張 貝，白衛(wèi)東，2，馮衛(wèi)華，2*，曾曉房，2，于立梅，韓 珍，陳利紅

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東廣州 510225；2.廣東中興綠豐發(fā)展有限公司，廣東河源 517000；3.廣東省梅州市飛龍果業(yè)有限公司，廣東梅州 514000)

檸檬是蕓香科柑橘屬的主要品種，它富含維生素 C、檸檬橙和鈉元素等，經(jīng)常食用檸檬可以防止消化不良、降脂、預(yù)防腫瘤和改善血液循環(huán)等功效，因此，檸檬也被稱(chēng)為世界上最有藥用價(jià)值的水果之一[1]。我國(guó)是檸檬種植最大的地區(qū)，檸檬的產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，但由于檸檬皮與籽含有苦味，通常被當(dāng)作生活垃圾丟棄。隨著國(guó)內(nèi)外學(xué)者的深入研究，發(fā)現(xiàn)檸檬皮與籽中的檸檬苦素含量豐富，檸檬苦素是植物次生代謝時(shí)生成的一類(lèi)含呋喃環(huán)且高度氧化的四環(huán)三萜類(lèi)化合物，存在于柑橘屬多種植物中，迄今為止已分離出大約300種檸檬苦素類(lèi)化合物[2]，據(jù)研究表明有明顯的抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗炎等藥理作用[3]，也是引起柑橘類(lèi)果汁味苦的主要物質(zhì)[4]。研究人員已從柑橘屬中分離出37種檸檬苦素類(lèi)似物和22種配糖體[5-6]。目前，人們對(duì)檸檬苦素的研究主要集中在蕓香科植物各種屬及不同部位檸檬苦素的提取工藝、含量、抑菌活性、抗氧化性及其在食品工業(yè)應(yīng)用等方面，檸檬苦素和其他檸檬苦素類(lèi)化合物均可作為大部分農(nóng)作物的殺蟲(chóng)劑、拒食劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，而這些檸檬苦素類(lèi)化合物還可提高其他生物殺蟲(chóng)劑和常規(guī)殺蟲(chóng)劑的效果[7-9]。

目前，我國(guó)對(duì)于檸檬苦素的研究還處于初級(jí)階段，研究主要集中在檸檬苦素在植物各組分中的含量及其抗氧化性、抑菌性等方面。日本、美國(guó)已報(bào)道了檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)制作功能性食品和飲料的專(zhuān)利，我國(guó)對(duì)其生理活性和開(kāi)發(fā)利用的報(bào)道甚少，而檸檬苦素在市場(chǎng)上的需求卻明顯增加，所以開(kāi)發(fā)檸檬苦素具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。筆者利用正交優(yōu)化方案，得到一種高效快速在檸檬果皮中提取檸檬苦素的方法，同時(shí)以其提取液對(duì)7種菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)篩選，旨在為檸檬的開(kāi)發(fā)利用和檸檬苦素的高效提取提供理論依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。檸檬皮粉，由廣東中興綠豐發(fā)展有限公司提供。檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品、石油醚、無(wú)水乙醇、對(duì)-二甲氨基苯甲醇、濃硫酸、三氯化鐵、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉。細(xì)菌：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基；霉菌：PDA培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基。

1.1.2主要儀器。電子天平、電熱干燥箱、UV759紫外可見(jiàn)分光光度儀、THZ-82冷凍水浴恒溫振蕩器、牛津杯、無(wú)菌超凈工作臺(tái)、BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器、SP-250生化培養(yǎng)箱、SPH-103B恒溫培養(yǎng)搖床。

1.2提取方法

1.2.1提取工藝流程。新鮮檸檬皮烘干→磨粉，過(guò)40目篩→60 ℃石油醚浸泡2 h脫脂→90%乙醇浸提→真空旋蒸→二氯甲烷除雜→旋蒸得結(jié)晶。

1.2.2正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以乙醇為提取劑，以提取劑濃度、提取料液比和浸提時(shí)間3個(gè)單因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，所得檸檬苦素提取液以檸檬苦素含量為指標(biāo)確定最佳提取工藝，正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

