外泌體在腫瘤治療中的應(yīng)用研究進展

賈剛，唐秋莎

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理與病理生理學(xué)系，江蘇 南京　210009)

惡性腫瘤在全世界范圍內(nèi)是威脅人類健康的主要殺手之一，因此如何更好地預(yù)防、治療腫瘤一直是人們研究的熱點。研究表明，外泌體作為重要的細(xì)胞間通訊介質(zhì)在包括心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮重要作用，而腫瘤細(xì)胞較正常細(xì)胞能分泌更多的外泌體[1]，提示其與腫瘤的關(guān)系可能更為密切。越來越多的證據(jù)[2]表明，外泌體在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等各個過程扮演重要角色。這種角色是雙重的[3]：一方面，外泌體可以作為“幫兇”促進腫瘤惡性生物學(xué)行為的發(fā)展進程；另一方面，外泌體也可以通過介導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)、促進腫瘤細(xì)胞的凋亡等機制發(fā)揮抑制腫瘤生長的作用。同時，作為一種天然的優(yōu)良載體，外泌體可以被改造成靶向性藥物載體，協(xié)助抗腫瘤藥物或生物大分子發(fā)揮抗腫瘤作用，從而達(dá)到高效低毒殺傷腫瘤的效果。深入研究外泌體和腫瘤的相互作用機制，將為人們利用外泌體治療腫瘤提供理論依據(jù)和新的思路。

1　外泌體概述

1.1　外泌體的發(fā)現(xiàn)和形成過程

1981年，Trams[4]等發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌的囊泡具有胞外酶活性，第一次提出了外泌體的概念，1987年，Johnstone[5]等從體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中正式分離出這種小囊泡并命名為外泌體。隨著人們研究的深入，現(xiàn)在認(rèn)為幾乎所有的活細(xì)胞都可以分泌外泌體，并廣泛分布于人體各種體液中[6]。外泌體的具體形成機制目前仍然不是十分清楚，但現(xiàn)有研究認(rèn)為，其形成過程與另一類細(xì)胞分泌的微囊泡小體——微泡(microvesicle，MV)不同[7]，外泌體是在細(xì)胞內(nèi)形成的，細(xì)胞通過內(nèi)吞作用產(chǎn)生小囊泡，小囊泡融合形成早期核內(nèi)體(early endosome)，并逐漸變?yōu)橥砥诤藘?nèi)體(late endosome)。隨著胞質(zhì)內(nèi)microRNA、酶分子、熱休克蛋白等一些“貨物”的進入，晚期核內(nèi)體會產(chǎn)生很多小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)，并逐漸演變成多泡體(multivesicular body，MVB)。最終這些多泡體被釋放到胞外，形成大小更均一的微囊泡，即為外泌體。

1.2　外泌體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性

透射電子顯微鏡下外泌體多為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形，在體液中通常為球形結(jié)構(gòu)，直徑約為30～100 nm，在蔗糖密度梯度溶液中密度范圍為1.13～1.19 g·ml-1[8]，其密度與細(xì)胞來源有關(guān)，隨外泌體內(nèi)蛋白含量而變化。外泌體的質(zhì)膜含有豐富的膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、糖脂及含長飽和脂肪?；母视土字?。外泌體也含有與其來源細(xì)胞相類似的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及編碼或非編碼RNA等生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞之間物質(zhì)交換過程中具有重要作用。

2　外泌體的提取方法

外泌體的提取有多種方法，每種方法各有優(yōu)缺點，目前仍沒有一種方法能做到兼顧外泌體的含量、純度及生物活性。

2.1　離心法

是外泌體提取的常用方法，得到的外泌體量多，但是純度不足，而且高速離心下的離心力可引起外泌體結(jié)構(gòu)及大小的改變。按離心方式不同可以分為：差速超速離心法、密度梯度離心法、超濾離心法。

差速超速離心法是最經(jīng)典也是目前仍然很常用的外泌體提取方法，離心時，低速、高速交替進行，最終得到大小相近的囊泡顆粒，操作相對簡單，但操作過程比較費時，得到的外泌體純度也難以保證，此外，重復(fù)離心操作還有可能對外泌體造成破壞，影響其質(zhì)量[13]。

超濾離心法是一種較新的提取方法，利用不同相對截留分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜對樣品進行選擇性分離，即可獲得外泌體，這種方法操作簡單、高效，對外泌體的生物活性影響較小，但得到的外泌體純度不理想。

蔗糖密度梯度離心法是一種區(qū)帶分離法，在高達(dá)100 000 g的離心力作用下使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，樣品中的外泌體將在1.13～1.19 g·ml-1的密度范圍富集，得到富含外泌體的沉積物。此種方法提取到的外泌體純度較高，但前期準(zhǔn)備工作繁雜、耗時。

2.2　免疫磁珠法

其原理在于外泌體表面有其特異性標(biāo)記物(如CD63、CD9)[2]，利用包被有標(biāo)記物單克隆抗體的球型磁性微粒特異性結(jié)合外泌體，在磁力作用下分離得到外泌體。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整性，特異性高、操作簡便，且不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是反應(yīng)的溶液及抗體磁珠可能會影響外泌體的生物活性，要根據(jù)下游的實驗進行選擇，應(yīng)用受限。

聚乙二醇(PEG)可與疏水性蛋白和脂質(zhì)分子結(jié)合共沉淀，早先應(yīng)用于從血清等樣本中收集病毒，現(xiàn)在也被用來沉淀外泌體，其原理可能與競爭性結(jié)合游離水分子有關(guān)。利用PEG沉淀外泌體存在純度和回收率低，雜蛋白較多(假陽性)的問題，且顆粒大小不均一，產(chǎn)生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫-20等化學(xué)添加物將會破壞外泌體等，因此影響其應(yīng)用。

