張曉慷，王海利，張新剛

(山東省農(nóng)藥科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南　250100)

植物病害是影響農(nóng)作物高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的重要因素之一，每年因植物病害給農(nóng)作物造成的損失無法估量。我國是世界上人口最多的國家，防治植物病害，促進(jìn)農(nóng)作物增產(chǎn)，保障糧食安全對我國具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的植物病害防治措施以施用化學(xué)農(nóng)藥為主，但化學(xué)農(nóng)藥存在殘留污染、誘導(dǎo)病菌抗性增強(qiáng)、造成環(huán)境污染、危害人體健康等諸多缺點(diǎn)[1-2]。生物農(nóng)藥和生物防治以其低殘留、低毒、低抗性及環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被世界很多國家關(guān)注和推廣，成為解決植物病害最富前景的措施[3-4]。

黃瓜灰霉病是由灰葡萄真菌侵染引起的，主要發(fā)生于黃瓜生育期的病害，若防治不當(dāng)，一般會(huì)造成10%～70%以上的減產(chǎn)，現(xiàn)已成為我國溫室大棚中黃瓜減產(chǎn)的主要病害之一[5-6]。同時(shí)，該病菌還能危害茄子、番茄、大蔥、青椒、韭菜等多種經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物，所以，開發(fā)高效、低毒、可靠的灰霉病防治藥物具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本課題組從土壤中篩選到一株對黃瓜灰霉病具有生物防效的菌株F170062，本文對其發(fā)酵液的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，同時(shí)對發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)的粗提活性進(jìn)行了初步探索。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌株

供試菌株：生防菌株F170062，本實(shí)驗(yàn)室保存。

靶標(biāo)菌株：黃瓜灰霉病菌，由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2培養(yǎng)基

發(fā)酵培養(yǎng)基：1%可溶性淀粉、2%葡萄糖、2.5%花生粉、0.1%牛肉膏、0.4%的酵母浸粉、0.2%NaCl、0.005%K2HPO4，水1000 mL，調(diào)節(jié)pH值=7.2，分裝于250 mL三角瓶中，每瓶約80 mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

PDA培養(yǎng)基：37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、1000 mL水，加熱煮沸溶解，分裝于500 mL三角瓶中，每瓶約300 mL，在121℃下濕熱滅菌25min備用。

1.2　方法

1.2.1發(fā)酵粗提液的制備

取生長有F170062菌的斜面接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28℃，轉(zhuǎn)速220 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)4d。而后將發(fā)酵液在4000 r/min的離心機(jī)中離心10min，上清液經(jīng)0.22μm的濾膜過濾，作為發(fā)酵粗提液，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2發(fā)酵粗提液抑菌活性的測定

采用有毒介質(zhì)法測定發(fā)酵粗提液對供試菌株的抑菌活性。(1)取20μL發(fā)酵粗提液加入到已滅菌的培養(yǎng)皿中；(2)在培養(yǎng)皿中定量加入20 mLPDA培養(yǎng)基，搖晃均勻；(3)待培養(yǎng)基凝固后，在培養(yǎng)基上接種黃瓜灰霉病菌餅，放置在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，后取出采用十字交叉法測定病原菌菌落直徑，并計(jì)算抑菌率，公式如下：

抑菌率=(對照菌落直徑-處理后菌落直徑)×100/(對照菌落直徑-菌餅直徑)

如非特殊說明，本文所有試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.3發(fā)酵粗提液粗提活性試驗(yàn)樣品處理

將20 mL發(fā)酵粗提液平均分成3份，分別調(diào)pH值為3、7、10，后再將每個(gè)pH值發(fā)酵粗提液再分成3份，分別作正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取、沸水15min加熱處理，萃取完成后，把有機(jī)相部分和水相部分進(jìn)行分離，對每個(gè)樣品進(jìn)行編號，編號如表1所示。