1.2.3顯色劑Ehrlich試劑的配制。A液：準(zhǔn)確稱(chēng)取125 mg 對(duì)-二甲氨基苯甲醛溶于100 mL硫酸乙醇溶液中(濃硫酸65 mL，無(wú)水乙醇35 mL，放冷使用)；B液：準(zhǔn)確稱(chēng)取三氯化鐵9.0 g，蒸餾水定容至100 mL。使用時(shí)在A液中加入0.05 mL B液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4檸檬苦素含量的測(cè)定。檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品以無(wú)水乙醇配成250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在6支試管中分別加入0、0.5、0.8、1.2、1.5、2.0標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入無(wú)水乙醇至2.0 mL，再分別加入5.0 mL顯色試劑Ehrlich試劑搖勻，在室內(nèi)靜置30 min避免陽(yáng)光直射，在波長(zhǎng)500 nm下測(cè)定分光度。以檸檬苦素空白為參比，測(cè)定其吸光度，以檸檬苦素含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3抑菌性試驗(yàn)

1.3.1菌懸液制備。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和枯草芽孢桿菌接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)1 d備用，將根霉、青霉和黑曲霉接種到馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基中，于28 ℃下培養(yǎng)2 d備用。

1.3.2抑菌試驗(yàn)。 牛津杯法：用無(wú)菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養(yǎng)基在無(wú)菌培養(yǎng)基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養(yǎng)基凝固后，取對(duì)角位置安放4個(gè)滅菌的牛津杯，分別加入20 μL檸檬苦素，分別在28和37 ℃下培養(yǎng)1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復(fù)3次取平均值。

1.3.3紫外線對(duì)抑菌活性的影響。用無(wú)菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養(yǎng)基在無(wú)菌培養(yǎng)基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養(yǎng)基凝固后，取對(duì)角位置安放4個(gè)滅菌的牛津杯，分別加入在紫外線下處理0、10、15、20、25、30 min的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養(yǎng)1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復(fù)3次取平均值。

1.3.4pH對(duì)抑菌活性的影響。用無(wú)菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養(yǎng)基在無(wú)菌培養(yǎng)基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養(yǎng)基凝固后，取對(duì)角位置安放4個(gè)滅菌的牛津杯，分別加入將pH調(diào)為2.7、4.0、6.0、8.0的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養(yǎng)1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復(fù)3次取平均值。

1.3.5溫度對(duì)抑菌活性的影響。用無(wú)菌移液槍取1 mL菌懸液與50 ℃已滅菌的10 mL培養(yǎng)基在無(wú)菌培養(yǎng)基中，充分搖晃混勻，常溫下靜置至培養(yǎng)基凝固后，取對(duì)角位置安放4個(gè)滅菌的牛津杯，分別加入經(jīng)常溫、45、60、80、121 ℃熱處理15 min的最小抑菌濃度的檸檬苦素提取液20 μL，分別在28和37 ℃下培養(yǎng)1和2 d，觀察抑菌圈直徑大小，重復(fù)3次取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1提取正交試驗(yàn)結(jié)果取去脂烘干的檸檬皮粉樣品9份，各5 g，以提取劑濃度、提取料液比和浸提時(shí)間3個(gè)單因素做正交提取試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2檸檬果皮中檸檬苦素提取的L9(34)正交試驗(yàn)

Table2OrthogonaltestofL9(34)extractionoflimonininlemonpeel

試驗(yàn)號(hào)TestNo.因素Factor乙醇濃度(A)Ethanolconcentration料液比(B)Solid-liquidratio時(shí)間(C)Extractiontime區(qū)組(D)Block檸檬苦素含量Limonincontentmg/g(DW)1111139.4042122242.7873133343.3554212343.2685223142.2486231242.2357313241.2948321345.3839332147.555k141.84941.32242.34143.069k242.58443.47344.53742.105k344.74444.38242.29942.639R2.8953.0602.2380.964

