玉米赤霉烯酮對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞凋亡蛋白釋放的影響及NAC的保護(hù)效應(yīng)

薛畫眉， 郭宏元， 王光光， 鄒　輝， 袁　燕， 顧建紅， 劉學(xué)忠， 劉宗平，2， 卞建春，2

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009)

玉米赤霉烯酮(zearalenone，簡稱ZEA)在全世界動(dòng)物飼料和人類糧食中普遍存在，它主要是由鐮刀菌污染而產(chǎn)生的一種非甾體雌激素類霉菌毒素[1]。據(jù)報(bào)道，玉米及飼料中ZEA的超標(biāo)能夠引起公豬性欲下降，血清中睪酮含量急劇降低，導(dǎo)致睪丸的病理性萎縮，精子發(fā)生障礙，甚至出現(xiàn)雌性化等病變[2]。睪丸支持細(xì)胞(sertoli cell，簡稱SC)在雄性動(dòng)物精子發(fā)生過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，精子的發(fā)生障礙與睪丸支持細(xì)胞受損密切相關(guān)。睪丸支持細(xì)胞是眾多環(huán)境污染物作用于雄性生殖系統(tǒng)的靶細(xì)胞[3]。靶向破壞睪丸支持細(xì)胞將導(dǎo)致生精細(xì)胞快速、大量非生理性死亡[4]。因此，研究ZEA對(duì)睪丸支持細(xì)胞的損害作用及其機(jī)制，對(duì)揭示ZEA雄性生殖毒性機(jī)制具有重要作用。本試驗(yàn)以不同濃度的ZEA處理大鼠原代睪丸支持細(xì)胞24 h，觀察ZEA對(duì)睪丸支持細(xì)胞線粒體凋亡蛋白Cyt C、AIF釋放的影響和NAC對(duì)ZEA引起的睪丸支持細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響，為揭示ZEA的雄性生殖毒性機(jī)制及ZEA中毒的防控提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗(yàn)動(dòng)物

18～21 d 清潔級(jí)Wistar大鼠(由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供)。

1.2　主要試劑

玉米赤霉烯酮，購自美國Sigma公司；胎牛血清(FBS)、DMEM/F-12培養(yǎng)基等試劑，購自美國Gibco公司；胰蛋白酶等試劑，購自美國Amresco公司；L-谷氨酰胺、青鏈霉素等試劑，購自美國Boston Biomedical公司；AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒，購自美國BD公司； Bax、Bcl-2、Cyt C、AIF、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9等單克隆抗體和辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG，均購自美國CST公司；硝酸纖維素膜，購自美國Pall Corporation公司； BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和ECL化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒，購自美國Thermo公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3　大鼠原代支持細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

取18～21 d Wistar雄性大鼠，脫頸處死后，無菌操作取出雙側(cè)睪丸，置于預(yù)冷的無菌磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中并轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)操作。用預(yù)冷的PBS將睪丸沖洗3遍后，將睪丸置于直徑100 mm的玻璃平皿中，用眼科鑷撕去周圍脂肪組織及精索，再用眼科剪和眼科鑷小心剝?nèi)グ啄ぜ皟?nèi)部較大血管，并用眼科鑷輕輕將曲細(xì)精管拉散，置于0.25%胰蛋白酶溶液中，密封后在水浴搖床中于150 r/min 37℃消化15 min至組織碎塊呈線索狀，加入等體積含血清PBS溶液終止消化，800 r/min、4 ℃ 離心10 min。棄去上清液體，加入0.5%膠原酶溶液，密封后在水浴搖床中于150 r/min 37 ℃消化15 min，至酶液呈黏液狀，加入等量含10%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，用100目的網(wǎng)篩進(jìn)行過濾，將濾液于800 r/min、4 ℃離心 10 min。離心后用DMEM/F-12培養(yǎng)基重懸，重復(fù)清洗3次即可，于5%CO2、37 ℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)支持細(xì)胞的純化采用低滲處理法[5]，細(xì)胞培養(yǎng)24 d后，吸去培養(yǎng)基，用PBS清洗1次后，加入pH值為7.4的20 mmol/L Tris-HCl 處理3 min，吸去處理液，用PBS清洗3次，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4　細(xì)胞染毒和線粒體及胞漿中AIF、Cytc C蛋白的制備

