王玉紅 尹曉雪 丁明媚 付勝利 陳 萌 郭 政,2 葉劍敏,2

?

尼羅羅非魚基因克隆及表達(dá)分析

王玉紅1尹曉雪1丁明媚1付勝利1陳 萌1郭 政1,2葉劍敏1,2①

(1. 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631；2. 廣東省水產(chǎn)優(yōu)質(zhì)環(huán)保養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510631)

為了了解尼羅羅非魚()細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子()的基因序列特征及其在無乳鏈球菌()應(yīng)激和在B細(xì)胞分化中的作用，應(yīng)用RACE克隆技術(shù)獲得的基因全長1380 bp，包括開放閱讀框ORF為1155 bp，5￠端非編碼區(qū)(5￠UTR)長127 bp，3￠端非編碼區(qū)(3'UTR)長98 bp。序列分析推測(cè)該基因編碼384個(gè)氨基酸，分子量為41.32 kDa，理論等電點(diǎn)為4.36。同源性分析顯示，基因與其他魚類的聚為一支，其中，與南極鱈()相似性最高。熒光定量PCR及Western-blot結(jié)果顯示，OnXbp1-S在各組織中均有表達(dá)，mRNA水平上在肝臟中表達(dá)量最高，蛋白水平上在胸腺中表達(dá)量最高，而在肌肉中表達(dá)量最低。無乳鏈球菌應(yīng)激后，基因在肝臟和脾臟中的表達(dá)趨勢(shì)相似，均在應(yīng)激期間出現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)，在192 h出現(xiàn)峰值。另外，免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，因子在不同分化程度B細(xì)胞亞類中的表達(dá)呈現(xiàn)差異，在成熟B細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在未成熟B細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。研究結(jié)果表明，參與尼羅羅非魚對(duì)無乳鏈球菌的免疫防御，和在B細(xì)胞分化中起作用。本研究將為進(jìn)一步研究因子應(yīng)答病原菌侵染的機(jī)理及促進(jìn)B細(xì)胞分化機(jī)制提供理論依據(jù)。

尼羅羅非魚；；基因克?。唤M織表達(dá)；無乳鏈球菌

X盒結(jié)合蛋白1(Xbp1, X-box binding protein 1)是一種重要的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子，與人體許多機(jī)能密切相關(guān)，如B細(xì)胞、肝細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的發(fā)育分化，心肌細(xì)胞的存活及肝脂肪的調(diào)節(jié)等(Wang, 2008; Iwakoshi, 2007; Tellier, 2016)。Xbp1為堿性亮氨酸拉鏈蛋白，有剪切型Xbp1(Xbp1 spliced, Xbp1-S)和未剪切型Xbp1(Xbp1 unspliced, Xbp1-U)兩種類型。兩種不同剪切類型的Xbp1具有不同的轉(zhuǎn)錄活性，其中，Xbp1-S的轉(zhuǎn)錄活性明顯高于Xbp1-U (Zhou, 2008)。Xbp1-S是CREB/ATF蛋白家族的成員，最早由Liou等(1990)在研究人類B細(xì)胞的時(shí)候發(fā)現(xiàn)的一種轉(zhuǎn)錄因子。隨后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)的研究發(fā)現(xiàn)不同于Xbp1-U的另一種剪切形式Xbp1-S，是由Ⅰ型跨膜蛋白激酶核酸內(nèi)切酶(TypeⅠ transmembrane protein kinase, ⅠRE1)剪切Xbp1-U的mRNA所產(chǎn)生(Yoshida, 2001; Calfon, 2002)。Xbp1參與B細(xì)胞向漿細(xì)胞的分化，是經(jīng)過調(diào)控IL-6的生成并通過進(jìn)一步非折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答(Unfolded protein response, UPR)途徑所促進(jìn)的(Calfon, 2002; Iwakoshi, 2003)。在哺乳動(dòng)物中，Xbp1的異?；顒?dòng)也可以促進(jìn)惡性漿細(xì)胞的分化(Reimold, 2001)。作為剪切后的Xbp1-S具有更高的轉(zhuǎn)錄活性，能進(jìn)去細(xì)胞核調(diào)節(jié)未折疊的蛋白質(zhì)反應(yīng)。

