pH值對葛仙米生理的影響

劉樹文， 羅麗麗

(貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州貴陽 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing)學名擬球狀念珠藻，生長于水稻田中，是我國傳統(tǒng)出口的一種珍貴野生藥食兩用固氮藍藻，營養(yǎng)價值豐富，食用歷史悠久[1]。其蛋白含量較高，含有豐富的人體必需的各種氨基酸、脂肪酸、維生素以及礦質(zhì)元素，并且含有具有藥用價值的各種多糖、色素等，還含有超氧化物歧化酶等生理活性物質(zhì)[1-2]。因此，它在保健食品、食品添加劑、動物飼料、醫(yī)藥、美容以及精細化加工等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應用前景[1-2]。葛仙米在世界范圍內(nèi)分布稀少，主要分布在我國湖北省鶴峰縣走馬鎮(zhèn)[1]，目前國內(nèi)外對葛仙米的研究相對較少，對其開發(fā)利用也沒有像小球藻、螺旋藻和鹽藻那樣已實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[2]。為了合理地開發(fā)利用葛仙米這種珍稀食品，對葛仙米的人工培養(yǎng)條件及生理特性的研究意義重大。

一些研究表明，水體的pH值影響藻類生長和生理代謝以及藻類種群的演替，不同的藻類有不同的pH值適應范圍[3-8]。pH值會影響藻類對無機碳及鐵等微量元素在水體中的存在形式，進而影響藻類對無機碳和鐵等微量元素的吸收利用[8]，藻類在生長過程中也會改變水體pH值[9]。水體pH值增加通常會引起藍藻占優(yōu)勢[10]。薛凌展等研究表明，銅綠微囊藻適合生長的pH值為8～11，最佳pH值為9；而普通小球藻適合生長的pH值為7～9，最佳pH值為8[11]。共同培養(yǎng)的試驗結(jié)果顯示堿性環(huán)境中銅綠微囊藻的競爭優(yōu)勢強于普通小球藻[11]。

本研究比較了不同pH值(6.0、7.0、8.0)對葛仙米生長以及各種光合色素、可溶性糖、可溶性蛋白含量等方面的生理影響差異，并在培養(yǎng)液中加入pH值緩沖劑固定葛仙米生長過程中的pH值，旨在發(fā)現(xiàn)人工培養(yǎng)野生葛仙米的最適合pH值，為野生葛仙米的規(guī)?；B(yǎng)殖提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

2015年4月從貴州省岑鞏縣開本鄉(xiāng)沈家灣村采集得到新鮮野生葛仙米球形體。先將葛仙米球形體用無菌的蒸餾水沖洗干凈，再用75%乙醇溶液浸泡30 s，去雜藻雜菌，然后用無菌BG110培養(yǎng)液(不含NaNO3的BG11培養(yǎng)基)清洗3次。再放入葛仙米群體質(zhì)量1倍的BG110培養(yǎng)液，用玻璃勻漿器勻漿成絲狀藻漿，然后用無菌BG110培養(yǎng)液稀釋。培養(yǎng)溫度為 25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度為1 500 lux。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為 300 mL/min。經(jīng)過15 d的培養(yǎng)，得到無雜菌和雜藻的野生葛仙米藻種。

1.2　培養(yǎng)條件

葛仙米的培養(yǎng)采用BG110培養(yǎng)基，配制BG110時加入BICINE(N,N-二羥乙基甘氨酸)生物緩沖劑，緩沖劑濃度為20 mmol/L[8]，用0.1、1.0 mol/L HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)BG110培養(yǎng)基pH值為 6.0、7.0、8.0，在121 ℃下滅菌30 min。藻種經(jīng)過勻漿之后分別接種到高壓滅菌后的9個500 mL錐形瓶，分別加入pH值為6.0、7.0、8.0的BG110培養(yǎng)基，藻液總體積為 450 mL/瓶，初始接種量按照葉綠素含量450 μg/mL。每組pH值條件設(shè)置3個重復。培養(yǎng)溫度為25 ℃，用30 W日光燈提供光照，光照度為1 500 lx。用空氣泵通入用0.22 μm濾膜過濾的無菌空氣，通氣量為300 mL/min，經(jīng)過10 d光照培養(yǎng)。

