宋嬌嬌，楊　勇，譚洪弟，李　喆，余美麗

（江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800）

核苷類物質(zhì)包括腺苷、腺嘌呤、3-脫氧腺苷、尿嘧啶、鳥苷、鳥嘌呤、胸嘧啶、胞苷、次黃嘌呤等[1]。核苷類物質(zhì)對人體免疫、代謝以及肝臟、心血管及神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)揮著重要的生理作用，且具有抗菌和抗病毒等生理活性[2]，如腺苷具有改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等[3]。洋河酒廠以釀造環(huán)境中篩選出1株產(chǎn)核苷類物質(zhì)的菌株為研究基礎(chǔ)，通過固態(tài)發(fā)酵形成固態(tài)發(fā)酵物。本研究以核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物為研究對象，優(yōu)化超聲波提取核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物中總核苷工藝，為核苷類物質(zhì)的更廣泛應用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料、試劑及儀器

實驗菌種：洋河酒廠技術(shù)中心功能微生物實驗室保藏。

核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物：以核苷功能菌為實驗菌株，麩皮為培養(yǎng)基進行固態(tài)培養(yǎng)形成的發(fā)酵產(chǎn)物。

腺苷對照品：美國sigma公司生產(chǎn)。

AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KH-500DB型數(shù)控超聲清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UV-240可見紫外分光光度計，日本島津。

1.2　試驗方法

1.2.1　核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物制備

以麩皮為培養(yǎng)基質(zhì)，添加一定比例營養(yǎng)液，接種核苷功能菌，30℃培養(yǎng)4～5 d，形成富含核苷類物質(zhì)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.2　提取液制備

將核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物進一步粉碎成粉狀，稱取1 g粉碎后樣品置于500 mL三角瓶中，按一定的料液比添加蒸餾水，在一定提取溫度、超聲頻率條件下提取一定時間后，過濾，取濾液備用。

1.2.3　提取液中總核苷提取量測定[4]

（1）最大吸收波長的確定

將核苷對照品于200～400 nm處作全程掃描,其最大吸收波長在259 nm左右，所以選擇259 nm為檢測波長。

（2）腺苷對照品儲備液的配制

精密稱取腺苷對照品1.74 mg，用蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成17.4 μg/mL的水溶液作為對照品儲備液，避光冷藏。

（3）腺苷標準曲線的繪制

精密吸取腺苷對照品儲備液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL、8 mL于10 mL容量瓶中，分別用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，配制成不同濃度的對照品溶液。以去離子水作為空白，用紫外分光光度法在259 nm處分別測定對照品溶液的吸光度(ABS)，以吸光度為橫坐標，腺苷對照品溶液濃度(μg/mL)為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)果腺苷對照品在5.208～13.913 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為Y=8.6311X-0.0042，r=0.9998（其中X為吸光值，Y為腺苷濃度，μg/mL）。

（4）樣品提取量測定

取核苷功能菌固態(tài)發(fā)酵物提取液，經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾，適當稀釋至標準曲線濃度范圍，搖勻。以去離子水作為空白，用島津UV-240可見-紫外分光光度計在波長259 nm處測定其吸光度，計算出總核苷類物質(zhì)的含量。

1.2.4　單因素試驗

固定料液比100∶1，提取溫度50℃，超聲頻率70 Hz，分別選取提取時間15 min、30 min、45 min、60 min、75 min進行超聲提取，平行提取3次，考察提取時間對總核苷提取量的影響。

固定提取時間30 min，超聲頻率70 Hz，提取溫度50 ℃，料液比（ mL/g）分別按照50∶1、100∶1、150∶1、200∶1、250∶1、300∶1加入蒸餾水進行超聲提取，平行提取3次，考察料液比對總核苷提取量的影響。

固定料液比100∶1，提取時間45 min，超聲頻率70 Hz，分別選取提取溫度35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃進行超聲提取，平行提取3次，考察提取溫度對總核苷提取量的影響。

固定料液比100∶1，提取時間45 min，提取溫度50 ℃，分別選取超聲頻率40 Hz、50 Hz、60 Hz、70 Hz、80 Hz、90 Hz進行超聲提取，平行提取3次，考察超聲頻率對總核苷提取量的影響。

1.2.5　響應面試驗設(shè)計[5-6]

