張玲香　陳怡雯　胡晗華

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所藻類生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

微擬球藻(Nannochloropsis)是一類屬于真眼點(diǎn)藻綱(Eustigmatophyceae)、球形或近似球形的單細(xì)胞真核生物, 該屬有7個(gè)已定種(N. gaditana、N. salina、N. oculata、N. oceanica、N. australis、N.granulata和N. limnetica)[1,2], 其中僅有1個(gè)種類為淡水類型[3]。與該屬中的海洋種類相似, 淡水的湖泊微擬球藻(N. limnetica)也具有較高的光合作用效率、生物量和油脂含量, 并富含二十碳五烯酸(EPA)[4—6]。作為最有潛力的工業(yè)產(chǎn)油的模式研究類群[7], 迄今該屬多個(gè)海洋種類的全基因組序列已經(jīng)公布[8—10], 它們的遺傳轉(zhuǎn)化體系也已建立[8,9,11]。

當(dāng)前, 由于生物燃料生產(chǎn)的成本遠(yuǎn)高于化石燃料, 且微藻培養(yǎng)過程中消耗的僅與產(chǎn)出的能量相當(dāng),使得生物燃料包括微藻生物質(zhì)僅在替代減排上具有一定的優(yōu)勢(shì)[12]。將微藻生物質(zhì)生產(chǎn)與污水處理相結(jié)合, 可在減少碳排放的同時(shí)增加經(jīng)濟(jì)效益, 由此使得利用微藻作為生產(chǎn)生物質(zhì)的原料變得經(jīng)濟(jì)可行。因而, 從污水處理角度考慮, 研究利用淡水種類作為生物質(zhì)原料具有更大的優(yōu)勢(shì)。由于湖泊微擬球藻的全基因組序列沒有公布, 無(wú)法有效通過對(duì)靶基因的操作改良藻細(xì)胞的產(chǎn)油性狀。本文利用電擊轉(zhuǎn)化的方法, 將zeocin抗性基因隨機(jī)插入湖泊微擬球藻的基因組, 構(gòu)建突變體庫(kù), 通過篩選得到油含量及生長(zhǎng)顯著增加的突變株, 為快速獲取優(yōu)良目的性狀的高產(chǎn)油突變株提供了一種有效途徑。

1　材料與方法

1.1　藻株和培養(yǎng)

湖泊微擬球藻(Nannochloropsis limnetica KR 1998/3)由德國(guó)淡水生態(tài)和內(nèi)陸漁業(yè)研究所(Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, Neuglobsow) Lothar Krienitz教授提供, 經(jīng)稀釋涂平板純化后得到無(wú)菌藻落。常規(guī)培養(yǎng)使用BG11培養(yǎng)基,在溫度為22℃、光強(qiáng)約為50 μmol photons/(m2·s)、光暗周期L∶D為16∶8的條件下進(jìn)行。固體培養(yǎng)基加1.2%的瓊脂, 轉(zhuǎn)化子在加1 μg/mL zeocin的平板上篩選。從平板上挑取轉(zhuǎn)化子接種至48孔板(每孔含添加了0.5 μg zeocin的1 mL液體培養(yǎng)基)中培養(yǎng)15d后用于鑒定。經(jīng)鑒定的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接入盛120 mL BG11培養(yǎng)基(將NaNO3濃度減少到882 μmol/L)的250 mL三角瓶中靜置培養(yǎng), 用于三?；视拖鄬?duì)含量及生物量(OD730)的分析。用于總脂、三?；视图捌渲舅峤M成分析的藻細(xì)胞在通空氣的條件下培養(yǎng)。

1.2　質(zhì)粒構(gòu)建

以湖泊微擬球藻基因組DNA為模板, 用引物tub-fw (5′-atgcTCCGGAATCATATCGTGCCACA GCAGATTGG-3′, 下劃線為Aor13H I酶切位點(diǎn))和tub-rv (5′-agctTGGCCATGGTTGAGACTAGTTG GAGGGAGG-3′, 下劃線為Bal I酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到β-tubulin啟動(dòng)子區(qū)域(約570 bp)[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后純化回收, 用Aor13H I和Bal I酶切, 與經(jīng)同樣雙酶切后回收的pPha-T1載體大片段相連, 以替換其中的fcpB啟動(dòng)子片段(位于抗性基因sh ble上游), 得到質(zhì)粒pPha-T1-TUB。

1.3　電擊轉(zhuǎn)化方法

通過電擊轉(zhuǎn)化野生型湖泊微擬球藻的方法參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行, 略有修改。簡(jiǎn)述如下： 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞收集后用375 mmol/L山梨醇溶液洗滌3次并重懸, 加入3—5 μg用Sca I線性化的pPha-T1-TUB質(zhì)粒DNA, 最終懸浮液體積為200 μL, 轉(zhuǎn)至2 mm電擊杯中。電擊參數(shù)及電擊后藻細(xì)胞處理與已報(bào)道的對(duì)海洋微擬球藻種類的轉(zhuǎn)化流程相同[8,9,11]。

