)定細(xì)菌、真菌等微生物特異性標(biāo)志物，挖掘不同條件下腐敗過程中微生物種類及豐度差異，分析微生物群落多樣性信息，在法醫(yī)微生物學(xué)上取得了重要成果。例如，CARTER等[34]發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)（冬、夏季）中尸體下方土壤菌群結(jié)構(gòu)差異顯著，而HYDE等[35]明確同一尸體不同腐敗時(shí)期（腫脹期前、后）菌群結(jié)構(gòu)差異同樣顯著。HYDE等[37]同時(shí)發(fā)現(xiàn)陸地尸體上，蠅類相關(guān)菌屬（Ignatzschineria和Wohlfahrtimonas）和土壤相關(guān)菌屬（Acinetobacter）常見，而 KAKIZAKI等[36]發(fā)現(xiàn)水中尸體血液和器官中含有大量藍(lán)藻細(xì)菌和硅藻，水源性的菌種在內(nèi)臟器官的出現(xiàn)還可成為生前溺死的證據(jù)。DEBRUYN等[39]發(fā)現(xiàn)，隨PMI推移，腸道菌群豐度增加，多樣性降低，而DAMANN等[38]發(fā)現(xiàn)干化期骨骼菌群含有部分腸道菌群，可推斷較晚期的PMI。不少研究機(jī)構(gòu)在“尸體農(nóng)場(chǎng)”直接利用人尸體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對(duì)腐敗微生物、嗜尸性昆蟲及尸體內(nèi)源性物質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)化研究，取得了PMI推斷突破性進(jìn)展[40]，這些研究均采用了HTS技術(shù)來探索腐敗菌群的動(dòng)態(tài)變化。近年來，隨著HTS的普及和測(cè)序成本下降，也使研究者從宏觀角度對(duì)大樣本量的尸體微生物進(jìn)行生物信息學(xué)統(tǒng)計(jì)分析成為可能。HTS可直接對(duì)一個(gè)微生物物種或群落的轉(zhuǎn)錄組和基因組全貌進(jìn)行精確分析，因此，對(duì)于尸體微生物演替規(guī)律的探索，HTS是目前最為全面、快速的技術(shù)方法之一。相對(duì)于傳統(tǒng)的生物化學(xué)鑒定法，HTS技術(shù)不需要對(duì)微生物進(jìn)行人工培養(yǎng)，而是直接對(duì)環(huán)境樣本中的16S、18S、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）等特定核苷酸序列擴(kuò)增，進(jìn)而同時(shí)對(duì)上百萬擴(kuò)增序列進(jìn)行測(cè)定，達(dá)到鑒定環(huán)境樣本中全部微生物種類及豐度的目的[41]，滿足對(duì)尸體腐敗過程中細(xì)菌、真菌以及其他真核微生物群落結(jié)構(gòu)的全面認(rèn)識(shí)。

3 HTS在人體微生物組計(jì)劃中的應(yīng)用及其對(duì)尸體微生物研究的啟示

尸體微生物HTS最早受人體微生物組計(jì)劃（Human Microbiome Project，HMP）啟發(fā)，同時(shí)，HMP的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)死后尸體初始菌群的探索具有重要參考價(jià)值。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）在 2007年啟動(dòng)了 HMP，該計(jì)劃是人類基因組計(jì)劃（Human Genome Project，HGP）的延伸，其用5年時(shí)間耗資1.5億美元完成900個(gè)人體微生物基因組測(cè)序，目標(biāo)是研究人體微生物組變化與人體健康和疾病的關(guān)系，同時(shí)也可為其他學(xué)科提供人體微生物學(xué)數(shù)據(jù)信息和技術(shù)支持[42]。HMP推動(dòng)了HTS技術(shù)在微生態(tài)研究中的發(fā)展，隨著454、Solexa、SOLiD、Illumina MiSeq、Hiseq等測(cè)序平臺(tái)的成熟和普及[43]，各研究機(jī)構(gòu)和測(cè)序公司專業(yè)化的測(cè)序服務(wù)與數(shù)據(jù)分析已全面覆蓋各種環(huán)境微生物的樣本分析，這也給法醫(yī)微生物學(xué)研究提供了極大便利。