通過對影響總核苷提取量的單因素分析，選取對總核苷提取量影響顯著的單因素提取時間、料液比、提取溫度以及超聲頻率為考察因素，以總核苷提取量為目標值，運用Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，設(shè)計4因素3水平響應面分析試驗。

1.2.6　數(shù)據(jù)處理及分析

利用SPSS 21軟件進行方差分析，Design Expert 8.0.6.1軟件進行響應面分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗結(jié)果

2.1.1　提取時間對總核苷提取量的影響（圖1）

由圖1可知，提取時間15～30 min時，總核苷提取量無顯著差異，提取時間45 min時，總核苷提取量顯著增加，提取時間超過45 min時，總核苷提取量趨于穩(wěn)定，無顯著變化。說明超聲提取時間的延長有助于總核苷提取量的增加，提取時間過短則核苷類物質(zhì)未充分提取進入溶液，但隨著提取時間進一步增加，溶解度達到飽和，總核苷提取量達到最大限度，不再增加[7]?？紤]到總核苷提取量、降低能耗等多方面因素，選擇最佳提取時間45 min。

圖1　提取時間對總核苷提取量的影響

2.1.2　料液比對總核苷提取量的影響（圖2）

圖2　料液比對總核苷提取量的影響

由圖2可知，料液比在100∶1時總核苷提取量達到最大值，再增大提取劑用量，總核苷提取量降低，且繼續(xù)增大提取劑用量總核苷提取量無顯著變化。可能的原因：料液比超過一定范圍，會增加超聲波破碎細胞的阻力，使細胞破碎程度下降[8]，從而降低核苷類物質(zhì)的溶出效率。綜合考慮選擇最佳料液比為100∶1。

2.1.3　提取溫度對總核苷提取量的影響（圖3）

由圖3可知，隨著提取溫度的升高，總核苷提取量呈先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢，可能的原因是溫度低于50℃時，隨著溫度的升高，加強了分子間的相對運動，進一步破壞細胞結(jié)構(gòu)[9]，增強了核苷類物質(zhì)的溶出；提取溫度超過50℃時，溫度對核苷類物質(zhì)的影響不顯著。綜合考慮提取溫度選取50℃。

2.1.4　超聲頻率對總核苷提取量的影響（圖4）

圖3　提取溫度對總核苷提取量的影響

圖4　超聲頻率對總核苷提取量的影響

由圖4可知，在超聲頻率40～50 Hz范圍內(nèi)，總核苷提取量隨著超聲頻率的增加顯著提升，但超聲頻率超過50 Hz時，總核苷提取量顯著下降，再增加超聲頻率對總核苷提取量無顯著影響。說明一定頻率的超聲處理有利于提升核苷類物質(zhì)溶出效果，總核苷提取量顯著提升，但超聲頻率過高，可能導致核苷類物質(zhì)被破壞，總核苷提取量不增反降[10]。因此選擇最佳超聲頻率為50 Hz。

2.2　響應面分析法優(yōu)化總核苷的超聲提取工藝

2.2.1　響應面BOX-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

依據(jù)Design Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Benhnken試驗設(shè)計原理，結(jié)合超聲提取單因素試驗結(jié)果，選取對總核苷提取量影響顯著的提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及超聲頻率（D）為考察因素，用-1、0、+1分別表示低、中、高3水平，以總核苷提取量為響應值（Y），進行4因素3水平響應面優(yōu)化試驗，因素水平編碼見表1，響應面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果見表2。

2.2.2　方差分析和二元回歸方程擬合

利用Design Expert 8.0.6.1軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行回歸分析，對各因素進行回歸擬合后，得到總核苷提取量（Y）與提取時間（A）、料液比（B）、提取溫度（C）以及超聲頻率（D）之間的四元二次回歸方程：

表1　響應面試驗設(shè)計因素及水平編碼

表2　響應面試驗設(shè)計與結(jié)果

Y=3.59+0.070×A-0.21×B+0.30×C-0.058×D+0.02×A×B-0.04×A×C+5.00E-003×A×D+0.033×B×C-0.018×B×D+0.16×C×D-0.042×A2-0.40×B2-0.36×C2-0.090×D2，對該模型進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。

