液體糖中還原糖含量測定方法的研究*

陳志穎　徐正康　郭　峰　葉曉蕾　李海燕　周彥斌

（廣州雙橋股份有限公司，廣東廣州　510280）

液體糖以白砂糖、綿白糖、精制的糖蜜或中間制品為原料，經(jīng)加工或轉(zhuǎn)化工藝制煉而成，可替代白砂糖應(yīng)用于食品工業(yè)，在歐美國家，液體糖的生產(chǎn)和應(yīng)用已有悠久的歷史。

液體糖按糖分組成可分為兩大類：全蔗糖糖漿和轉(zhuǎn)化糖漿，其中全蔗糖糖漿的固形物含量≥65.0%，干物質(zhì)中總糖量≥99.5%；轉(zhuǎn)化糖漿固形物含量≥70.0%，干物質(zhì)中總糖量≥99.5%，干物質(zhì)中還原糖≥60.0%。

在QB/T 4093—2010《液體糖》標(biāo)準(zhǔn)中定義了轉(zhuǎn)化糖漿干物質(zhì)中還原糖含量的2種測定方法，分別為QB/T2343.2—2013《赤砂糖試驗方法》中的蘭-艾農(nóng)恒容法和GB/T 18932.22—2003的液相色譜示差折光檢測法，但是未見有關(guān)全蔗糖糖漿干物質(zhì)中還原糖含量測定方法的相關(guān)描述。本文以此為背景，試驗探究轉(zhuǎn)化糖漿干物質(zhì)中還原糖含量的2種測定方法應(yīng)用于全蔗糖糖漿干物質(zhì)中還原糖含量測定的合理性，并提出一種新的檢測方法——離子色譜法，分析比對這3種方法應(yīng)用于全蔗糖糖漿中還原糖含量測定的操作差異性及其檢測結(jié)果的可靠性。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

材料：液體糖（全蔗糖糖漿），廣州雙橋股份有限公司生產(chǎn)。

試劑：蔗糖、草酸鉀、亞甲基藍(lán)、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、碳酸鈉、鹽酸、酚酞、苯甲酸、甲基橙，均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠；果糖、葡萄糖（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)），美國Sigma公司。

1.2　儀器與設(shè)備

DR-A1阿貝折光儀，日本ATAGO株式會社；S210型pH計，美國梅特勒公司；2414高效液相色譜儀，美國waters公司；Rezex系列鈣離子色譜柱（300 mm×7.8 mm），美國Phenomenex公司；AS系列超聲波清洗機(jī)，天津奧特賽恩儀器有限公司；Millipore超純水儀，美國密理博公司；930系列離子色譜儀，瑞士Metrohm公司；DionexTMCarboPacTMPA1分析和保護(hù)柱（4 nm×250 nm），美國Thermo Fisher Scientific公司；AREC.T加熱磁力攪拌器，意大利VELP公司；MCP500高精度數(shù)字式旋光儀，奧地利Anton Paar公司。

1.3　試驗方案

1.3.1　滴定法用試劑準(zhǔn)備

1.3.1.1　10 g/L標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖液

稱取蔗糖23.75 g，用蒸餾水約120 mL溶解并移入250 mL的容量瓶中，加入濃鹽酸9 mL，搖勻，在室溫20℃～25℃下靜置8 d，然后用蒸餾水稀釋至刻度。吸取該溶液100 mL（含10 g轉(zhuǎn)化糖） 于1 000 mL容量瓶中，在不斷搖蕩下，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)pH至3.0（加堿量的確定：另取轉(zhuǎn)化糖液50 mL，以甲基橙作指示劑，以1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定至紅色恰好變?yōu)槌壬珵橹?，所耗用的氫氧化鈉溶液的量乘2即為要加入的堿量），調(diào)節(jié)pH后加入已用熱水溶解的苯甲酸2 g，搖勻，冷卻后稀釋至刻度。此溶液每100 mL含1 g轉(zhuǎn)化糖，可作為穩(wěn)定的貯備液。

1.3.1.2　2.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖液

準(zhǔn)確吸取10 g/L標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖液50 mL，移入200 mL容量瓶中，加酚酞指示液5滴，在不斷搖蕩下滴入0.5 mol/L氫氧化鈉溶液，直至淺紅色出現(xiàn)不褪色為止，加水稀釋至刻度，搖勻。

1.3.1.3　費林氏試劑

費林氏甲液：稱取硫酸銅69.28 g，用蒸餾水溶解后，移入1 000 mL容量瓶中，加入至刻度，搖勻，過濾即成。

費林氏乙液：稱取酒石酸鉀鈉346 g溶于約500 mL蒸餾水中；另稱取氫氧化鈉100 g溶于約200 mL蒸餾水中，將二者混合，移入1 000 mL容量瓶中，加水至刻度，放置2 d。如液面降低，應(yīng)補(bǔ)加至刻度，搖勻，過濾即成。