Xbp1-S是一種高度保守的蛋白，從低等酵母到高等哺乳動(dòng)物中均有存在(Liou, 1990)。在硬骨魚中，Xbp1-S的研究逐步增加，現(xiàn)已報(bào)道的魚類包括斑馬魚()(Hu, 2007; Bennett, 2007)、鯉魚()(彭少卿等, 2013)、紅鰭東方鲀()(Ohtani, 2006)、虹鱒()(Barr, 2011)和大西洋鮭()(Leong, 2010)等。Hu等(2007)在斑馬魚的胚胎細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)UPR應(yīng)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，Xbp1可以通過IGF1/Akt激活凋亡信號(hào)發(fā)揮抑制作用；Barr等(2011)利用Xbp1作為標(biāo)記分子進(jìn)行鑒定不同分化程度的B細(xì)胞亞類；Zwollo等(2005、2008)利用Xbp1以及Pax-5等轉(zhuǎn)錄因子對(duì)虹鱒魚的腎臟進(jìn)行分區(qū)，并進(jìn)一步揭示虹鱒魚B細(xì)胞的發(fā)育分化與Xbp1的表達(dá)相關(guān)。但關(guān)于尼羅羅非魚Xbp1-S的研究還未見相關(guān)報(bào)道。另外，與哺乳動(dòng)物相比，有關(guān)硬骨魚Xbp1-S的研究還處于起步階段，其在宿主應(yīng)對(duì)病原侵染中的作用尚待進(jìn)一步明確。

羅非魚是聯(lián)合國推薦養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。我國是最大的羅非魚生產(chǎn)國，近些年，因養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大、高密度養(yǎng)殖、水體污染等，導(dǎo)致羅非魚魚病大規(guī)模暴發(fā)，如鏈球菌病，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失 (盧邁新, 2010)。本研究選用尼羅羅非魚為實(shí)驗(yàn)魚，旨在克隆基因cDNA全長并序列比對(duì)，從基因和蛋白水平上分析無乳鏈球菌應(yīng)激脅迫后尼羅羅非魚各組織的時(shí)空表達(dá)模式，并查明該因子在不同分化程度B細(xì)胞亞類中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚在防御鏈球菌侵染中所起作用及其調(diào)控B細(xì)胞發(fā)育分化機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚購自廣東省漁業(yè)種質(zhì)保護(hù)基地，健康尼羅羅非魚的體重為(200±10) g，體長為(13±2) cm。養(yǎng)殖溫度為(29±1)℃，早晚投喂飼料，加氣泵供氧，飼養(yǎng)14 d使其充分適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，觀察魚體外觀和活動(dòng)能力，確認(rèn)完全健康后用于實(shí)驗(yàn)。無乳鏈球菌菌株為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。PCR反應(yīng)體系所用試劑、pMD-18T Vector、限制性內(nèi)切酶、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript?RTreagent kit with gDNA eraser)和熒光定量試劑盒(SYBRPremix ExTM)均購自TaKaRa公司；DH5α感受態(tài)、BL21(DE3)感受態(tài)膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒(TIANprep mini plasmid kit)購自TIANGEN公司；pET32a(+) Vector由本實(shí)驗(yàn)室保存，SMARTTMRACE cDNA amplification kit購自BD Biosciences Clontech公司。Trizol、2′Prime Mix、Ex、10′Buffer、dNTP、pMD 18-T Vector、Solution I和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司。氨芐青霉素、氯仿和異丙醇等試劑購自廣州化學(xué)試劑公司，其余實(shí)驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物(表1)由華大基因科技服務(wù)有限公司合成。

表1 基因克隆和表達(dá)所用的引物

Tab.1 Primers used in the cloning and expression

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成 采用Trizol(Invitrogen)法進(jìn)行總RNA提取。取健康尼羅羅非魚頭腎，用勻漿器充分研磨，并按照Trizol試劑的使用說明書提取總RNA，RNA完整性和純度用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用微量分光光度計(jì)NANO2000檢測(cè)其濃度，-80℃保存。利用普通的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，使用SMARTTMRACE cDNA amplification kit將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成5￠、3￠-RACE cDNA模板(Yao, 2016)。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后對(duì)模板進(jìn)行有效性的檢測(cè)，以β-actin作為內(nèi)參基因進(jìn)行PCR鑒定，合格后–20℃保存。

1.2.2 尼羅羅非魚的基因全長cDNA的克隆和測(cè)序 在NCBI搜索尼羅羅非魚的基因，根據(jù)預(yù)測(cè)序列(XM_013276886.1)，應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物Xbp1-F1和Xbp1-R1設(shè)計(jì)(表1)，以尼羅羅非魚頭腎cDNA為模板，以Xbp1-F1和Xbp1-R1為引物進(jìn)行的cDNA的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的體系為25 μl，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；58.0℃退火30 s；72℃延伸1.0 min；30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov)比對(duì)，獲得尼羅羅非魚的cDNA序列。

