劉　釗　曾燦彪　黃　浩　柯　玲　陳星合

（肇慶學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，廣東肇慶　526061）

希夫堿的應(yīng)用涉及催化領(lǐng)域、分析化學(xué)領(lǐng)域、功能材料領(lǐng)域、生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等，因此對(duì)希夫堿進(jìn)行研究并深入探索它的結(jié)構(gòu)、化合物的穩(wěn)定性、化學(xué)性質(zhì)、生物特性等有著重要意義。水楊醛系列希夫堿備受矚目，因其具有良好的抑菌和抗氧化性,而水楊醛本身也有良好的藥理作用，還應(yīng)用于止痛、抗炎、抗病毒等方面。希夫堿的官能團(tuán)(RC=N)與葉酸分子中的喋啶構(gòu)造類似，兩者對(duì)葉酸還原酶產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制，葉酸的生成因此作用受到抑制，從而使細(xì)菌體內(nèi)核苷酸和氨基酸的合成受阻，導(dǎo)致細(xì)菌停止生長(zhǎng)和繁殖。用于測(cè)定抗菌物質(zhì)抑菌效果的主要方法有定量稀釋法（MIC法） 和定性擴(kuò)散法。擴(kuò)散法通過(guò)測(cè)量在培養(yǎng)基上含樣品紙片的抑菌圈直徑，判斷其對(duì)細(xì)菌的抑菌效果，也可以用含不同濃度樣品的濾紙片進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。目前，對(duì)希夫堿的抗氧化能力有不少研究和報(bào)道。樊素芳等人探討了殼寡糖水楊醛系列希夫堿的抗氧化活性，并與殼寡糖對(duì)照比較。本文以3,5-二溴水楊醛和4-乙基苯胺為底物，設(shè)計(jì)并合成新型希夫堿，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并研究其生物活性。采用溶劑熱法合成希夫堿，用紅外、紫外光譜及核磁共振譜圖等進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，用紙片擴(kuò)散法和DPPH法進(jìn)行抑菌活性及抗氧化活性的研究，以期為進(jìn)一步研究3,5-二溴水楊醛類希夫堿及其生物活性提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

試劑：3,5-二溴水楊醛，純度98%，Aladdin Industrial Corporation；4－乙基苯胺，純度99%，Aladdin Industrial Corporation； DPPH/2,2－二苯基－1－苦基肼，BR，純度96%，上海源葉生物科技有限公司；N,N-二甲基甲酰胺，AR，西隴化工股份有限公司；其他常規(guī)試劑，均為分析純。

儀器：UV-2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，SHIMADZU CIRPORATION KYOTO JAPAN；FTIR-8400S紅外光譜儀，CE日本島津制作所；AVANCEIII 400MHz核磁共振儀，德國(guó)布魯克公司等。

1.2　方法

1.2.1　希夫堿的合成

稱取5 mmol（約1.399 5 g） 3,5-二溴水楊醛置于燒杯中，加入10 mL無(wú)水乙醇，水浴致其溶解，溶解后轉(zhuǎn)入100 mL的圓底燒瓶中。稱取5 mmol（約0.610 9 g） 4-乙基苯胺，用10 mL無(wú)水乙醇溶解至呈無(wú)色溶液，將無(wú)色溶液倒入50 mL的燒杯中。將溶液混合加入圓底燒瓶，安裝好回流裝置置于集熱式磁力攪拌器中攪拌，65℃恒溫回流反應(yīng)2.5 h。用薄層色譜法（TLC：thin-layer chromatography）跟蹤反應(yīng)并確定其反應(yīng)終點(diǎn)。展開(kāi)劑為石油醚和乙酸乙酯（體積比4∶1），GF254薄層層析硅膠板。

新希夫堿合成過(guò)程的化學(xué)方程式如圖1所示。

1.2.2　紅外光譜對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征

圖1　新希夫堿化合成的化學(xué)反應(yīng)方程式

采用FTIR-8400S傅里葉紅外光譜儀對(duì)新產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，取微量經(jīng)過(guò)重結(jié)晶洗滌純化的新希夫堿產(chǎn)物制成薄片，分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍400 cm-1～4 000 cm-1，掃描次數(shù)20次。