人體中的微生物細(xì)胞數(shù)量可能達(dá)到1014量級(jí)，超過人體細(xì)胞數(shù)目的10倍以上，其編碼的基因數(shù)量可達(dá)人類基因組基因數(shù)量的100倍以上[44]。隨著HMP研究的進(jìn)展，研究者逐次詮釋了胃腸道[44]、泌尿生殖道[45]、口腔[46]、眼部[47]、鼻咽部[48]、皮膚[49]等部位的微生物群落多樣性。例如，在結(jié)腸中的微生物區(qū)系存在有800～1 000個(gè)種類，其中62%的種類為過去所未知，80%的種類無法通過現(xiàn)有的培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)[50]，這也足以顯示HTS技術(shù)將在探索人類未知微生物領(lǐng)域所帶來的巨大幫助。通過與自然環(huán)境中微生物的測(cè)序數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，人體的微生物種類僅為自然界微生物中很少的一部分，在自然界70多種細(xì)菌門類中，只有9個(gè)細(xì)菌門在人體腸道內(nèi)發(fā)現(xiàn)，并且僅厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）在腸道菌群中占主導(dǎo)地位[51]。與人類基因組不同的是，人體微生物宏基因組結(jié)構(gòu)因年齡、飲食習(xí)慣等因素而有著巨大的差異[48]。目前，不同個(gè)體間是否存在相同的核心群落，菌群在人體分布是否隨機(jī)等問題尚存在爭(zhēng)議[51]。即使在胃腸道的不同段位，微生物群落結(jié)構(gòu)也極為不同，例如，盲腸以兼性厭氧菌為主，而末端結(jié)腸卻以專性厭氧菌為主[52-53]。這些微生物在人體死亡后即為尸體的初始菌群，其是否參與尸體的腐敗進(jìn)程，與環(huán)境菌群比較，誰將會(huì)在腐敗過程中扮演主要角色，人體本身微生物群落的差異是否會(huì)影響PMI推斷的精確性，這些均是法醫(yī)微生物學(xué)必須解決的關(guān)鍵。通過HTS在HMP中的應(yīng)用，我們?nèi)媪私饬巳梭w微生物群落的復(fù)雜性。而在死亡發(fā)生后，免疫及屏障功能消失，人體及環(huán)境間的生態(tài)位將相互交融，持續(xù)而動(dòng)態(tài)改變的人體微生物群落將發(fā)生怎樣的演替，也可通過HTS進(jìn)一步探究。

4 HTS對(duì)尸體微生物菌群結(jié)構(gòu)的探索

自然環(huán)境中微生物幾乎無處不在，無論是活體還是尸體，微生物均會(huì)形成種類龐大而復(fù)雜的群落。在腐敗過程中，尸體微生物的群落結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生極大的改變，而這種時(shí)序性變化可作為一種“生物計(jì)時(shí)器”，為PMI的推斷提供依據(jù)[54]。過去數(shù)十年，微生物學(xué)家利用培養(yǎng)法[29]、微平板分析法[31-32]、磷脂脂肪酸法[55]等了解環(huán)境微生物結(jié)構(gòu)，這些方法或代價(jià)較高，或消耗大量時(shí)間成本。而HTS技術(shù)大規(guī)模用于HMP和地球微生物組計(jì)劃（Earth Microbiome Project，EMP）[48，56]，使我們能從分類學(xué)角度更為真實(shí)地了解自然界微生物群落多樣性信息，同時(shí)也為法醫(yī)學(xué)者將腐生微生物、土壤微生物等應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)相關(guān)問題提供了有效解決途徑。