1.2.3 尼羅羅非魚的基因3￠和5￠-RACE擴(kuò)增

根據(jù)獲得的的CDS序列，設(shè)計(jì)的5￠-RACE PCR和3￠-RACE PCR的引物Xbp1-F2、Xbp1-F3、Xbp1-R2和Xbp1-R3(表1)，采用巢式PCR方法進(jìn)行3￠和5￠-RACE的擴(kuò)增，先分別用Xbp1-F2、Xbp1-R2和UPM混合引物(混合濃度參照試劑盒說明書)進(jìn)行首輪擴(kuò)增，然后利用首輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第二輪模板，再分別用Xbp1-F3、Xbp1-R3和NUP為引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，全長克隆采用20 μl PCR反應(yīng)體系(Yao, 2016)。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；68℃退火30 s；72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往北京六合華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與的cDNA序列比對(duì)結(jié)果見圖1，找出起始密碼子和polyA加尾信號(hào)。

1.2.4 尼羅羅非魚的序列分析 用DNAStar軟件中的SeqMan程序去克隆載體，將3￠、5￠測(cè)序結(jié)果結(jié)合CDS序列進(jìn)行拼接分析，進(jìn)一步確認(rèn)擴(kuò)增獲得CDS的全長。用NCBI網(wǎng)站的BLAST程序進(jìn)行編碼蛋白序列的堿基同源性分析；用Bioedit軟件將尼羅羅非魚與其他魚類的Xbp1-S的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)；應(yīng)用MEGA 6.0軟件，采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap重復(fù)1000次計(jì)算各分支的置信度。蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)使用ProtParam軟件(http://web.expasy.org/protparam/)，使用NCBI網(wǎng)站保守結(jié)構(gòu)域(CDD)數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.2.5 尼羅羅非魚Xbp1-S多克隆抗體的制備 根據(jù)Xbp1-S的CDS序列的鋅指結(jié)構(gòu)，選取包含鋅指結(jié)構(gòu)的起始密碼子甲硫氨酸開始的前504 bp的堿基進(jìn)行原核表達(dá)分析，構(gòu)建pET32A-XBP1的蛋白表達(dá)載體，并導(dǎo)入到BL21中特異性表達(dá)出約40 kDa的目的片段(包含pPET32A載體本身的分子量)。并進(jìn)一步進(jìn)行蛋白的大批量表達(dá)和純化，獲得目的蛋白，將純化后的重組蛋白濃縮后與弗氏佐劑(Sigma)混合，腹腔免疫小鼠(BALB/c, 8周)，2周免疫1次，連續(xù)免疫4次，首次免疫使用弗氏完全佐劑，再次免疫使用弗氏不完全佐劑，每次免疫蛋白用量為50 μg/只。尾部靜脈取血，獲得抗血清后檢測(cè)抗性，通過直接ELISA檢測(cè)其效價(jià)。在第4次免疫后4 d (達(dá)到抗體效價(jià)最高)，進(jìn)行尾部靜脈取血，獲得抗血清，用于蛋白的檢測(cè)和免疫組化等實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 尼羅羅非魚Xbp1-S組織表達(dá) 采用熒光定量PCR的方法檢測(cè)Xbp1在mRNA水平上在健康羅非魚各組織中的表達(dá)量，用Western-blot的方法檢測(cè)Xbp1蛋白在各組織中的分布。取健康的3尾尼羅羅非魚，取頭腎、后腎、脾臟、皮膚、鰓、腸、胸腺、肝臟和肌肉組織，用液氮速凍后置于–80℃保存。并進(jìn)行各組織RNA及組織蛋白的提取后進(jìn)行RT-PCR和Western-blot組織蛋白的檢測(cè)。用于RT-PCR檢測(cè)尼羅羅非魚不同組織中表達(dá)的引物見表1。反應(yīng)條件：95℃ 3 min；95℃ 1 min；60℃ 30 s；72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次，根據(jù)t(Threshold cycles)值(15＜t＜35)，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，利用公式2-ΔCt得出每個(gè)樣本基因的相對(duì)表達(dá)值。

1.2.7 無乳鏈球菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn) 取60尾健康尼羅羅非魚隨機(jī)分成2組，即應(yīng)激組和對(duì)照組。應(yīng)激組腹腔分別注射100 μl濃度為5×105CFU/μl的無乳鏈球菌(Tellez-Ba?uelos, 2009; Gan, 2015)；對(duì)照組腹腔注射100 μl無菌PBS，注射0、6、24、48、192、264 h后，分別在應(yīng)激組和對(duì)照組隨機(jī)取3尾魚，取各組織用液氮速凍后保存于–80℃冰箱，用于后續(xù)各組織基因的RT-PCR分析檢測(cè)。RT-PCR擴(kuò)增體系為20 μl，試劑添加按照SYBR?Premix ExTMⅡ說明書進(jìn)行。反應(yīng)程序：95℃3 min；95℃ 1 min；60℃ 30 s；72℃30 s，35個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt方法對(duì)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，顯著性用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析并用SigmaPlot 10.0作圖。