1.2.3　紫外光譜對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征

取微量干燥的希夫堿樣品，測(cè)量掃描范圍200 nm～800 nm。用正已烷配制成濃度適當(dāng)?shù)娜芤海沟盟鶞y(cè)定樣品的吸收頂峰吸收值落在記錄范圍0～0.4內(nèi)。同時(shí)用正已烷做空白扣除。

1.2.4　核磁共振H譜圖對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征

在核磁共振分析中，化學(xué)位移在掃場(chǎng)時(shí)用磁感應(yīng)強(qiáng)度的改變來(lái)表示。用TMS（四甲基硅烷） 作內(nèi)標(biāo)，在新希夫堿溶液中加入少許TMS，以TMS中氫核共振時(shí)的磁感應(yīng)強(qiáng)度作為標(biāo)準(zhǔn)，將它的化學(xué)位移規(guī)定為0。

核磁共振H譜選用CDCl3（氘代氯仿） 為溶劑，400 MHz的條件下TMS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定新希夫堿的1H NMR。

同時(shí)通過(guò)化學(xué)軟件Chemdraw模擬出希夫堿的理論氫譜圖、氫譜峰圖等對(duì)新化合物進(jìn)行表征，進(jìn)一步確定其化合物的結(jié)構(gòu)。

1.2.5　核磁共振C譜圖對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征

核磁共振C譜選用CDCl3為溶劑，100 MHz的條件下TMS內(nèi)標(biāo)法測(cè)定新希夫堿的13CNMR。

通過(guò)Chemdraw模擬出希夫堿的理論碳譜圖、碳譜峰圖等對(duì)新化合物進(jìn)行表征，確定所合成的希夫堿為理論中的希夫堿。

1.2.6　熔點(diǎn)的測(cè)定

將樣品先用5℃/min粗測(cè)，粗測(cè)完成后，再將起始溫度設(shè)置成比粗測(cè)熔點(diǎn)低5℃，最后用升溫速率1℃/min精測(cè)。

1.2.7　溶解性的測(cè)定

采用不同溶劑，將保存良好，干燥的樣品溶于其中，觀察其溶解性；溶劑包括N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙醇、甲醇和水。

1.2.8　新希夫堿抑菌活性的研究

準(zhǔn)備好牛肉膏培養(yǎng)基、沙氏勞保培養(yǎng)基、無(wú)菌生理鹽水、擴(kuò)散平板。用無(wú)菌操作分別將細(xì)菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌、枯草桿菌）活化。取活化好的細(xì)菌接入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分分散菌體。采用10倍系列稀釋法，制備10倍系列稀釋菌懸液。各梯度菌懸液進(jìn)行涂布記數(shù)，每次用移液管吸取0.2 mL該梯度菌懸液于倒好平板的牛肉膏培養(yǎng)皿中，采用畫(huà)半圓法使菌液分布均勻，涂布完成后正置15 min，將平板翻轉(zhuǎn)，37℃下培養(yǎng)24 h。選取細(xì)菌濃度范圍在108CFU/mL的試管做菌懸液。

取出已活化的霉菌菌種，洗脫于9 mL滅菌生理鹽水中，制成孢子懸浮液。對(duì)霉菌懸浮液的孢子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以DMF為溶劑，分別稱取適量的待測(cè)新希夫堿于50 mL燒杯中，分別制得質(zhì)量濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、1 mg/mL的溶液。將足夠數(shù)量的濾紙片（直徑為6 mm） 浸泡于溶液中，充分浸泡2 h備用（同時(shí)做DMF溶液空白對(duì)照）。量取0.2 mL菌懸液，將其加入并涂布于冷卻凝固完成的平板表面，將均勻涂布0.2 mL菌液的平板平均分為4個(gè)區(qū)域，分別對(duì)應(yīng)空白組（DMF），濃度為10 mg/mL、5 mg/mL、1 mg/mL的樣品液，做好標(biāo)記，用無(wú)菌鑷子依次夾取浸泡于10mg/mL、5mg/mL、1 mg/mL的DMF溶液的濾紙片，放置于平板內(nèi)固定，平行試驗(yàn)3次。細(xì)菌于37℃活化24 h，真菌于25℃活化48 h。待活化完畢后，取出培養(yǎng)基，觀察抑菌結(jié)果，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑，記錄平均值。