1.4　PCR擴(kuò)增

用CTAB法提取基因組DNA。以野生型為陰性對(duì)照, 質(zhì)粒pPha-T1-TUB為陽(yáng)性對(duì)照, 分別以tubfw和FcpAt_rv (5′-TCGAGAAAACTCATCCTGT GC-3′)為配對(duì)引物, 通過PCR的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)化子。50 μL PCR反應(yīng)體系含有25 μL 2×PCR Mix(擎科生物)、引物各100 pmol和50 ng DNA模板。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃變性5min, 接下來是34個(gè)循環(huán)反應(yīng)(94℃變性30s, 60℃復(fù)性30s, 72℃延伸1min), 最后是72℃延伸10min。

1.5　突變株生長(zhǎng)及含油量分析

相對(duì)生物量通過測(cè)定培養(yǎng)液的OD730值獲得。分別在培養(yǎng)的第10和第12天收集相同量的藻細(xì)胞,按照Bligh和Dyer[13]的方法提取總脂?？傊诒訉游?TLC)板上展層后分析三?；视偷南鄬?duì)含量[14]。薄層層析板的型號(hào)是Silica gel 60 F254 (Merk KgaA Darmstadt, Germany), 展層劑體系為正己烷∶乙醚∶乙酸(70∶30∶1, v/v/v)。展層結(jié)束后層析板置于含有適量顆粒碘的燒杯中顯色5—10min[15]。標(biāo)準(zhǔn)品三油酸甘油酯(Glyceryl trioleate)購(gòu)自Sigma公司。采用稱重法確定總脂和用薄層層析板回收的三?；视偷慕^對(duì)含量。

1.6　脂肪酸組成分析

總脂和三?；视图柞セ笥谜和檩腿?次,合并有機(jī)相, 取1 μL用Ultra Trace氣相色譜分析儀(Thermo Scientific, United States)進(jìn)行脂肪酸組成分析。用面積歸一法計(jì)算各脂肪酸組分的相對(duì)百分比。

2　結(jié)果與討論

2.1　湖泊微擬球藻突變體庫(kù)的構(gòu)建

自2011年Killian等[16]利用電擊的方法在海洋微擬球藻(N. oceanica)中建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系以來, 該屬中另外4個(gè)海洋種類的遺傳轉(zhuǎn)化方法也已被陸續(xù)報(bào)道[8,11]。南方微擬球藻(N. australis)是最近才被鑒定的一個(gè)新種, 與海洋微擬球藻有非常近的親緣關(guān)系, 因而兩者的轉(zhuǎn)化程序應(yīng)該相同。我們采用同樣的轉(zhuǎn)化策略, 構(gòu)建帶有zeocin抗性基因的質(zhì)粒, 由湖泊微擬球藻β-tubulin基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá), 轉(zhuǎn)化后可篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。初步計(jì)算轉(zhuǎn)化效率僅為海洋種類的約1%, 因而轉(zhuǎn)化方法尚待進(jìn)一步優(yōu)化。微擬球藻屬的種類具有厚的細(xì)胞壁, 電轉(zhuǎn)化需要很高的電場(chǎng)強(qiáng)度(通常為11000—12000 V/cm)[16], 而對(duì)淡水種類而言, 由于滲透壓等因素的不同, 可能需要對(duì)電場(chǎng)強(qiáng)度等電擊參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

從平板上挑取的轉(zhuǎn)化子接入zeocin濃度為0.5 μg/mL的BG11培養(yǎng)基中培養(yǎng), 以便進(jìn)一步篩選。連續(xù)傳代6個(gè)月后, 我們共獲得了約300個(gè)可在含有抗性的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子, 將這些作為突變子庫(kù), 用于篩選具有優(yōu)良產(chǎn)油性狀的突變株。從中隨機(jī)選取30個(gè)突變株, 以其基因組DNA為模板, 以tub-fw和FcpAt_rv為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢查zeocin抗性基因及終止子序列片段(共約1.2 kb)。結(jié)果表明, 所有30個(gè)抗性藻落均可擴(kuò)增出目的片段, 得到了可穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子。

2.2　高含油突變株的篩選

由于BG11培養(yǎng)基中的氮濃度高達(dá)17.6 mmol/L,培養(yǎng)早期收獲檢測(cè)到的湖泊微擬球藻僅含很低的三酰基甘油[17]。將起始硝酸鹽的濃度降低至882 μmol/L (與海水培養(yǎng)基f/2中的氮濃度一致), 培養(yǎng)湖泊微擬球藻, 淡水的微擬球藻三?；视秃颗c海洋的微擬球藻相當(dāng)[18]。對(duì)上述隨機(jī)挑選的30個(gè)突變株與野生型在氮濃度為882 μmol/L的條件下培養(yǎng), 利用薄層層析比較三酰基甘油含量, 培養(yǎng)10d的結(jié)果顯示共有16個(gè)突變株的三?；视秃扛哂谝吧? 培養(yǎng)12d共有14個(gè)突變株的三酰基甘油含量高于野生型, 10d和12d檢測(cè)的油含量均高于野生型的突變株有11株, 占比為37%。其中突變株G5的油含量在12 d比野生型增加超過50% (圖 1)。