1.2.8 Xbp1免疫組化 選取健康尼羅羅非魚的頭腎白細(xì)胞用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。頭腎白細(xì)胞的分離采用Percoll密度梯度分離法進(jìn)行，根據(jù)尼羅羅非魚B細(xì)胞的比重，分別配制Percoll 40、50、60及70試劑，疊加后配成Percoll密度梯度分離液，從而分離開發(fā)育分化程度不同的B細(xì)胞亞類。在超凈工作臺(tái)取健康尼羅羅非魚的頭腎并加入3 ml 1640細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行充分研磨，吸取上清液，去除大的組織塊，備用。根據(jù)使用說明書，首先把Percoll(GE Healthcare)原液用10′PBS(NaH2PO4·2H2O 2.286 g，Na2HPO4·12H2O 29.14 g，NaCl 87.75 g) 9∶1稀釋為備用Percoll儲(chǔ)存液，然后用1′PBS進(jìn)一步配成Percoll 40、50、60和70，進(jìn)行疊加各層分離B細(xì)胞。把分離的細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)胞涂片后進(jìn)行采用EnVisionTM免疫組織化學(xué)二步法，主要步驟包括：切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫苯，去離子水水化；3%過氧化氫溶液室溫避光孵育25 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；3% BSA室溫封閉30 min后滴加一抗，4℃孵育過夜；熒光二抗室溫孵育30 min；熒光顯微鏡鏡檢，陽性細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的熒光，并對(duì)圖像采集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 OnXbp1-S基因cDNA全長克隆及序列分析

根據(jù)已經(jīng)獲得的ORF序列，進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性RACE引物Xbp1-F2、Xbp1-F3及Xbp1-R2和Xbp1-R3 (表1)。Xbp1-F2和Xbp1-R2與通用引物UPM以及Xbp1-F3和Xbp1-R3與通用引物NUP分別配對(duì)，進(jìn)行3￠-RACE和5￠-RACE擴(kuò)增(Yao, 2016)，所得產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序拼接后，獲得尼羅羅非魚基因全長cDNA序列為1155 bp，3￠端非編碼區(qū)(3'UTR)長98 bp，5￠端非編碼區(qū)(5￠UTR)長127 bp，3￠端含有polyA尾以及多聚腺苷酸AATAA加尾信號(hào)(圖1)。氨基酸序列分析可知，基因可以編碼384個(gè)氨基酸殘基，其推導(dǎo)的分子量為41.32 kDa，理論等電點(diǎn)為4.36。由蛋白質(zhì)的功能預(yù)測(cè)可知，含有174 bp的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域(圖1下劃線部分)，該區(qū)域是比較保守的蛋白結(jié)構(gòu)，該蛋白屬于堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)蛋白。

2.2 OnXbp1-S基因的同源性分析

利用Bioedit軟件對(duì)尼羅羅非魚基因編碼的氨基酸序列與紅鰭東方鲀、虹鱒、歐洲食用牡蠣()、斑馬魚、斑點(diǎn)雀鱔()、墨西哥脂鯉()、青鳉()、南極鱈()、原雞()、小鼠()及人()進(jìn)行同源比對(duì)，與不同物種中鋅指結(jié)構(gòu)的同源性高達(dá)79%(圖2)。如圖2所示，黑色陰影表示同源性大于75%的區(qū)域，主要是集中在不同物種的鋅指結(jié)構(gòu)的保守區(qū)域。利用MEGA 6.0軟件對(duì)已經(jīng)公布的哺乳動(dòng)物和常見的魚類進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，顯示尼羅羅非魚與南極鱈同屬一個(gè)分支，同源性最高，與其他無脊椎動(dòng)物的聚為一類。而在哺乳類動(dòng)物、兩棲類動(dòng)物、鳥類和魚類中有明顯分化(圖3)。

2.3 原核蛋白的表達(dá)純化及多克隆抗體的制備

以尼羅羅非魚基因片段為模板，使用特異性引物Xbp1-F4、R4(表1)成功擴(kuò)增到長度為504 bp的目的片段，將目的片段連接到pET32a質(zhì)粒上，獲得重組質(zhì)粒pET32a-Xbp1。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，將測(cè)序正確的陽性克隆進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)前的目的蛋白表達(dá)較弱(圖4)，誘導(dǎo)后有明顯表達(dá)的條帶大小約為40 kDa，與融合蛋白的預(yù)測(cè)分子量一致(包括目的蛋白18 kDa和pET-32a標(biāo)簽蛋白21 kDa)。融合蛋白的可溶性分析結(jié)果顯示，其主要以包涵體的形式存在。經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)，純化蛋白在40 kDa處有較為單一條帶。用抗His-tag的單克隆抗體Western-blot檢測(cè)純化后的蛋白，發(fā)現(xiàn)在40 kDa處存在單一條帶，確定此蛋白為OnXbp1-S表達(dá)的融合蛋白。濃縮純化后的蛋白，制作抗原免疫小鼠并獲得抗血清，直接ELISA法檢測(cè)其抗體效價(jià)為800,000(units/ml)，表明所制備的小鼠抗羅非魚Xbp1-S多克隆抗血清效果良好。