1.2.9　新希夫堿的抗氧化活性研究

準(zhǔn)確稱取0.0100 gDPPH（MDPPH=394.32） 固體，用無(wú)水乙醇溶解并定容于250 mL容量瓶，配成0.1 mmol/L DPPH溶液置于暗處備用。用DMF制得系列濃度的新希夫堿樣液，以及系列濃度的Vc溶液（對(duì)照液）。用3 mLDMF溶液與1 mL無(wú)水乙醇溶液作空白調(diào)零。分別取3 mL DMF和1 mL DPPH溶液于比色管中，置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處比色，記錄數(shù)值，記為A0。分別取3 mL不同濃度希夫堿溶液和1 mLDPPH溶液于比色管中，置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處比色，記為Ai。分別取3 mL不同濃度希夫堿溶液和1 mL無(wú)水乙醇溶液于比色管中，置于暗處反應(yīng)30 min，在517 nm處比色，記為Aj。DPPH自由基清除能力的計(jì)算：清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%。算出不同濃度希夫堿溶液對(duì)DPPH的清除能力，繪制出散點(diǎn)折線圖。計(jì)算出希夫堿與Vc溶液對(duì)DPPH的半數(shù)清除率（IC50）。

2　結(jié)果與分析

2.1　合成結(jié)果

新希夫堿為干燥橙紅色晶體，總產(chǎn)量為1.4929g，產(chǎn)率74.3%，樣品在空氣中穩(wěn)定存在。

2.2　表征結(jié)果分析

2.2.1　紅外光譜對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征分析

紅外光譜測(cè)試結(jié)果如圖2所示。

圖2　新希夫堿的紅外吸收光譜圖

通過(guò)譜圖分析，在波數(shù)為1 655 cm-1～1 900 cm-1處無(wú)明顯的強(qiáng)吸收峰，表明-C=O消失，新產(chǎn)物產(chǎn)生。在波數(shù)為1 652 cm-1處的強(qiáng)特征吸收峰為-CH=N-的伸縮振動(dòng)，此為表征希夫堿結(jié)構(gòu)的特征官能團(tuán)已經(jīng)生成并被檢測(cè)到。波數(shù)為1 504 cm-1的特征吸收峰為苯環(huán)的骨架振動(dòng)，在波數(shù)為706 cm-1的特征吸收表明苯環(huán)上有1，2，3-三取代物，3 505 cm-1處則為羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，在605 cm-1處溴的吸收峰，波數(shù)為2 450 cm-1處推斷為亞甲基特征吸收峰。因此，紅外譜圖表征結(jié)果與新產(chǎn)物希夫堿的結(jié)構(gòu)基本吻合。

2.2.2　紫外光譜對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征分析

紫外光譜掃描結(jié)果如圖3所示。

圖3　新希夫堿的紫外吸收光譜圖

從圖3中可以看出，希夫堿在202 nm、231 nm、275 nm、316 nm、332 nm、359 nm處有最大吸收峰，特征吸收波長(zhǎng)分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　特征吸收波長(zhǎng)分析

從表1中可以看出，原本的-C=O結(jié)構(gòu)消失，新產(chǎn)物產(chǎn)生。這進(jìn)一步證明了N原子進(jìn)行了配位及亞氨基的生成。

