高效液相色譜法檢測雞蛋中氯霉素類藥物殘留

（廣西獸藥監(jiān)察所，廣西南寧 530001）

氯霉素類抗生素包括氯霉素（CAP）、甲砜霉素（TAP）和氟苯尼考（FF），具有廣譜抗菌作用，抗菌譜包括需氧革蘭性陰性菌及革蘭性陽性菌、厭氧菌、立克次體屬、螺旋體和衣原體屬，在我國畜牧業(yè)中廣泛應(yīng)用，對畜禽的疾病控制和治療起到了重要作用。但由于氯霉素對人、畜有嚴(yán)重的毒副作用[1]，能引起人的再生障礙性貧血、粒狀白細(xì)胞缺乏癥等疾病，許多國家已禁止在食用源性動(dòng)物產(chǎn)品上使用。而作為其衍生物的甲砜霉素和氟苯尼考，由于毒副作用降低且具有較好的抗菌活性，價(jià)格也相對便宜，自氯霉素禁用以來是我國目前廣泛應(yīng)用的抗生素[2]。雖然甲砜霉素血液系統(tǒng)毒性比氯霉素小，抑制紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板程度比氯霉素輕，但免疫抑制作用比氯霉素強(qiáng)，仍有較強(qiáng)的毒副作用。氟苯尼考在結(jié)構(gòu)上具有一定的優(yōu)勢，相對氯霉素和甲砜霉素，氟苯尼考具有毒性低，不引起動(dòng)物再生障礙型貧血等特點(diǎn)，也沒有“三致”作用（致畸、致癌和致突變），但繁殖毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，氟苯尼考具有胚胎毒性[3]，用藥后還會(huì)出現(xiàn)厭食、腹瀉等不良反應(yīng)。濫用甲砜霉素及氟苯尼考會(huì)引起的動(dòng)物性食品殘留，進(jìn)而可能對人類健康產(chǎn)生危害，以及致病菌株耐藥性的產(chǎn)生。

目前，有關(guān)氯霉素類藥物殘留的檢測方法較多，主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法[4～12]等。本研究旨在建立一種靈敏、可靠的同時(shí)檢測雞蛋中氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考藥物殘留的高效液相色譜分析方法，方法定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，基質(zhì)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)表明，方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足雞蛋中藥物殘留檢測的要求。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：高效液相色譜儀（Waters公司，e2695/2998）；分析天平（METTLER TOLEDO公司，PB602-S）；高速冷凍離心機(jī)（SIGMA公司，3K15）；超聲波水浴（昆山市超聲儀器有限公司，KQ-250DB）；固相萃取裝置（Waters公司）；氮?dú)獯蹈蓛x（Organomation Associates公司，N-EVAP 116）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-901）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司，R-200）；50ml雞心瓶；50mL具塞塑料離心管；微孔濾膜（0.45μm）；HLB固相萃取柱（Waters公司，Oasis 6cc/200mg）。

主要試劑：乙腈為色譜純；乙酸乙酯、正乙烷為優(yōu)級純；水為一級水；氯霉素（CAP）標(biāo)準(zhǔn)品，來源中國食品藥品檢定研究院，批號：130555-201203，含量99.8%；甲砜霉素（TAP）標(biāo)準(zhǔn)品，來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0241406，含量99.7%；氟苯尼考（FF）標(biāo)準(zhǔn)品，來源中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：K0301703，含量99.1%，用乙腈溶解配制成濃度為10.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，臨用時(shí)準(zhǔn)確量取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用流動(dòng)相稀釋成適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 樣品處理

1.2.1 提取 取同一來源的10枚雞蛋勻漿，使混合均勻。準(zhǔn)確稱取5.00g勻漿蛋樣置于50ml具塞塑料離心管中，加入20ml乙酸乙酯，超聲波提取5min，再渦旋提取5min后，以10000 r/min離心5min，吸取上清液于雞心瓶中。再用20ml乙酸乙酯同樣重復(fù)提取沉淀物1次。合并2次提取上清液，45℃旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)至近干。加入5ml10%甲醇水溶液至雞心瓶超聲5min使充分溶解，轉(zhuǎn)移至50ml具塞塑料離心管中，再加入5ml10%甲醇水溶液至雞心瓶中重復(fù)溶解沉積物1次并轉(zhuǎn)移至同一離心管中。加入20ml正己烷至離心管中，渦旋5min后，8000 r/min離心2min，棄去上層正己烷，再用20ml正己烷重復(fù)以上操作，下層溶液待凈化。

1.2.2 凈化 用HLB固相萃取柱進(jìn)行SPE凈化，先后用甲醇、水各5ml預(yù)洗活化。取上述提取的水相過柱，用5ml10%甲醇水溶液淋洗，棄去淋洗液，擠干，用5ml甲醇洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1.0 ml/min。洗脫液于45℃用氮?dú)獯蹈?，殘留物?.0ml流動(dòng)相定容，渦旋混合1min，過0.45μm微孔濾膜后作為試樣溶液，供HPLC測定。

同時(shí)作空白樣品的處理，均按上述測定條件和步驟進(jìn)行平行操作。

1.3 HPLC測定條件

色譜柱：XTerra?MS C18，5μm，250mm×4.6mm column；流動(dòng)相：乙腈+水（1/5，V/V），使用前經(jīng)微孔濾膜過濾，超聲；流速：1.0 ml/min；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20μl；檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長：CAP為280nm，TAP、FF為225nm。