2.4 尼羅羅非魚Xbp1-S基因和蛋白水平的組織分布以及鏈球菌應(yīng)激表達(dá)分析

采用Real-time qPCR方法檢測(cè)mRNA在健康尼羅羅非魚不同組織中的相對(duì)表達(dá)量；并利用所制備的OnXbp1-S多抗Western-blot檢測(cè)OnXbp1蛋白在不同組織的相對(duì)表達(dá)水平。mRNA相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示，OnXbp1-S在所檢測(cè)的8個(gè)組織中的表達(dá)量，由低到高依次為肌肉<胸腺<脾臟<皮膚<鰓<腸<頭腎<肝臟，在肝臟的表達(dá)量最高，在頭腎也有較高的表達(dá)，而在肌肉組織中幾乎不表達(dá)(圖5 A)。OnXbp1-S蛋白的相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果顯示(圖5 B)，OnXbp1-S蛋白在所檢測(cè)的9個(gè)組織中的表達(dá)量，由低到高依次為腸<脾臟<肌肉<皮膚<肝臟<后腎<鰓<頭腎<胸腺，在胸腺的表達(dá)量最高，在頭腎、鰓中都有較高的表達(dá)，而在腸道肌肉中幾乎沒有表達(dá)。

圖1 尼羅羅非魚Xbp1-S基因cDNA全序列以及由此推測(cè)的氨基酸序列

起始密碼子和終止密碼子由細(xì)線框標(biāo)出；下劃線表示的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)域；陰影部分表示原核表達(dá)的抗原結(jié)合區(qū)域；短虛線表示RACE結(jié)果的加尾信號(hào)

Start codon (atg) and stop codon (tga) were marked with filament box; regular underline represented the basic-region leucine zipper (bZIP) domain of X-box binding protein 1 (Xbp1); shadow represented the Prokaryotic expressed sequence, short dash underline represented tailing signal of RACE

圖2 OnXbp1氨基酸序列與其他物種Xbp1序列比對(duì)

圖3 利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建的基于Xbp1基因所編碼氨基酸序列的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 Xbp1-S蛋白的原核表達(dá)及其純化

M: 蛋白Marker; 1: 空載菌蛋白; 2: 重組菌IPTG誘導(dǎo)前; 3: 重組菌IPTG誘導(dǎo)后; 4: 純化后蛋白; 5: 純化后蛋白Western-blot

M: Protein Marker; 1: Protein of empty plasmid vector; 2: Protein before IPTG induction; 3: Protein after IPTG induction; 4: Purification protein; 5: Western-blot of purification protein

在經(jīng)過腹腔注射鏈球菌后，與對(duì)照組相比，所檢測(cè)的不同時(shí)間點(diǎn)里其肝臟和脾臟均呈上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，且其趨勢(shì)基本一致。在早期即腹腔注射6 h后，基因的表達(dá)呈現(xiàn)顯著性增高，其后的24 h和48 h的表達(dá)量有所下降，但在192 h達(dá)到基因表達(dá)量的最高水平(圖6A，圖6B)，而后在264 h逐漸回落下降，趨向?qū)φ战M的水平。

2.5 尼羅羅非魚Xbp1-S在不同B細(xì)胞亞型中的免疫組化分析

根據(jù)Zwollo等(2005)報(bào)道的Percoll密度分離法，分離出羅非魚頭腎B細(xì)胞不同亞類細(xì)胞：Percoll 40細(xì)胞(多為漿細(xì)胞，圖7A)、Percoll 50細(xì)胞(多為原漿B細(xì)胞，圖7B)、Percoll 60細(xì)胞(初分化成熟的B細(xì)胞，圖7C)、和Percoll 70細(xì)胞(多為未成熟的B細(xì)胞，圖7D)。如圖7所示，OnXbp1-S蛋白在不同B細(xì)胞亞類中表達(dá)量水平可由其紅色熒光所顯示，表達(dá)量的 變化從低到高依次為Percoll 70

圖5 Xbp1-S基因及蛋白水平在尼羅羅非魚不同組織中的表達(dá)分布

圖6 無乳鏈球菌應(yīng)激后尼羅羅非魚Xbp1-S基因的表達(dá)量變化

A：肝臟; B：脾臟

A：Liver; B：Spleen

圖7 Xbp1在尼羅羅非魚不同B細(xì)胞亞類中的表達(dá)