以不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)ZEA處理睪丸支持細(xì)胞24 h后，用0.25%胰酶消化5 min，離心收集細(xì)胞不少于1.0×107個(gè)(1 200 r/min，5 min，4 ℃)，用4 ℃預(yù)冷PBS將細(xì)胞洗滌2次。加入300 μL Mito-Cyto Buffer重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移入玻璃勻漿器中，研磨80次(4 ℃冰上操作)。將勻漿液轉(zhuǎn)移至4 ℃預(yù)冷的1.5 mL EP離心管中，離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，沉淀即為線粒體，上清為胞漿蛋白；將上清收集至1.5 mL EP離心管中。沉淀中加入 100 μL 線粒體裂解緩沖液，于冰上裂解30 min，離心(12 000 r/min，10 min，4 ℃)，收集上清，即得線粒體蛋白，用BCA法測(cè)胞漿蛋白及線粒體蛋白濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5　NAC對(duì)ZEA致睪丸支持細(xì)胞凋亡的影響

以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于六孔板中，添加NAC(0、20 μmol/L ZEA，100 μmol/L NAC，20 μmol/L ZEA+100 μmol/L NAC)處理24 h后，用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒檢測(cè)SC細(xì)胞凋亡情況。分別設(shè)空白組(未加染料)、PI單染組、FITC單染組和處理組(PI和FITC雙染)。預(yù)先將10×Binding Buffer 加DDW稀釋成1×Binding Buffer，備用；用0.25%胰酶消化3 min，收集細(xì)胞(1 500 r/min，5 min，4 ℃)預(yù)冷1×PBS洗滌細(xì)胞，離心后加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入AnnexinV-FITC和PI各5 μL單獨(dú)或聯(lián)合作用，37 ℃避光反應(yīng)15 min，200目尼龍網(wǎng)過濾，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

同樣方法添加NAC處理24 h后(分組同上)，收集染毒后的睪丸支持細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，用細(xì)胞裂解液冰浴裂解細(xì)胞30 min，超聲波細(xì)胞破碎儀裂解30 s，12 000 r/min 離心10 min取上清，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，-80 ℃ 保存?zhèn)溆?，以測(cè)定調(diào)控凋亡蛋白Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等的表達(dá)量。

1.6　Western Blot法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)以上保存樣品的凋亡相關(guān)蛋白Cyt C和AIF的釋放量及Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達(dá)水平，同時(shí)檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

蛋白樣品上樣10 μL/孔，Bench Marker 5 μL，其余孔內(nèi)加10 μL 1×Loading Buffer，濃縮膠140 V、20 min，分離膠 110 V、100 min，根據(jù)marker指示，確定停止時(shí)間。置于電轉(zhuǎn)液中，轉(zhuǎn)膜120 V，90 min。用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗2次，吸盡液體后，加入稀釋好的一抗(表1)，4 ℃孵育過夜；隔日回收一抗，用TBST洗滌5次，每次5 min，加入稀釋好的二抗，室溫孵育2 h，用TBST洗滌5 次。

表1　一抗稀釋比例及所用稀釋液

用ECL檢測(cè)液發(fā)光顯影定影。

1.7　數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2　結(jié)果與分析

2.1　ZEA對(duì)睪丸支持細(xì)胞線粒體AIF和Cyt C釋放的影響

用0、5、10、20 μmol/L ZEA處理睪丸支持細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，隨著ZEA濃度的增加，胞漿中AIF和Cyt C的釋放量增加，線粒體中AIF和Cyt C的表達(dá)量減少。分析灰度值見圖1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，線粒體中Cyt C表達(dá)量呈現(xiàn)出 5 μmol/L ZEA處理組顯著下降(P<0.05)和10、20 μmol/L ZEA處理組極顯著下降(P<0.01)；各染毒組線粒體中AIF表達(dá)量均極顯著下降(P<0.01)；胞漿中Cyt C呈現(xiàn)出 10 μmol/L ZEA處理組顯著上升(P<0.05)和20 μmol/L ZEA處理組極顯著上升(P<0.01)；10、20 μmol/L ZEA處理組胞漿中AIF表達(dá)量呈極顯著上升(P<0.01)，呈現(xiàn)“劑量-效應(yīng)”關(guān)系。

2.2　NAC對(duì)ZEA致睪丸支持細(xì)胞凋亡的影響

用100 μmol/L NAC預(yù)處理睪丸支持細(xì)胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。圖2結(jié)果顯示，與20 μmol/L ZEA處理組相比，NAC與ZEA共處理組R5象限凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。與ZEA單獨(dú)處理組相比，NAC與ZEA共處理組凋亡率極顯著降低(P<0.01)。

2.3　NAC對(duì)ZEA致睪丸支持細(xì)胞Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)調(diào)控

用100 μmol/L NAC預(yù)處理睪丸支持細(xì)胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細(xì)胞24 h，用Western Blot法檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)變化情況見圖3。結(jié)果顯示，與20 μmol/L ZEA單獨(dú)處理組相比，100 μmol/L NAC與 20 μmol/L ZEA聯(lián)合處理組Bcl-2/Bax值有極顯著升高(P<0.01)。