由表3可知，該回歸模型的P＜0.0001，說明所選擇的回歸方程具有極顯著性，試驗設(shè)計可靠。失擬項P=0.2157＞0.05，說明失擬項差異不顯著，表明無失擬因素存在，對模型是有利的，證明該回歸方程能夠較顯著擬合提取時間、料液比、提取溫度、超聲頻率對總核苷提取量的影響，該模型能夠代替試驗真實點對實驗結(jié)果進行分析。本試驗中模型校正系數(shù)（R2Adj）為0.8848，說明總核苷提取量與模型回歸有著良好的一致性，該模型能夠解釋88.48%的響應值變化。因此，該模型是顯著且可靠的，可以用來預測超聲提取條件對總核苷提取量的影響。

回歸方程各項的方差分析結(jié)果表明，料液比（B）一次項及其二次項、提取溫度（C）一次項及其二次項的P＜0.01，具有極顯著性。提取溫度（C）和超聲頻率（D）的交互項P＜0.05，具有顯著性。提取時間（A）一次項和二次項、超聲頻率（D）一次項和二次型、交互項（AB、AC、AD、BC、BD）P＞0.05，對結(jié)果影響不顯著，剔除不顯著項，得到的模型方程為：

總核苷提取量=3.59-0.21×B+0.30×C+0.16×C×D-0.40×B2－0.36×C2。

由F值可知，各因素對總核苷提取量影響大小依次為：C（提取溫度）＞B（料液比）＞A（提取時間）＞D（超聲頻率）。

2.2.3　響應面交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，所得響應面及等高線見圖5和圖6，該圖組可直觀地反映各個因素及其交互作用對總核苷提取量的影響。其中，等高線的形狀可以反映出各因素間交互作用的強弱，如果等高線為鞍型或橢圓形，則表示兩者交互作用顯著；如果等高線為圓形，則表示兩者交互作用不顯著[11]。

圖5顯示了提取時間和超聲頻率在中心水平下，料液比與提取溫度交互作用對總核苷提取量的影響。由圖5可知，等高線圖為接近圓形，表明提取溫度與料液比交互作用不顯著。圖6顯示了提取時間和料液比在中心水平下，超聲頻率與提取溫度交互作用對總核苷提取量的影響。由圖6可知，等高線為橢圓形，表明提取溫度與超聲頻率的交互作用是顯著的。這與表3中兩個交互項的p值0.6051、0.0225相比較，確定交互項中只有提取溫度與超聲頻率的交互作用是顯著的。

表3　回歸模型方差分析表

圖5　料液比與提取溫度交互作用影響總核苷提取量的響應面圖與等高線圖

2.2.4　最佳提取條件的預測與驗證

對優(yōu)化后的回歸方程求解，在試驗的因素水平范圍內(nèi)預測總核苷提取的最佳條件為：提取時間53.87 min，料液比88.70∶1，提取溫度55.96 ℃，超聲頻率50.63 Hz，在此條件下總核苷提取量為3.69 mg/g。考慮到實際試驗操作的可行性，將超聲總核苷提取的最佳條件修正為：提取時間54 min，料液比90∶1，提取溫度56℃，超聲頻率50 Hz，在此條件下進行3組驗證性試驗，測得總核苷提取量為3.79 mg/g,與預測理論值的相對誤差在5%以內(nèi)，說明采用響應面法優(yōu)化超聲提取總核苷工藝的方法可行且快速。

圖6　超聲頻率與提取溫度交互作用影響總核苷提取量的響應面圖與等高線圖

3　結(jié)論

本研究考察超聲提取條件：提取時間、料液比、提取溫度、超聲頻率4個單因素對總核苷提取量的影響，確定條件優(yōu)化的范圍，然后經(jīng)響應面法設(shè)計并對提取條件進行優(yōu)化。最優(yōu)總核苷提取條件為：提取時間53.87 min，料液比88.70∶1，提取溫度55.96℃，超聲頻率50.63 Hz，在此條件下總核苷提取量為3.69 mg/g。最終調(diào)整為提取時間54 min，料液比90∶1，提取溫度56℃，超聲頻率50 Hz，在此最佳條件下，總核苷的提取量為3.79 mg/g,與預測理論值的相對誤差在5%以內(nèi)，說明采用響應面法優(yōu)化超提取總核苷工藝的方法可行且快速。

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