A. Percoll 40; B. Percoll 50; C. Percoll 60; D. Percoll 70

3 討論

細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Xbp1表達(dá)與B細(xì)胞的發(fā)育分化及抗體的表達(dá)分泌息息相關(guān)(Zwollo, 2005、2008; Tellier, 2016)。Xbp1是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中蛋白質(zhì)折疊能力的主要調(diào)控者之一，具有2種不同剪切類型(Xbp1-S和Xbp1-U)，其中，Xbp1-S具有高度轉(zhuǎn)錄活性(Zhou, 2008)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)錄后修飾基因表達(dá)等多種功能,一旦發(fā)生錯(cuò)誤的折疊將導(dǎo)致抗凋亡反應(yīng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的無限增值(Hendershot, 2004; Robinson, 1994)。因此，Xbp1研究對(duì)于B細(xì)胞的發(fā)育分化和調(diào)控以及其在防御病原菌侵染的免疫功能分析具有重要的意義。

本研究克隆尼羅羅羅非魚的基因序列，并利用外源蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)(Salinas, 2011)成功構(gòu)建的體外表達(dá)系統(tǒng)，制備多克隆抗體；組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在尼羅羅非魚的正常組織中廣泛存在；在無乳鏈球菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)期，在肝臟和脾臟表達(dá)具有較強(qiáng)的上調(diào)且反應(yīng)趨于同步；并證實(shí)了在尼羅羅非魚中可能也存在對(duì)于漿細(xì)胞即成熟B細(xì)胞的發(fā)育分化調(diào)節(jié)作用。

Xbp1在哺乳動(dòng)物的體內(nèi)廣泛存在，在各個(gè)組織分析中都有表達(dá)，其中在肝細(xì)胞中高表達(dá)(Liou, 1990; Calfon, 2002)。本研究結(jié)果顯示，尼羅羅非魚OnXbp1-S在各個(gè)檢測(cè)組織中都有表達(dá)，在mRNA水平上主要表達(dá)在肝臟中，這與哺乳動(dòng)物中的發(fā)現(xiàn)相類似。然而，蛋白水平上的高表達(dá)主要在胸腺和頭腎中，表明Xbp1-S的表達(dá)與免疫細(xì)胞(B細(xì)胞和T細(xì)胞)的發(fā)育分化可能有一定關(guān)聯(lián)(Zwollo, 2005、2008; Tellier, 2016)。免疫系統(tǒng)中主要免疫細(xì)胞的發(fā)育分化與Xbp1-S表達(dá)的正相關(guān)反映了Xbp1-S轉(zhuǎn)錄因子可能在免疫反應(yīng)中起重要調(diào)控作用，因?yàn)閄bp1-S因子不僅參與體液免疫，而且可能參與細(xì)胞免疫的促進(jìn)作用。無乳鏈球菌應(yīng)激實(shí)驗(yàn)顯示，在應(yīng)激后264 h期間，OnXbp1-S在脾臟和肝臟中都有明顯的表達(dá)上調(diào)。腹腔注射鏈球菌6 h后，肝臟和脾臟中OnXbp1-S mRNA表達(dá)顯著上調(diào)出現(xiàn)第一個(gè)峰值，這種應(yīng)激后短時(shí)間內(nèi)表達(dá)量激增的現(xiàn)象表明該因子很可能參與天然免疫反應(yīng)。第二個(gè)更顯著的表達(dá)高峰出現(xiàn)在鏈球菌應(yīng)激后的192 h (8 d)，這個(gè)顯著上調(diào)很可能是由于參與適用性免疫反應(yīng)的免疫細(xì)胞(B細(xì)胞和T細(xì)胞)中Xbp1-S因子的表達(dá)明顯上調(diào)。

硬骨魚的頭腎組織類似于哺乳動(dòng)物的骨髓，具有造血功能并且是免疫細(xì)胞發(fā)育的場(chǎng)所，因此，頭腎組織含有不同血系的未成熟血細(xì)胞(Fange, 1986; Zapata, 1995)。頭腎是免疫細(xì)胞發(fā)生、發(fā)育分化和增殖的重要場(chǎng)所，也是捕獲抗原和產(chǎn)生抗體的主要器官(Kaattari, 1985; Bromage, 2004; Ye, 2010; Ma, 2013)。本研究尼羅羅非魚的頭腎組織采用Percoll密度梯度分離的方法獲得不同發(fā)育分化程度的B細(xì)胞亞類(Zwollo, 2005)，并采用免疫組化檢測(cè)各類細(xì)胞熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)在分化程度高的成熟漿細(xì)胞和原漿細(xì)胞中，而在na?ve B細(xì)胞和未成熟B細(xì)胞中表達(dá)量較低。尼羅羅非魚不同B細(xì)胞亞類表達(dá)不同水平的現(xiàn)象，與已報(bào)道的紅鰭東方鲀(Ohtani, 2006)和虹鱒魚(Zwollo, 2008)相類似。B細(xì)胞分化程度與因子的表達(dá)正相關(guān)表明，該因子對(duì)于成熟漿細(xì)胞以及漿母細(xì)胞的發(fā)育具有重要的促進(jìn)作用，即對(duì)B細(xì)胞的分化起正調(diào)節(jié)作用，調(diào)控原漿細(xì)胞是在特定的生態(tài)位中進(jìn)一步發(fā)育分化為漿細(xì)胞(Ye, 2011)。Xbp1-S的免疫功能尤其對(duì)于B細(xì)胞分化的作用研究有利于探索體液免疫B細(xì)胞的發(fā)育分化調(diào)控機(jī)制。綜上所述，本研究將為進(jìn)一步研究尼羅羅非魚Xbp1-S因子應(yīng)答病原菌侵染的機(jī)理及促進(jìn)B細(xì)胞分化機(jī)制提供理論依據(jù)。