2.4　NAC對(duì)ZEA致睪丸支持細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9蛋白活化的調(diào)控

用100 μmol/L NAC預(yù)處理睪丸支持細(xì)胞30 min后，用20 μmol/L ZEA作用睪丸支持細(xì)胞24 h，用Western Blot法檢測(cè)cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)變化情況。圖4結(jié)果顯示，與20 μmol/L ZEA單獨(dú)處理組相比，100 μmol/L NAC與20 μmol/L ZEA聯(lián)合處理組cleaved-Caspase-9、cleaved-Caspase-3表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)。

3　討論

Cyt C是由亞鐵血紅素和多肽組成的一種可溶性色素蛋白，作為線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，與富含不飽和脂肪酸的線粒體內(nèi)膜外側(cè)的磷脂結(jié)合，呈點(diǎn)狀分布，在生理?xiàng)l件下限制其自由穿透線粒體外膜。凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體中的細(xì)胞色素C將被釋放到細(xì)胞漿中，激活caspase級(jí)聯(lián)蛋白，加劇凋亡的進(jìn)行，釋放的細(xì)胞色素C活化Caspase-9，進(jìn)一步激活凋亡家族中的關(guān)鍵性蛋白Caspase-3。ZEA誘導(dǎo)人類肝細(xì)胞發(fā)生caspase依賴的線粒體介導(dǎo)的凋亡，其中活性氧(reactive oxygen species，簡稱ROS)的產(chǎn)生在線粒體畸變和Cyt C的釋放中起著關(guān)鍵作用[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZEA處理睪丸支持細(xì)胞能夠?qū)е戮€粒體中Cyt C釋放到胞漿中。AIF在凋亡發(fā)生過程中調(diào)控線粒體膜的通透性，位于線粒體外膜內(nèi)。在線粒體遭到損傷刺激時(shí)，轉(zhuǎn)移至胞漿和細(xì)胞核中，參與凋亡進(jìn)程。Yu等研究證實(shí)，ZEA通過調(diào)控RAW264.7中AIF的釋放而介導(dǎo)caspase非依賴凋亡的進(jìn)程，在ZEA誘導(dǎo)山羊間質(zhì)細(xì)胞發(fā)生凋亡中AIF起到了關(guān)鍵性作用，Cyt C一般涉及caspase依賴的細(xì)胞凋亡，而AIF和End G在caspase非依賴凋亡中發(fā)揮著重要作用[8-10]。本試驗(yàn)中，AIF隨ZEA濃度的升高，在線粒體中的表達(dá)量降低，在相應(yīng)的胞漿中的表達(dá)量遞增。說明caspase依賴和caspase非依賴性凋亡信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)ZEA誘導(dǎo)睪丸支持細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

NAC在致神經(jīng)元死亡的體內(nèi)和體外模型中均起到保護(hù)作用[11]。GHhosh等研究表明，在黑色素瘤細(xì)胞中，用ROS特異性清除劑NAC阻斷ROS的生成，可抑制ROS誘導(dǎo)的Bax表達(dá)量上升和Bcl-2表達(dá)量下降[12]。在敗血癥和急性肺損傷模型試驗(yàn)中，口服NAC(150 mg/kg)的適當(dāng)劑量能夠降低肺組織中Caspase-3的表達(dá)[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗氧化劑NAC能夠明顯抑制因ZEA暴露引起的睪丸支持細(xì)胞凋亡發(fā)生；Bcl-2/Bax值升高，cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3的蛋白表達(dá)量均降低，與相關(guān)研究存在一致性[14]。NAC顯著降低睪丸支持細(xì)胞因ZEA引起的氧化損傷，線粒體得到了有效保護(hù)。Bcl-2基因產(chǎn)物大量存在于活性氧產(chǎn)生的關(guān)鍵場(chǎng)所——線粒體內(nèi)膜，Bcl-2的上調(diào)使線粒體膜免于脂質(zhì)過氧化的損傷；Bcl-2的表達(dá)量回升，可以有效地抑制Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白表達(dá)；Bax的下調(diào)，使線粒體膜的通透性維持穩(wěn)態(tài)，從而阻斷ZEA激活線粒體凋亡通路，延緩ZEA引起的睪丸支持細(xì)胞凋亡發(fā)生。綜上所述，NAC可以對(duì)ZEA誘導(dǎo)的睪丸支持細(xì)胞的凋亡發(fā)生起抑制作用。

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