大量的研究顯示藻細(xì)胞油脂積累與生長(zhǎng)之間不具有同步性[19]。各種脅迫(尤其是氮限制)可導(dǎo)致TAG積累, 但嚴(yán)重阻礙藻的生長(zhǎng)。利用基因工程手段提高細(xì)胞油脂含量通常也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到影響。為獲得生長(zhǎng)不受影響的高含油突變株, 我們進(jìn)一步比較了野生型與突變株的生長(zhǎng)情況。如圖 2所示, 9個(gè)突變株的相對(duì)生物量高于野生型, 其余21株的生長(zhǎng)均受到不同程度抑制, 其中K36的生物量?jī)H為野生型的約40%。

綜合油含量及生長(zhǎng)的結(jié)果, 9個(gè)生長(zhǎng)優(yōu)于野生型的突變株中, K14、K24、K26、K29和G5等5株的油含量也高于野生型, 占所有分析突變株的約17%。K26和G5兩個(gè)突變株的相對(duì)生物量分別比野生型增加約5%—10%和3%—6%。

2.3　兩個(gè)高含油突變株的產(chǎn)油特性

將上述2個(gè)生長(zhǎng)及油含量?jī)?yōu)于野生型的突變株K26和G5在通空氣的條件下培養(yǎng)7d, 收獲藻細(xì)胞用于分析總脂、三?；视秃考捌渲舅峤M成。表 1顯示, 在本研究條件下培養(yǎng)的湖泊微擬球藻總脂的含量為22%—26%, 略低于海洋微擬球藻的總脂含量[18]。2個(gè)突變株的三酰基甘油均高于野生型,含量占總脂的一半左右。湖泊微擬球藻總脂中的脂肪酸以C16∶0 、C16∶1和C20∶5為主, 三者之和占總脂肪酸的70%以上。另外2種含量較高的脂肪酸為C14∶0和C18∶1, 尤其是在三酰基甘油中所占的比例較高。與野生型比, 突變株總脂的C20∶5較低, 特別是突變株G5中C20∶5的含量?jī)H為野生型的約40%, 相應(yīng)地C18∶1的含量增加了一倍多。突變株中豐富的短鏈脂肪酸組成特性符合作為生物柴油原料的標(biāo)準(zhǔn)。

通過生理脅迫或?qū)ο鄳?yīng)靶基因的遺傳操作均可促進(jìn)微藻細(xì)胞油脂的積累。然而, 前者嚴(yán)重抑制細(xì)胞的生長(zhǎng), 后者通常也會(huì)影響藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于生長(zhǎng)和油脂積累的不同步性, 在不影響或是增加細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)提高細(xì)胞油脂積累可能涉及多個(gè)基因的協(xié)同作用。因而, 有目的地通過基因工程手段對(duì)產(chǎn)油性狀進(jìn)行改良不但需要長(zhǎng)時(shí)間的多次嘗試, 也可能需要多個(gè)抗性篩選標(biāo)記。通過隨機(jī)插入突變, 從大量突變子庫(kù)中篩選生長(zhǎng)和油含量均顯著增加的方法是切實(shí)可行的有效手段[20,21]。由于外源基因多拷貝的隨機(jī)插入, 盡管不易確定影響性狀的目的基因, 但至少可以獲得對(duì)目標(biāo)性狀顯著改良的突變株。通過本研究建立的突變株篩選方法, 可以快速獲得具有優(yōu)良產(chǎn)油性狀的藻株。進(jìn)一步, 通過對(duì)插入位點(diǎn)的深入分析還可以確定影響生長(zhǎng)及油脂合成的相關(guān)基因, 闡明藻細(xì)胞的油脂代謝機(jī)理,為更有效地改造湖泊微擬球藻產(chǎn)油性狀提供理論支撐。

圖 1　野生型和突變株培養(yǎng)10d(上)和12d(下)后提取總脂的硅膠板薄層層析圖Fig. 1　Lipid composition and content in mutants and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica at day 10 and 12

圖 2　野生型和突變株培養(yǎng)10d和12d后相對(duì)生物量(OD730)的比較Fig. 2　The relative biomass (OD730) in mutants and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica at day 10 and 12

表 1　野生型湖泊微擬球藻與富油突變株K26和G5的總脂與三酰基甘油脂肪酸組成及含量Tab. 1　Fatty acid composition (mol %) in total lipids and triacylglycerol (TAG) of mutants (strains K26 and G5) and wild type (WT) of Nannochloropsis limnetica

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