1.3.1.4　50 g/L草酸鉀溶液

稱取草酸鉀50g加蒸餾水溶解后稀釋至1000mL。

1.3.1.5　10 g/L亞甲基藍(lán)溶液

稱取亞甲基藍(lán)1.0 g，加蒸餾水溶解后定溶于100 mL容量瓶中。

1.3.2　滴定法測定步驟

1.3.2.1　費林試劑的標(biāo)定

用移液管吸取費林氏乙液、甲液各10mL，移入300mL三角瓶中，加入蒸餾水15mL，從滴定管加入2.5g/L標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖溶液39 mL，輕輕搖勻。將三角瓶置于電爐上加熱使溶液沸騰，準(zhǔn)確煮沸2 min，加亞甲基藍(lán)指示液3滴。在糖液保持沸騰的情況下，從滴定管繼續(xù)加轉(zhuǎn)化糖液，至亞甲基藍(lán)色剛剛消失為止，即為終點。整個滴定過程溶液應(yīng)保持沸騰，且滴定終點應(yīng)在加入亞甲基藍(lán)后1 min內(nèi)達(dá)到。如果費林氏溶液濃度準(zhǔn)確，則滴定耗用的2.5 g/L標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖液恰好為40 mL，否則，應(yīng)按以下公式計算其濃度校正系數(shù)：

式中：K——斐林試劑校正系數(shù)；

V——滴定耗用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化糖液體積，mL。

1.3.2.2　樣品干物質(zhì)百分比測定

用玻璃棒加少量樣品于阿貝折光儀的棱鏡面上，立即閉合棱鏡。調(diào)節(jié)使明暗分界線對準(zhǔn)在十字線上，從標(biāo)尺上讀取干物質(zhì)百分濃度，重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，記錄讀數(shù)Brix。

1.3.2.3　樣液制備

稱取液體糖樣品35.0 g于250 mL容量瓶中，精確至0.001 g，記錄實際稱取重量W。用移液管吸取50.0 mL樣液于500 mL容量瓶中，對樣品每1 g干固物加入2 mL的50 g/L草酸鉀溶液，搖勻后用蒸餾水稀釋至刻度，充分搖勻，過濾即可。

1.3.2.4　預(yù)檢

分別用兩支10 mL移液管，先吸取費林氏乙液10 mL于三角瓶內(nèi)，然后再吸甲液10 mL于乙液中，混勻。用滴定管裝滿樣液，調(diào)至刻度，從滴定管預(yù)加入樣液約10mL于三角瓶內(nèi)，再加入蒸餾水15 mL，搖勻，放在電爐上加熱，并準(zhǔn)確煮沸2 min。加入亞甲基藍(lán)指示液3滴～4滴，繼續(xù)滴加糖液至藍(lán)色消失為止，即為終點，整個滴定至終點的過程不超過1 min。記錄滴定耗用配制糖液毫升數(shù)V，計算復(fù)檢中所需加水量等于75 mL減去配制糖液耗用量與費林試劑量20 mL。

1.3.2.5　復(fù)檢

按上述次序吸取費林氏乙液、甲液各10 mL于三角瓶內(nèi)，加入預(yù)檢時測得的加水量，用滴定管裝滿樣液，調(diào)至刻度，從滴定管加入比預(yù)檢耗用量約少1 mL的配制樣液，搖勻。滴定操作和預(yù)檢相同。滴定時輕輕搖動三角瓶，但不可離開熱源，使溶液繼續(xù)保持沸騰，以免空氣進(jìn)入瓶內(nèi)使亞甲基藍(lán)被氧化而產(chǎn)生誤差。

1.3.2.6　旋光儀測定樣品蔗糖含量

取液體糖樣品，將其配制成質(zhì)量濃度為26.0%的待測液100 mL，將待測液倒入旋光儀中，待儀器出數(shù)，重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，記錄樣品蔗糖含量S。