陸地尸體的腐敗可分為新鮮期、腫脹期、高度腐敗期、后腐敗期以及殘骸期[57]。新鮮期為死亡至尸體開始腫脹的階段，此時(shí)蠅類開始進(jìn)入尸體，而尸體的腫脹即是體內(nèi)腐敗細(xì)菌代謝活動(dòng)所產(chǎn)生的氣體造成，尸體釋放大量腐敗氣體，吸引了大批不同種類嗜尸性昆蟲的到來和繁殖[58]。隨著昆蟲和微生物對(duì)尸體的共同侵蝕，腐敗期尸體組織被快速腐解消融[59]。在后腐敗期，隨著尸體有機(jī)質(zhì)的消耗，蠅類不復(fù)存在，皮蠹和黑水虻類是此階段的主要昆蟲[60]，而微生物群落結(jié)構(gòu)仍發(fā)生著較大的改變[61]，尸體呈現(xiàn)高度腐敗狀態(tài)，尸僵、尸斑、角膜混濁等尸體現(xiàn)象難以辨認(rèn)。最后隨著組織水分的喪失，尸體進(jìn)入殘骸期，僅存骨骼、干化的皮膚以及毛發(fā)等殘骸。此時(shí)，螨蟲是尸體上的主要節(jié)肢動(dòng)物，不論是骨骼還是皮膚均可由真菌形成霉斑，甚至是霉尸[62]。由此可見，微生物的代謝作用貫穿了尸體腐敗的整個(gè)過程，并在腐解過程中扮演著重要角色。

HTS的優(yōu)勢(shì)在于可直接對(duì)尸體上的微生物群落進(jìn)行測(cè)序，獲得樣本全部物種分類和豐度信息，并從生物信息學(xué)角度挖掘腐生微生物區(qū)系變化與PMI之間的相關(guān)性，從而解決腐敗尸體PMI推斷的難題。PECHAL等[31]利用多組豬尸體模型進(jìn)行測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)無論在某一季節(jié)還是不同季節(jié)間，尸體微生物群落均發(fā)生著演替改變，同時(shí)該研究也初步證實(shí)由微生物群落演替所帶來的遺傳標(biāo)志物數(shù)量的改變，可用于PMI的評(píng)估。HYDE等[35]通過HTS進(jìn)一步證實(shí)，在腐敗過程中人尸體不同部位的微生物群落均是從厭氧菌向需氧菌的轉(zhuǎn)變。該研究結(jié)果同時(shí)也表明，與HMP在健康人體的研究結(jié)論類似，不同尸體、尸體的不同部位以及不同時(shí)間點(diǎn)，微生物群落均存在著巨大差異。PECHAL等[63]通過HTS證實(shí)，在腐敗過程中微生物門、科的數(shù)量隨PMI存在負(fù)向線性關(guān)系。METCALF等[54]利用大鼠為尸體模型，通過HTS詮釋了尸體與其土壤間的相關(guān)性，確定了6個(gè)出現(xiàn)在尸體下方土壤的菌門，并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，推斷PMI誤差在3 d以內(nèi)。在國(guó)內(nèi)，GUO等[61]也利用HTS探索了大鼠口腔、肛門內(nèi)細(xì)菌在各腐敗階段的群落結(jié)構(gòu)，并比較了昆蟲對(duì)腐敗進(jìn)程的影響，測(cè)序結(jié)果表明，尸體口腔、直腸初始菌群差異較大，而隨著腐敗進(jìn)展，各部位菌群結(jié)構(gòu)趨于相似，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，昆蟲會(huì)加快腐敗進(jìn)程，但對(duì)尸體菌群的演替影響較小。

隨著基于HTS的尸體腐敗過程研究的開展，人們對(duì)尸體腐敗分期及腐敗現(xiàn)象也有了更深入的認(rèn)識(shí)。在尸體腫脹期，腸道內(nèi)源性厭氧菌，如厚壁菌門的乳桿菌科以及擬桿菌門的擬桿菌科在死亡發(fā)生后進(jìn)入腹腔并大量增殖，產(chǎn)生含有烴類、有機(jī)胺類、氨類的氣體，成為造成尸體腫脹的主要因素[64]。而尸體的進(jìn)一步腐敗和組織消融，則由腸源性微生物和經(jīng)血液、淋巴液傳播的微生物共同造成。尸體體表的破潰使得葉桿菌、生絲微菌、布魯桿菌等需氧菌和兼性厭氧的菌腸桿菌等成為腐敗的主力[65]。最終，環(huán)境中的真菌，如毛霉菌、白地霉、青霉菌等將轉(zhuǎn)移至殘存的尸體組織，形成霉斑、霉尸[62]。