表1　F170062粗提液樣品編號

對處理后的樣品進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，蒸發(fā)掉各自的溶劑后向樣品中加入100μL甲醇，再加入與原發(fā)酵液同體積的水，恢復(fù)到原來的體積，同時(shí)回調(diào)到原發(fā)酵液pH值。

1.2.4發(fā)酵粗提液粗提活性試驗(yàn)樣品紙片的制備

在無菌室中，將濕熱滅菌處理過的紙片依次在樣品中浸取1～2min，后取出，按編號順序放置在含有黃瓜灰霉病菌孢子的PDA培養(yǎng)基，每個(gè)樣品重復(fù)兩次，以不放置處理樣品的含有黃瓜灰霉病孢子的PDA培養(yǎng)基為對照，在18℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，后查看結(jié)果。

1.3　粗提液穩(wěn)定性測定

1.3.1熱穩(wěn)定性測定

將發(fā)酵粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷卻后，以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.2酸堿穩(wěn)定性的測定

測定發(fā)酵粗提液pH值后，用鹽酸和氫氧化鈉將粗提液pH值調(diào)節(jié)至2、4、6、8、10、12，在室溫下放置2 h，后將pH值調(diào)回粗提液原pH值，以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性。

1.3.3紫外穩(wěn)定性的測定

將發(fā)酵粗提液加入到無菌培養(yǎng)皿中，在超凈工作臺(tái)中，25W紫外燈下，距離10 cm照射1、3、5、7、9 h，以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉菌的抑菌活性。

1.3.4粗提液加入量

定量向培養(yǎng)基中加入10、20、50、100、150、200、300、400、500μL粗提液，以未處理的發(fā)酵粗提液及無菌水為對照，測定對黃瓜灰霉病的抑菌活性

2　結(jié)果與分析

2.1　粗提液的熱穩(wěn)定性

將粗提液在30、50、70、90、100℃下水浴1 h，冷卻后以未處理的發(fā)酵粗提液和無菌水為對照測定抑菌活性，結(jié)果如表2所示。

表2　F170062粗提液的熱穩(wěn)定性

由表2可知，當(dāng)發(fā)酵粗提液在30℃、50℃下加熱1 h后，抑菌活性較原液相比并沒有發(fā)生明顯變化，但是當(dāng)溫度上升到70℃時(shí)，溫度對粗提液中的抑菌物質(zhì)有明顯影響，此時(shí)，對黃瓜灰霉病菌的抑菌率較未處理液降低了約10%，且隨著溫度的繼續(xù)升高，抑菌率呈明顯下降的趨勢。這說明，粗提液中的抑菌物質(zhì)在低溫下有較好的穩(wěn)定性，對黃瓜灰霉病菌能夠保持較強(qiáng)的抑制作用，但是在受熱溫度較高時(shí)，抑菌物質(zhì)抑菌效果明顯變差，抑菌效果降低。

2.2　粗提液的酸堿穩(wěn)定性

將菌株F170062發(fā)酵粗提液在不同pH值條件下放置2 h后，調(diào)回原始的pH值，測定抑菌活性，結(jié)果如表3所示。

表3　F170062粗提液的酸堿穩(wěn)定性

由表3可知，F(xiàn)170062發(fā)酵粗提液在酸性和堿性條件下，其抑菌活性并沒有發(fā)生明顯變化，特別是在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境中，其抑菌物質(zhì)的活性與未處理液相比，仍能保持較強(qiáng)的抑菌率。這說明，F(xiàn)170062粗提液的酸堿穩(wěn)定性較好，能夠適應(yīng)酸堿環(huán)境的變化。