2.4　試劑盒提取法

是近幾年來新發(fā)展的一種方法，目前市場上已出現(xiàn)各種商業(yè)化的外泌體提取試劑盒，有的是通過特殊設(shè)計的過濾器過濾掉雜質(zhì)成分，有的則采用空間排阻色譜法進行分離純化，也有的利用化合物沉淀法將外泌體沉淀出來。試劑盒不需要特殊設(shè)備，隨著產(chǎn)品不斷更新?lián)Q代，提取效率和純化效果逐漸提高，因而逐漸取代超速離心法并推廣開來。

2.5　色譜法

該法是利用凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進行分離的分析方法，利用該法也可對外泌體進行分離，得到的外泌體在電鏡下大小更均一，純度也較高，但需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不廣泛。

3　外泌體在腫瘤治療中的應(yīng)用研究

外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等物質(zhì)，參與多種生理、病理過程，同時還具有低免疫原性和較好的包載能力，可以成為一種理想的治療載體[14]，這都提示了其在疾病治療中的潛在價值。外泌體在腫瘤治療中的作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：(1) 通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的免疫反應(yīng)，影響腫瘤的生長；(2) 作為載體，攜帶治療藥物或生物活性物質(zhì)到達(dá)腫瘤組織，發(fā)揮抑瘤作用；(3) 直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

3.1　以外泌體為基礎(chǔ)的免疫治療

3.2　外泌體作為抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用

與細(xì)胞載體相比，外泌體也有明顯優(yōu)勢[27]：(1) 外泌體納米級別的粒徑更有利于其在體內(nèi)的分布，也更有利于到達(dá)靶細(xì)胞并通過膜融合或內(nèi)吞作用進入細(xì)胞內(nèi)釋藥，從而最大程度地發(fā)揮藥物作用；(2) 靜脈給藥發(fā)生血管栓塞和微血管損傷的風(fēng)險大大降低；(3) 性質(zhì)穩(wěn)定，更易于保存，還可以人為地改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量[20,28]；(4) 更安全，載體應(yīng)用沒有異倍體性風(fēng)險；(5) 可根據(jù)需要調(diào)節(jié)用量，不會像細(xì)胞載體那樣增殖不受控制，而影響療效帶來更多的不良反應(yīng)[29]。

3.3　外泌體直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡

4　外泌體應(yīng)用于腫瘤治療中的不足之處

如前所述，外泌體在腫瘤治療中有諸多的獨特優(yōu)勢，然而隨著越來越多研究的開展和深入，也發(fā)現(xiàn)其存在的一些缺點和局限性。首先，無論哪種治療作用，都要依賴于一定數(shù)量和質(zhì)量的外泌體，而外泌體的獲取，目前尚沒有一種方法能夠兼顧產(chǎn)量、純度和生物活性[36]。其次，現(xiàn)階段人們對外泌體性質(zhì)和其對機體生理、病理狀態(tài)的影響還存在很多認(rèn)識上的不足，所以在活體應(yīng)用時，其長期作用和安全性究竟如何，尚有待于進一步的觀察、評價。再者，必須認(rèn)識到外泌體是一把雙刃劍，不同細(xì)胞來源和不同條件下產(chǎn)生的外泌體，對腫瘤的影響有可能是截然相反的，應(yīng)用時要進行必要的篩選和誘導(dǎo)。最后，外泌體作為載體時，目前對外泌體載藥的方法和產(chǎn)率的控制還不很成熟，包載后對外泌體自身會產(chǎn)生哪些影響也不十分明確，不同實驗室之間在包載方式及后續(xù)檢測上還沒有達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化。活體應(yīng)用時，為了提高治療的靶向性，需要進行靶向性修飾，實現(xiàn)靶向性的方法還需要進一步探索、研究。

5　結(jié)　　語

外泌體已經(jīng)為腫瘤治療開辟了一個新的視角，同時也引來了一些的困惑和爭議。作為免疫調(diào)節(jié)劑，外泌體可以替代源細(xì)胞發(fā)揮抗原呈遞作用，并可成為腫瘤疫苗的來源，同時外泌體也可以幫助腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生、維持免疫逃逸。作為載體，外泌體可以攜帶多種可用于腫瘤診斷和治療的納米材料、生物大分子等，經(jīng)過適當(dāng)膜修飾，還能夠提高原有藥物的抑瘤效果，但是活體應(yīng)用時，在包載方法、靶向性以及長期療效和不良反應(yīng)方面還需要進一步研究、觀察。作為凋亡的調(diào)節(jié)劑，雖然目前的研究結(jié)果不完全一致，但已有明確證據(jù)證明在適當(dāng)?shù)臈l件下，外泌體可明顯促進腫瘤細(xì)胞的凋亡，發(fā)揮抑瘤效果。不過這種效果可能跟外泌體的產(chǎn)量和濃度以及腫瘤細(xì)胞的分化狀態(tài)有關(guān)?？傊饷隗w在腫瘤治療中的應(yīng)用研究，還存在一些不一致甚至是相互矛盾的地方，有很多新的領(lǐng)域需要探索，這正是外泌體自身的特點和目前對外泌體的認(rèn)識不足造成的。對其性質(zhì)和作用機制進行更為深入地研究，將為腫瘤的治療帶來更為光明的前景。

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