Barr M, Mott K, Zwollo P. Defining terminally differentiating B cell populations in rainbow trout immune tissues using the transcription factor Xbp1. Fish and Shellfish Immunology, 2011, 31(6): 727–735

Bennett JT, Joubin K, Cheng S,. Nodal signaling activates differentiation genes during zebrafish gastrulation. Developmental Biology, 2007, 304(2): 525–540

Bromage ES, Ye J, Owens L,. Use of staphylococcal protein A in the analysis of teleost immunoglobulin structural diversity. Developmental and Comparative Immunology, 2004, 28(7–8): 803–814

Calfon M, Zeng H, Urano F,. IRE1 couples endoplasmic reticulum load to secretory capacity by processing the XBP-1 mRNA. Nature, 2002, 415(6867): 92–96

Fange R. Lymphoid organs in sturgeons (Acipenseridae). Veterinary Immunology and Immunopathology, 1986, 12(1–4): 153–161

Gan Z, Wang B, Lu Y,. Molecular characterization and expression of Lck in Nile tilapia () in response tostimulus. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2015, 175(5): 2376–2389

Hendershot LM. The ER function BiP is a master regulator of ER function. Mount Sinai Journal of Medicine, 2004, 71(5): 289–297

Hu MC, Gong HY, Lin GH,. XBP-1, a key regulator of unfolded protein response, activates transcription of IGF1 and Akt phosphorylation in zebrafish embryonic cell line. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007, 359(3): 778–783

Iwakoshi NN, Lee AH, Glimcher LH. The X-box binding protein-1 transcription factor is required for plasma cell differentiation and the unfolded protein response. Immunological Reviews, 2003, 194(1): 29–38

Iwakoshi NN, Pypaert M, Glimcher LH. The transcription factor XBP-1 is essential for the development and survival of dendritic cells. Journal of Experimental Medicine, 2007, 204(10): 2267–2275

Kaattari SL, Irwin MJ. Salmonid spleen and anterior kidney harbor populations of lymphocytes with different B cell repertoires. Developmental and Comparative Immunology, 1985, 9(3): 433–444

Leong JS, Jantzen SG, von Schalburg KR.andfull-length cDNA sequences reveal changes in evolutionary pressures on a post-tetraploidization genome. BMC Genomics, 2010, 11(1): 279

Liou HC, Boothby MR, Finn PW,. A new member of the leucine zipper class of proteins that binds to the HLA DR alpha promoter. Science, 1990, 247(4950): 1581–1584

Lu MX. Review of research on streptococcosis in Tilapia. South China Fisheries Science, 2010, 6(1): 75–79 [盧邁新. 羅非魚鏈球菌病研究進(jìn)展. 南方水產(chǎn), 2010, 6(1): 75–79]

Ma C, Ye J, Kaattari SL. Differential compartmentalization of memory B cells versus plasma cells in salmonid fish. European Journal of Immunology, 2013, 43(2): 360–370

Ohtani M, Miyadai T, Hiroishi S. Identification of genes encoding critical factors regulating B-cell terminal differentiation in torafugu (). Comparative Biochemistry and Physiology Part D Genomics Proteomics, 2006, 1(1): 109–114

Peng SQ, An LG, Zhang Z,. Cloning and tissue-specific expression analysis of Xbp1 gene inL. Journal of University of Jinan, 2013, 27(2): 1671–3359 [彭少卿, 安利國, 張珍, 等. 鯉魚Xbp1基因克隆與組織特異性表達(dá)分析. 濟(jì)南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 27(2): 1671–3359]

Reimold AM, Iwakoshi NN, Manis J,. Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1. Nature, 2001, 412(6844): 300–307

Robinson AS, Hines V, Wittrup KD. Protein disulfide isomerase overexpression increase secretion of foreign protein in. Biotechnology, 1994, 12(4): 381–384