5 HTS對(duì)尸體微生物研究的展望

尸體微生物不僅在PMI推斷中有著重要作用，在微量物證、民族、國(guó)別甚至個(gè)體識(shí)別等法醫(yī)學(xué)調(diào)查中也有著極為重要的價(jià)值[66]。雖然HTS對(duì)尸體微生物的探索有著巨大的潛力，但就目前的研究而言，其數(shù)據(jù)量還不足以建立普遍適用而精確的PMI推斷方法。一方面，微生物本身種類繁多，微生物群落間相互作用關(guān)系復(fù)雜，在不同尸體及環(huán)境中也分布不一；另一方面，受倫理學(xué)約束，尚難以大規(guī)模開展人尸體實(shí)驗(yàn)，目前HTS測(cè)序數(shù)據(jù)多基于動(dòng)物尸體實(shí)驗(yàn)。為提高數(shù)據(jù)積累效應(yīng)，尸體微生物實(shí)驗(yàn)、樣本的采集、DNA提取方法以及環(huán)境數(shù)據(jù)的記錄等標(biāo)準(zhǔn)需統(tǒng)一，以排除不同的操作者或操作方法等因素帶來的誤差，使每一個(gè)樣本都能客觀、真實(shí)地反映尸體微生物菌群結(jié)構(gòu)，最終才能綜合各條件下的尸體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。在微生物樣本的采集中，采集同一尸體不同時(shí)間點(diǎn)的微生物樣本，應(yīng)盡可能避免每次采集同一位點(diǎn)的樣本，以減少采樣對(duì)尸體菌群演替的影響；在采集尸體內(nèi)部微生物時(shí)，直接使用拭子進(jìn)行采集將破壞尸表的連續(xù)性，混淆尸體內(nèi)外菌群，干擾尸體的自然腐敗過程。因此，采用無菌注射器對(duì)胸、腹腔注射并抽吸生理鹽水更有利于尸體內(nèi)部菌群的研究。再如，在尸體實(shí)驗(yàn)的同時(shí)采集環(huán)境微生物樣本，與腐生微生物種類形成對(duì)照，可減小環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析的影響。HTS可重現(xiàn)大量無法通過培養(yǎng)法獲得的菌種。因此，在DNA提取方面對(duì)樣本的濃度、純度均有較高要求，獲得高質(zhì)量的宏基因組DNA樣本是尸體微生物研究所必需的。而尸體腐敗過程中產(chǎn)生的腐殖酸等有機(jī)酸對(duì)DNA提取以及后期PCR擴(kuò)增都有著不良影響，目前一些商業(yè)化的試劑盒已能較好地去除這類腐敗物質(zhì)，但是樣本采集之后，微生物的保存、轉(zhuǎn)運(yùn)等步驟仍會(huì)對(duì)最終數(shù)據(jù)結(jié)論產(chǎn)生影響。另外，利用HTS對(duì)尸體微生物的探索不僅僅局限于群落的演替規(guī)律，進(jìn)一步在宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)尸體微生物的探索，可揭示其參與腐敗的代謝機(jī)制，明確其代謝過程中的優(yōu)勢(shì)功能、代謝標(biāo)志，探索環(huán)境因素對(duì)尸體腐敗的影響、環(huán)境菌群與尸體菌群間的相互作用關(guān)系以及尸體腐敗對(duì)環(huán)境所造成的改變，不僅可用于PMI推斷，對(duì)案發(fā)地點(diǎn)、落水區(qū)域、拋尸時(shí)間、埋葬時(shí)間以及尸體轉(zhuǎn)移情況等具有重要參考價(jià)值。