1.3　生長曲線的制作和比生長速率的測定

在葛仙米的生長過程中，每隔1 d取1次藻液。培養(yǎng)液pH值為6.0、7.0、8.0的培養(yǎng)瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min 離心30 min，倒掉上清液，加入4 mL 95%乙醇，振蕩，4 ℃冰箱中避光放置24 h。4 000 r/min離心30 min，取上清液，用分光光度計分別測定665、649 nm波長的吸光度D665 nm、D649 nm。根據(jù)以下公式計算葉綠素a(Chlorophyll a，Chla)含量(μg/mL)[12]：Chla=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm。繪制時間(d)、葉綠素含量(μg/mL)的生長曲線圖。比生長速率μ的計算依據(jù)公式μ=(lnx1-lnx2)/(T2-T1)，其中x1和x2分別為培養(yǎng)后0、10 d的葉綠素a含量(μg/mL)，T1、T2分別為培養(yǎng)后0、10 d。

1.4　各種主要光合色素含量的測定

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中按照“1.2”節(jié)的方法取樣和提取色素，用分光光度計分別測定665、649、447 nm波長的吸光度D665 nm、D649 nm、D470 nm。計算葉綠素a與類胡蘿卜素(carotenoids，Car)含量，其中Car含量的計算依據(jù)公式[12]：Car=1 000×D470 nm-2.05×Chl a。

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，用分光光度計分別測定上清液在562、615、652 nm波長的吸光度D562 nm、D615 nm、D652 nm。計算藻藍蛋白(pycocyanin，PC)、別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)、藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)的含量。根據(jù)Siegelman等的公式[13]計算：PC(mg/mL)=(D615 nm-0.474×D652 nm)/5.34；APC(mg/mL)=(D652 nm-0.208×D615 nm)/5.09；PE(mg/mL)=(D562 nm-2.41×PC-0.849×APC)/9.62。

1.5　蛋白質(zhì)含量的測定

從培養(yǎng)10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值為7.0的0.1 mol/L磷酸緩沖液，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，用考馬斯亮藍法測定各樣品中蛋白質(zhì)的濃度[12]。

1.6　可溶性糖含量的測定

培養(yǎng)10 d的各瓶葛仙米藻液各取20 mL的藻液，4 000 r/min 離心30 min，去上清液，各加入4 mL蒸餾水，冰浴勻漿90次，4 000 r/min離心30 min。取上清液，蒽酮試劑法測定各樣品中可溶性糖濃度[13]。

1.7　統(tǒng)計分析

本試驗主要利用軟件STATISTICA?7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)進行統(tǒng)計分析處理。單因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s顯著性檢驗(HSD)用來檢測不同處理間的顯著性水平。Lilliefors檢驗和Levene檢驗分別用來檢驗正態(tài)分布和方差同質(zhì)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同pH值條件下葛仙米的生長

研究顯示，葛仙米分別在6.0、7.0，8.0 pH值條件下培養(yǎng)10 d后，以葉綠素濃度表示的生物量分別增加到培養(yǎng)后0 d的6.61、9.21、7.47倍(圖1)。當pH值為7.0時，葛仙米的比生長速率顯著高于其他2種不同pH值條件下葛仙米的比生長速率(Tukey’s HSD，P<0.05)，pH值為8.0時葛仙米的生長速率略高于pH值為6.0培養(yǎng)條件下葛仙米的比生長速率，但2者之間無顯著差異(Tukey’s HSD，P>0.05) (表1)。

表1　在不同pH值葛仙米的比生長速率

注：不同的小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。表2、表3同。

2.2　不同pH值條件下葛仙米的光合色素含量的變化

研究顯示，pH值對葛仙米PC、APC、PE含量以及Chla含量、Car含量有不同影響(表2、表3)。當pH值為7.0時，葛仙米的各種光合色素的含量最高，pH值為8.0時的葛仙米各種光合色素的含量高于pH值為6.0時，且都有顯著差異(Tukey’s HSD，P<0.05)。當pH值為7.0時，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car的含量分別為pH值為8.0和6.0時葛仙米的光合色素含量的1.37、1.57、1.41、1.12、1.18倍和2.14、3.12、2.30、1.32、1.34倍。