Salinas I, Zhang YA, Sunyer JO. Mucosal immunoglobulins and B cells of teleost fish. Developmental and Comparative Immunology, 2011, 35(12): 1346–1365

Tellez-Ba?uelos MC, Santerre A, Casas-Solis J,. Oxidative stress in macrophages from spleen of Nile tilapia () exposed to sublethal concentration of endosulfan. Fish and Shellfish Immunology, 2009, 27(2): 105–111

Tellier J, Shi W, Minnich M,. Blimp-1 controls plasma cell function through the regulation of immunoglobulin secretion and the unfolded protein response. Nature Immunology, 2016, 17(3): 323–330

Wang H, Zhang Y, Yehuda-Shnaidman E,. Liver X receptor alpha is a transcriptional repressor of the uncoupling protein 1gene and the brown fat phenotype. Molecular and Cell Biology, 2008, 28(7): 2187–2220

Yao WL, He YY, Liu P,. The cDNA cloning and expression analysis of P38 MAPK gene of. Progress in Fishery Sciences, 2016, 37(2): 91–98 [姚萬龍, 何玉英, 劉萍, 等. 中國對(duì)蝦() p38 MAPK基因克隆及表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2016, 37(2): 91–98]

Ye J, Bromage ES, Kaattari SL. Plasma blasts and plasma cells and the organization of the teleost immune system. Developmental and Comparative Immunology, 2011, 35(12): 1273–1281

Ye J, Bromage ES, Kaattari SL. The strength of B cell interaction with antigen determines the degree of IgM polymerization. Journal of Immunology, 2010, 184(2): 844–850

Yoshida H, Matsui T, Yamamoto A,. XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor. Cell, 2001, 107(7): 881–891

Zapata AG, Torroba M, Vicente A,. The relevance of cell microenvironments for the appearance of lympho- haemopoietic tissues in primitive vertebrates. Histology and Histopathology, 1995, 10(3): 761–778

Zhou M, Jacob A, Ho N,. Downregulation of protein disulfide isomerase in sepsis and its role in tumor necrosis factor-alpha release. Critical Care, 2008, 12(4): R100

Zwollo P, Cole S, Bromage E,. B cell heterogeneity in the teleost kidney: Evidence for a maturation gradient from anterior to posterior kidney. Journal of Immunology, 2005, 174(11): 6608–6616

Zwollo P, Haines A, Rosato P,. Molecular and cellular analysis of B-cell populations in the rainbow trout using Pax5 and immunoglobulin markers. Developmental and Comparative Immunology, 2008, 32(12): 1482–1496

(編輯 馮小花)

Molecular Cloning and Expression Analysis ofof Nile Tilapia ()

WANG Yuhong1, YIN Xiaoxue1, DING Mingmei1, FU Shengli1, CHEN Meng1, GUO Zheng1,2, YE Jianmin1,2①

(1.510631; 2.510631)

X-box binding protein 1-S (Xbp1-S) is a key transcript factor mainly associated with B cell development and differentiation. The 1380 bp full-length cDNA ofincluding 1155 bp ORF, 127 bp 5'UTR and 98 bp 3'UTR was cloned with RACE, which encodes 384 amino acids with a molecular weight of 41.32 kDa and a theoretical isoelectric point of 4.36. Homology analysis revealed that thegene was homologous to other fish with the most similarity with.expresses in all tested tissues, with the highest mRNA expression in liver, and the highest protein level in thymus and the lowest protein level in muscle.stimulation induced the expression ofwith the highest level at 192 h post-infection. In addition, mature B cells have a much higherlevel than naive B cells. Taken together, the results indicated thatmight be involved in the immune response in Nile tilapia againstinfection, and play a role in B cell development and differentiation.

;; Gene cloning; Tissue expression;

YE Jianmin, E-mail: yjmying@126.com

2017-01-23,

2017-02-14

S917

A

2095-9869(2018)01-0073-10

10.11758/yykxjz.20170123001

http://www.yykxjz.cn/

* 國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31472302; 31172432)和廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030313437)共同資助[This work was supported by National Natural Science Foundation of China (31472302 and 31172432), and Natural Science Foundation of Guangdong (2014A030313437)]. 王玉紅, E-mail: wyhong1121@126.com

葉劍敏，教授，E-mail: yjmying@126.com

王玉紅, 尹曉雪, 丁明媚, 付勝利, 陳萌, 郭政, 葉劍敏. 尼羅羅非魚基因克隆及表達(dá)分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2018, 39(1): 73–82

Wang YH, Yin XX, Ding MM, Fu SL, Chen M, Guo Z, Ye JM. Molecular cloning and expression analysis ofof nile tilapia (). Progress in Fishery Sciences, 2018, 39(1): 73–82