1.4 添加回收率、檢測限（LOD）和精密度的確定

取空白雞蛋樣品5.00g，加入一定體積的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，使在蛋樣中的濃度分別為0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg；另取空白雞蛋樣品，不添加標(biāo)準(zhǔn)工作液。添加與空白均按上述樣品前處理方法進(jìn)行處理，作HPLC測定。再將相對應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液作HPLC測定分析，計(jì)算各對應(yīng)質(zhì)量濃度的回收率。各空白雞蛋樣品測得基線噪音值，按信噪比S/N≥3為檢測限。每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行5個(gè)平行樣品的測試，3次重復(fù)，根據(jù)色譜峰峰面積分別計(jì)算各濃度點(diǎn)的添加回收率、批內(nèi)和批間變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品提取劑的優(yōu)化

氯霉素類藥物屬于弱極性物質(zhì)，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑。常用于提取氯霉素類藥物的有機(jī)溶劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯[4～12]等，本研究選擇甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯4種溶劑作為提取劑進(jìn)行測定。結(jié)果表明，甲醇與蛋樣中水分互溶，提取液中雜質(zhì)較多，蒸干較慢；乙腈、丙酮是良好的蛋白沉淀劑，但在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)容易冒泡爆沸，蒸干時(shí)間長，影響效率；而乙酸乙酯作為提取劑提取率高，毒性小，而且容易蒸干，回收率穩(wěn)定。本文采用乙酸乙酯作為提取液能最大限度提取出有效成分并使共萃取的干擾物較少，添加回收結(jié)果理想，回收率穩(wěn)定。

2.2 樣品凈化條件的優(yōu)化

由于采用乙酸乙酯作為提取溶劑，有大量脂質(zhì)及類脂物質(zhì)、組織內(nèi)源性物質(zhì)被提取出來，必須進(jìn)行脫脂及去雜質(zhì)處理。正乙烷是常見的脫脂溶劑，本研究采用正乙烷與10%甲醇水溶液之間進(jìn)行液-液分配去除脂質(zhì)及類脂質(zhì)。液－液萃取后通常需用固相萃取柱進(jìn)一步凈化，HLB固相萃取柱為親水親脂平衡的水可浸潤性的反相吸附劑，不影響吸附劑床的干涸，無須活化，直接上樣，可對氯霉素類藥物進(jìn)行選擇吸附，簡化了實(shí)驗(yàn)步驟，有效去除了樣品中的蛋白、磷脂、維生素和礦物質(zhì)等基質(zhì)干擾物，對蛋樣基質(zhì)能達(dá)到較好的凈化效果。

2.3 固相萃取凈化條件的優(yōu)化

取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液添加到10mL純水中，過HLB固相萃取柱，分別用5mL5%、10%、20%、40%、80%甲醇水溶液淋洗，取淋洗液直接進(jìn)樣檢測。5%、10%淋洗液中均未檢測到加標(biāo)藥物，20%淋洗液中檢測到TAP藥物，40%、80%淋洗液中均檢測到TAP、FF、CAP藥物。本研究采用10mL10%甲醇水溶液分兩次溶解氯霉素類藥物提取殘留物，5mL10%甲醇水溶液淋洗，5mL純甲醇洗脫。結(jié)果顯示在本條件下能更充分溶解提取殘留物中的待測物，使液-液分配過程分層明顯，雜質(zhì)干擾相對較少。

2.4 TAP、FF和CAP紫外吸收波長選擇的優(yōu)化

采用乙腈+水（1/5，V/V）為流動(dòng)相，對氯霉素類藥物進(jìn)行二極管陣列波長掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 TAP、FF和CAP二極管陣列檢測器掃描光譜圖

由圖1可見，CAP最大吸收波長為280nm，TAP、FF最大吸收波長為225nm。

2.5 液相色譜檢測

采用本試驗(yàn)中樣品處理方法，在上述色譜條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品和試樣溶液的高效液相色譜圖分別見圖2、圖3、圖4。通過圖譜分析可知，本法中TAP、FF和CAP出峰時(shí)間較穩(wěn)定，干擾雜質(zhì)較少。

圖2 TAP、FF和CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖（濃度為0.20mg/L）

圖3 蛋樣空白樣品色譜圖

圖4 空白蛋樣添加色譜圖（添加濃度為0.04mg/kg）

2.6 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢測限

在本方法確定的實(shí)驗(yàn)條件下，采用空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)工作液的方法制備標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，TAP、FF和CAP添加濃度為0.02、0.04、0.08、0.10、0.20mg/kg，每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行5個(gè)平行樣品的實(shí)驗(yàn)，分別進(jìn)樣用平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的TAP、FF和CAP的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢測限（S/N≥3）見表1。

表1 TAP、FF和CAP的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及方法檢測限

2.7 方法的添加回收率和精密度

本研究建立的雞蛋樣品中氯霉素類藥物殘留檢測方法，在20～200μg/kg添加濃度的平均回收率為69.45%～99.81%，其批內(nèi)變異系數(shù)≤9.62%，批間變異系數(shù)≤14.28%?；厥章屎途芏冉Y(jié)果見表2。

表2 樣品回收率和精密度試驗(yàn)（n=5）

3 結(jié)論

該方法樣品操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好、檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，達(dá)到殘留分析的要求，可用于氯霉素類藥物在雞蛋中殘留定量檢測。但還存在定性不夠準(zhǔn)確的實(shí)際問題，今后研究的主要方向應(yīng)為氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法和液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS或LC-MS/MS）法等能夠定性的仲裁方法。

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