1.3.2.7　計算及結(jié)果表示

配制糖液中含蔗糖量G計算公式如下，單位為g：式中：W——稱取樣品質(zhì)量，g；

V——滴定耗用配制糖液，mL；

S——樣品蔗糖含量，%；

Brix——液體糖試樣的百分比濃度，%。液體糖樣品中干物質(zhì)還原糖含量計算公式如下，以%表示：

式中：R——液體糖試樣還原糖的干物質(zhì)含量，%；

f——校正系數(shù)（由配制糖液中含蔗糖量G查表1得）；

K——費林氏溶液濃度校正系數(shù)。

表1　蘭-艾農(nóng)恒容法測定還原糖校正系數(shù)表

1.3.3　高效液相色譜法測定步驟

1.3.3.1　流動相的配制

超純水：蒸餾水經(jīng)過超純水儀純化，然后用孔徑0.2 μm濾膜過濾，再經(jīng)過超聲波脫氣即可。

1.3.3.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10 g，精確至0.000 1 g，用超純水溶解并定容至100 mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用超純水稀釋上述儲備液至2.5 g/L、5 g/L、10 g/L、25 g/L、50 g/L。

1.3.3.3　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

設(shè)置液相色譜工作參數(shù)：泵流速為0.6 mL/min，柱溫為80℃，檢測器溫度為40℃，靈敏度為16。用0.22 μm的針頭式過濾器及注射器依次吸取不同梯度濃度的工作液，注入進(jìn)樣器，分別制作果糖及葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)≥0.999。

1.3.3.4　待測液的制備與檢測

用玻璃棒蘸取少量液體糖樣品于阿貝折光儀的棱鏡面上，立即閉合棱鏡。調(diào)節(jié)使明暗分界線對準(zhǔn)在十字線上，從標(biāo)尺上讀取干物質(zhì)百分比濃度，重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，記錄讀數(shù)Brix。

準(zhǔn)確稱量2.5 g液體糖樣品，記實際稱取重量為m，用超純水定容至50 mL，制得待測液。用0.22 μm的針頭式過濾器及注射器吸取待測液，注入進(jìn)樣器檢測。重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，分別記錄讀數(shù)為C1和C2，單位為g/L。

1.3.3.5　計算及結(jié)果表示

式中：R——液體糖中還原糖的干物質(zhì)含量，%；

C1——液相色譜測得葡萄糖分結(jié)果，g/L；

C2——液相色譜測得果糖分結(jié)果，g/L；

0.05——定容體積，L；

m——稱取的樣品質(zhì)量，g；

Brix——液體糖試樣百分比濃度，%。

1.3.4　離子色譜儀測定步驟

1.3.4.1　流動相的配制

準(zhǔn)確稱取4.8 g的氫氧化鈉于燒杯中，精確至0.001 g，用一定量超純水溶解后轉(zhuǎn)移至1 000 mL的容量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm的濾膜抽濾，待用。

1.3.4.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

5 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各0.5 g，精確至0.000 1 g，用純水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻，待用。

100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確吸取5 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，用超純水定容至100 mL，搖勻，待用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL、100 μL、250 μL、500 μL、1 000 μL 于 50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾，待用；該系列標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L。

1.3.4.3　繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

設(shè)置離子色譜儀工作參數(shù)：泵流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量20 μL，分析時間為35 min。將上述梯度濃度的工作液轉(zhuǎn)移至樣品管中，放入自動進(jìn)樣器進(jìn)行樣品分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)≥0.999。

1.3.4.4　待測液的制備與檢測

用玻璃棒蘸取少量液體糖樣品于阿貝折光儀的棱鏡面上，立即閉合棱鏡。調(diào)節(jié)使明暗分界線對準(zhǔn)在十字線上，從標(biāo)尺上讀取干物質(zhì)百分比濃度，重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，記錄讀數(shù)Brix。

準(zhǔn)確稱取液體糖樣品（0.1±0.02） g，用超純水定容至50 mL，搖勻，經(jīng)孔徑0.22 μm的濾膜過濾至樣品管中，放入自動進(jìn)樣器進(jìn)行樣品分析。重復(fù)操作讀取3次讀數(shù)，取其算數(shù)平均值，分別記錄讀數(shù)為C3和C4，單位為mg/L。

1.3.4.5　計算及結(jié)果表示

式中：R——液體糖試樣還原糖的干物質(zhì)含量，%；

C3——離子色譜測得葡萄糖分結(jié)果，mg/L；

C4——離子色譜測得果糖分結(jié)果，mg/L；

Brix——液體糖試樣百分比濃度，%。

2　結(jié)果與分析

2.1　滴定法測定還原糖含量的結(jié)果

按照上述的滴定法檢測步驟，對液體糖試樣連續(xù)進(jìn)行9組平行滴定，檢測及計算結(jié)果如表2所示。由表2數(shù)據(jù)分析可知，9次平行試驗滴定結(jié)果的相對平均偏差為9.02%，滴定試驗結(jié)果符合QB/T 2343.2—2013中規(guī)定的相對平均偏差≤15%的要求。然而，滴定法的操作步驟繁多，造成操作誤差的幾率更大，因此重復(fù)滴定3次以上取其結(jié)果的平均值會更接近試樣還原糖干物質(zhì)含量的真實值。