2.3　粗提液的紫外穩(wěn)定性

無菌條件下將F170062發(fā)酵粗提液用25W紫外燈照射不同時(shí)間后測定抑菌活性，結(jié)果如表4所示。

表4　F170062粗提液的紫外穩(wěn)定性

如表4所示，經(jīng)紫外線照射1、3、5、7、9 h后，F(xiàn)170062發(fā)酵粗提液的抑菌活性與未處理液相比沒有發(fā)生顯著變化，這說明，F(xiàn)170062發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)有較強(qiáng)的紫外穩(wěn)定性。紫外穩(wěn)定性對抑菌物質(zhì)的開發(fā)與使用至關(guān)重要。農(nóng)藥的施用多在自然條件下進(jìn)行，如果抑菌物質(zhì)在紫外線照射下不穩(wěn)定，藥效就會(huì)顯著降低，影響農(nóng)藥的使用效果[7]。F170062發(fā)酵液中的抑菌物質(zhì)紫外穩(wěn)定性較好，有著良好的生物農(nóng)藥開發(fā)前景。

2.4　粗提液投加量的影響

無菌條件下，分別取10、20、50、100、150、200、300、400、500μL發(fā)酵粗提液于培養(yǎng)皿中，以無菌水為對照，通過有毒介質(zhì)法測定其抑菌活性，結(jié)果如表5所示。

表5　F170062粗提液投加量的影響

由表5可知，隨著F170062粗提液投加量的增加，對黃瓜灰霉菌的抑制率呈逐漸上升的趨勢，抑菌率從24.58%提升到92.50%，當(dāng)粗提液投加量增加到500μL時(shí)，黃瓜灰霉病病菌已無法正常生長，這說明F170062發(fā)酵粗提液對黃瓜灰霉病菌有較好的抑菌效果。

2.5　粗提液抑菌物質(zhì)粗提活性初探

由于發(fā)酵粗提液中成分復(fù)雜，包括發(fā)酵液中未利用完的培養(yǎng)基組分和各種各樣的發(fā)酵代謝產(chǎn)物，所以為方便后期抑菌物質(zhì)的提取，采用紙片法探索抑菌物質(zhì)合適的提取方法，并對發(fā)酵液中的粗提活性進(jìn)行考察，其結(jié)果如圖1所示。

圖1　F170062粗提液紙片法試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知，編號為6、7、10、15、16紙片周圍都有明顯的抑菌圈，其中，6：pH值=7 正丁醇萃取相；7：pH值=7乙酸乙酯萃余相；10：pH值=10、正丁醇萃取相；15：pH值=10沸水處理；16：未處理粗提液。試驗(yàn)結(jié)果說明以上編號的紙片中含有F170062粗提液的抑菌物質(zhì)。根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果可得出結(jié)論：(1)抑菌物質(zhì)在中性和堿性條件下能夠被正丁醇萃取出來；(2)抑菌物質(zhì)難以被乙酸乙酯萃取出來；(3)抑菌物質(zhì)在堿性條件下經(jīng)過沸水15min加熱處理后仍具有抑菌活性。

3　結(jié)論

通過對F170062菌發(fā)酵粗提液的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、粗提液加入量的考察發(fā)現(xiàn)，菌株F170062發(fā)酵粗提液在50℃以下有較好的抑菌效果，當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，發(fā)酵粗提液的抑菌活性開始下降，但是發(fā)酵粗提液經(jīng)100℃處理后仍有抑菌活性；發(fā)酵粗提液在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿的環(huán)境下和紫外輻照條件下具有較好的抑菌穩(wěn)定性，抑菌效果與未處理液相差不大；隨著發(fā)酵粗提液加入量的增大，抑菌物質(zhì)對黃瓜灰霉病菌的抑制能力呈逐漸增強(qiáng)的趨勢，當(dāng)發(fā)酵粗提液加入量增加到500μL時(shí)，黃瓜灰霉病菌已經(jīng)無法生長了；通過紙片法對F170062發(fā)酵粗提液的粗提活性進(jìn)行初探發(fā)現(xiàn)，在中性和堿性條件下發(fā)酵粗提液的抑菌物質(zhì)能夠被正丁醇萃取出來，這為以后F170062發(fā)酵粗提液中抑菌物質(zhì)的提取方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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