根據(jù)正交試驗(yàn)可以得出，料液比為影響檸檬苦素提取的最大因素，其次是乙醇濃度，提取時(shí)間又次之，即B>A>C，由于最佳提取條件包括在正交試驗(yàn)9組試驗(yàn)中，所以不需要進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。因此，檸檬苦素最佳提取條件為A3B3C2，即乙醇濃度90%，料液比1∶40(g/mL)，提取時(shí)間 120 min；最優(yōu)提取條件下，檸檬皮粉檸檬苦素的提取理論值為47.555 mg/g(DW)。

2.2抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1最小抑菌濃度確定。將檸檬苦素提取液以二氯甲烷萃取除雜后真空旋蒸，再稀釋成一定倍數(shù)的10%無(wú)水乙醇溶液，以15%無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　各菌種最小抑菌濃度

從表3可以看出，檸檬苦素對(duì)這7種菌都有一定抑制效果，且由抑菌圈直徑大小可以看出對(duì)霉菌的抑制效果遠(yuǎn)大于細(xì)菌。

2.2.2紫外線處理對(duì)抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素在紫外線下處理0、10、15、20、25、30 min，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1　紫外線處理對(duì)抑菌活性的影響Fig.1　Effect of UV treatment on bacteriostatic activity

從圖1可知，隨紫外線處理時(shí)間增加，因紫外線照射破壞了檸檬苦素和細(xì)菌的抑菌活性，導(dǎo)致霉菌抑菌圈直徑呈現(xiàn)出大體下降的趨勢(shì)，而細(xì)菌抑菌圈先下降后在15 min時(shí)回升，但達(dá)不到未處理時(shí)的直徑大小?？赡苁且?yàn)樘崛∫簽榛衔?，紫外線激發(fā)了其他檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的抑菌活性，導(dǎo)致抑菌效果再次增強(qiáng)。由圖1可看出，紫外線處理對(duì)檸檬苦素的抑菌效果影響較大。

2.2.3pH處理對(duì)抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素以緩沖劑調(diào)整pH至2.7、4.0、6.0、8.0，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　pH處理對(duì)抑菌活性的影響Fig.2　Effect of pH treatment on bacteriostatic activity

從圖2可以看出，檸檬苦素在酸性條件下抑菌效果更好，在pH>6以后幾乎對(duì)3種細(xì)菌無(wú)抑制效果，對(duì)霉菌pH偏酸性時(shí)隨pH增大而抑制效果減弱；但在pH>6以后，因使其他抑制劑的活性減弱，提取液中其他物質(zhì)的抑菌效果增強(qiáng)。

2.2.4溫度處理對(duì)抑菌活性的影響。將最小抑菌濃度的檸檬苦素在室溫，分別接種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌、根霉、青霉和黑曲霉，培養(yǎng)一定時(shí)間后，觀察抑菌圈直徑大小，平行3次測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　溫度處理對(duì)抑菌活性的影響Fig.3　Effect of temperature treatment on bacteriostatic activity

從圖3可以看出，隨著溫度逐漸升高，抑制了檸檬苦素的活性，導(dǎo)致檸檬苦素的抑菌效果顯著降低，在80 ℃以后，由于高溫破壞了檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)的活性，已基本失去抑菌效果。

3　結(jié)論

檸檬皮中檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)以90%乙醇溶液在料液比為1∶40(g/mL)、提取溫度為60 ℃、提取120 min的條件下，提取量可達(dá)到47.555 mg/g，對(duì)比令紅艷等[7]的研究結(jié)果萃取溫度為188.3 ℃，物料粒徑為71.3目，料液比值為1∶23.3(g/mL)工藝更簡(jiǎn)單快捷，且檸檬苦素提取率更佳。檸檬苦素類(lèi)物質(zhì)抑菌穩(wěn)定性受溫度影響較大，隨著溫度升高對(duì)細(xì)菌霉菌的抑制效果降低，在80 ℃已基本無(wú)效果；對(duì)霉菌的抑制效果受紫外線照射時(shí)間影響，隨照射時(shí)間增加而抑菌活性降低；對(duì)4種細(xì)菌在酸性條件下抑制效果更佳，隨pH上升活性減弱，在pH>6時(shí)基本無(wú)抑制效果。

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