表2　不同pH值條件下葛仙米的PC、APC、PE的含量

表3　不同pH值條件下葛仙米的Chla和Car含量

2.3　不同條件下葛仙米的可溶性蛋白含量的變化

研究發(fā)現(xiàn)，pH值對葛仙米的可溶性蛋白含量有影響。當pH值為7.0時，葛仙米的可溶性蛋白質(zhì)含量顯著高于pH值為8.0、6.0時葛仙米的可溶性蛋白含量，分別是pH值為 8.0、6.0時的1.3、2.0倍。當pH值為7.0時，葛仙米的可溶性蛋白含量最高，pH值為8.0時葛仙米的可溶性蛋白含量高于pH值6.0時，且都有顯著差異(Tukey’s HSD，P<0.05，圖2)。

2.4　不同pH值條件下可溶性糖含量的變化

研究發(fā)現(xiàn)，pH值對葛仙米可溶性糖含量有影響(圖3)。當pH值為7.0時，葛仙米的可溶性糖含量顯著高于pH值為 8.0、6.0時葛仙米的可溶性糖含量。pH值為8.0時葛仙米的可溶性糖含量略高于pH值為6.0時葛仙米的可溶性糖含量，但兩者之間無顯著差異(Tukey’s HSD，P>0.05)。

3　結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，當培養(yǎng)液中pH值為7.0時，培養(yǎng)10 d后以葉綠素含量表示的葛仙米生物量增長幅度和比生長速率最大，各種光合色素、可溶性糖及可溶性蛋白質(zhì)含量最高，當培養(yǎng)液中的pH值為8.0時上述各項生理指標高于培養(yǎng)液pH值為6.0時的上述各項生理指標。因此，pH值為7.0的培養(yǎng)液比較適合貴州野生葛仙米的人工養(yǎng)殖。

劉繼勇對湖北省走馬鎮(zhèn)的葛仙米資源及葛仙米生長的環(huán)境條件進行調(diào)查研究，結(jié)果表明，適于葛仙米生長的灌溉水源pH值為6.2～6.3[14]。但該研究并未調(diào)查葛仙米生長水體的pH值，葛仙米生長水體的pH值會受到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響，如農(nóng)業(yè)生產(chǎn)施肥以化肥為主的碳銨等肥料的使用會改變土壤及農(nóng)田水體的酸堿度[1]。程超等在葛仙米生長及繁殖條件的探討的研究中以葛仙米的生長曲線總結(jié)得出，葛仙米最適生長pH值為6.0～7.5，pH值過高或過低都會影響它的生長及顏色[15]。在一定范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，葛仙米的顏色會加深，直至pH值升至7.5，但該研究沒有考慮葛仙米生長過程中pH值的變化[15]。藻類的種群密度和生理代謝活動都會影響水體的pH值，藻類生長過程中水體的pH值是不斷發(fā)生變化的[9]。本研究通過pH值緩沖劑固定培養(yǎng)液的pH值，得到固定pH值條件下葛仙米的各項生理指標。

溶解在水體中的HCO3-、CO32-、CO2都是藻類可以直接或間接吸收利用的無機碳形式。pH值會影響到培養(yǎng)液中CO2溶解度以及HCO3-、CO32-、CO2三者之間的解離平衡，進而影響藻類對無機碳的吸收利用效率及光合作用速率[9]。CO2是藻類易于吸收的形式，pH值升高使水體中溶解的CO2含量降低而HCO3-含量升高。但pH值降低，水體中總無機碳含量降低[16]。鐵等微量金屬元素在藻類光合和呼吸等代謝過程中起重要作用，pH值還影響水體中Fe(OH)3、Fe2+、Fe3+之間的相互轉(zhuǎn)化，從而影響藻類對鐵的吸收利用[16]。因此，pH值為6.0時葛仙米的各項生理指標較pH值為7.0時低，可能是因為培養(yǎng)液中總無機碳濃度較低，影響了葛仙米的光合固碳。pH值為8.0時葛仙米的各項生理指標也較pH值為7.0時低，可能是因為pH值升高導致水體中可利用鐵含量降低。

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