表2　蘭-艾農(nóng)恒容法測定結(jié)果

2.2　高效液相色譜法測定還原糖含量的結(jié)果

按照1.3.3的測定步驟，高效液相色譜法的測定圖譜如圖1所示。

圖1　高效液相色譜法檢測圖譜

從高效色譜法測定圖譜來看，可以清晰分辨出蔗糖峰，但是其他糖分的峰幾乎難以判斷。另外，糖分的結(jié)果需要判斷色譜峰起點及終點位置，最終由系統(tǒng)自動計算出，而還原糖含量只能通過蔗糖含量間接算出。但不同的操作人對色譜峰的起點、終點位置的判斷會存在一定差異，這個差異會造成＞0.5%的相對誤差，這個誤差嚴(yán)重影響測定結(jié)果。在限定同一操作人的前提下，重復(fù)注入待測液進(jìn)行平行測定以驗證測定結(jié)果的重復(fù)性，平行測定結(jié)果如表3所示。

表3　高效液相色譜法測定結(jié)果

用高效液相色譜對液體糖試樣進(jìn)行9次平行測定，測定所得轉(zhuǎn)化糖的平均值為0.37%，相對平均偏差為43.04%，遠(yuǎn)高于滴定法測定結(jié)果的相對平均偏差。另外從測定結(jié)果的散點分布圖（圖2） 可看出，9次平行測定的結(jié)果與平均值出現(xiàn)較大的偏移。由此可見，除了峰起點、終點判斷引起的系統(tǒng)誤差外，儀器測量本身也會存在一定的相對誤差，檢測方法本身存在的誤差值已＞0.5%，對還原糖含量極低的全蔗糖糖漿來說顯然不合適。

圖2　高效液相色譜法測定還原糖含量的散點分布圖

2.3　離子色譜法測定還原糖含量的結(jié)果

按照1.3.4的測定步驟，離子色譜法的測定圖譜如下頁圖3所示。

從圖3可以看出，離子色譜儀能夠清晰分離出全蔗糖糖漿中的葡萄糖、果糖及蔗糖等糖組分。相比起高效液相色譜，離子色譜儀檢測結(jié)果的葡萄糖、果糖峰更為明顯，易于判斷，減少判斷峰帶來的系統(tǒng)誤差。向離子色譜儀重復(fù)注入待測液進(jìn)行平行測定以驗證檢測結(jié)果的重復(fù)性，平行測定結(jié)果如表4所示。

表4　離子色譜儀平行測定結(jié)果

用離子色譜儀對液體糖試樣進(jìn)行9次平行測定，測定所得轉(zhuǎn)化糖的平均值為0.42%，與滴定法結(jié)果0.43%接近。9次平行測定的相對平均偏差為2.30%，遠(yuǎn)低于滴定法的9.02%及高效液相色譜的43.04%。從數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及重復(fù)性來看，離子色譜儀測定方法比滴定法、高效液相色譜法更適用于檢測全蔗糖糖漿中的還原糖含量。

圖3　離子色譜法檢測圖譜

3　結(jié)論

本文以液體糖（全蔗糖糖漿）為對象，研究比對了其還原糖含量的3種不同測定方法的操作差異性及其檢測結(jié)果的可靠性。得出如下的結(jié)論：

1） 滴定法測定全蔗糖糖漿的操作步驟繁瑣，容易引起操作誤差。其測定結(jié)果的相對平均偏差在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的控制范圍內(nèi)，為避免單次測量存在的偶然誤差，重復(fù)測定3次以上取其結(jié)果的平均值會更接近試樣還原糖干物質(zhì)含量的真實值。

2） 高效液相色譜法檢測步序較滴定法簡單，但該方法的局限在于無法清晰識別出單糖峰，只能通過蔗糖峰間接計算出還原糖含量。而判斷峰起點及終點存在的誤差已經(jīng)＞0.5%，因此該方法用于測量全蔗糖糖漿的還原糖含量存在較大誤差。

3）離子色譜儀是高效液相色譜儀的一種，其檢測步驟與高效液相色譜儀類似，離子色譜儀的優(yōu)勢在于其檢測圖譜能夠清晰分離出全蔗糖糖漿中的葡萄糖、果糖及蔗糖等糖組分，因而能夠精確計算出全蔗糖糖漿中的還原糖含量，而且反復(fù)測定結(jié)果顯示數(shù)據(jù)的重復(fù)性好，所以此方法適用于測量全蔗糖糖漿中的還原糖含量。

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