2.2.3　核磁共振H譜圖對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征分析

通過(guò)Chemdraw模擬出希夫堿的理論氫譜圖、氫譜峰圖，分別見(jiàn)圖4、圖5。

圖4　新希夫堿模擬的H譜圖

圖5　新希夫堿模擬的H譜峰圖

核磁共振H譜圖如圖6所示。

圖6　新希夫堿的1H NMR譜圖

通過(guò)新希夫堿的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)分析，化學(xué)位移 δ=7.447 5 μm～7.451 3 μm是 CDCl3的溶劑峰，化學(xué)位移δ=8.514 8 μm為與苯環(huán)相連接的-CH=N-基團(tuán)中H，共軛作用增強(qiáng)使化學(xué)位移向低電場(chǎng)移動(dòng)，表明產(chǎn)物已經(jīng)具有希夫堿結(jié)構(gòu)。在化學(xué)位移δ=7.217 4 μm～7.268 9 μm處存在的多重峰為苯乙基環(huán)上的質(zhì)子吸收峰，在δ=14.659 0 μm的單峰為3,5-二溴水楊醛苯環(huán)上的-OH引起，δ=2.664 1 μm～2.702 2 μm的吸收峰為苯乙基環(huán)上-CH2-的質(zhì)子峰，在 δ=1.244 9 μm～1.270 3 μm的吸收峰為苯乙基環(huán)上-CH3的質(zhì)子峰，在化學(xué)位移δ=7.711 1 μm～7.715 0 μm處的吸收峰為 3,5- 二溴水楊醛苯環(huán)上的質(zhì)子吸收峰。從測(cè)試結(jié)果推斷其質(zhì)子在苯環(huán)上以及其他位上的結(jié)構(gòu)與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基本一致。

2.2.4　核磁共振C譜圖對(duì)新希夫堿結(jié)構(gòu)的表征分析

通過(guò)Chemdraw模擬出希夫堿的理論碳譜圖、碳譜峰圖，分別見(jiàn)圖7、圖8。

圖7　新希夫堿模擬的C譜圖

圖8　希夫堿模擬的C譜峰圖

核磁共振C譜圖如圖9所示。

圖9　新希夫堿的13C NMR譜圖

通過(guò)新希夫堿的13CNMR譜圖數(shù)據(jù)分析，化學(xué)位移δ=158.7536μm為-C=N-的碳峰，δ=28.5231μm為-CH2-的碳峰，δ=15.517 9 μm為 -CH3的碳峰，δ=110.0760μm和112.2518μm為苯環(huán)連著2個(gè)溴的碳峰，δ=129.074 5 μm和 δ=120.736 1 μm ～121.145 5 μm是苯乙基環(huán)上的-CH的碳峰，δ=133.264 4 μm和δ=137.887 6 μm為 3，5- 二溴水楊醛苯環(huán)上的 -CH的碳峰，δ=157.537 0 μm是連著 -OH的碳峰，δ=144.557 6 μm和 δ=144.101 1 μm是苯環(huán)上與 -C=N-相連2個(gè)C上的碳峰。δ=76.831 4 μm-77.254 8 μm為CDCl3溶劑峰。從測(cè)試結(jié)果推斷其碳原子在苯環(huán)以及其他位上的結(jié)構(gòu)與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)基本一致。

2.3　新希夫堿的熔點(diǎn)測(cè)定結(jié)果

熔點(diǎn)約為102.6℃。

2.4　新希夫堿的溶解性

新希夫堿的溶解性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　新希夫堿的溶解性

綜合新希夫堿化合物的表征數(shù)據(jù)與分析結(jié)果，表明所合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與理論結(jié)構(gòu)基本相同，且產(chǎn)物產(chǎn)率較高。

2.5　抗菌活性測(cè)定結(jié)果

采用濾紙片擴(kuò)散法測(cè)定希夫堿對(duì)各細(xì)菌和霉菌的抑菌活性，希夫堿在不同濃度下抑菌圈直徑結(jié)果如表3所示。

表3　新希夫堿在不同濃度下的抑菌圈直徑(mm)

從表3中看出，新希夫堿對(duì)細(xì)菌具有良好的抑菌性，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度達(dá)到5 mg/mL或10 mg/mL時(shí)，對(duì)細(xì)菌均可達(dá)到高度敏感。其中當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈可達(dá)到20 mm以上，對(duì)大腸桿菌的抑菌效果為極度敏感，抑菌效果十分顯著。當(dāng)溶液質(zhì)量濃度在1 mg/mL時(shí)，除大腸桿菌外，均達(dá)到中等敏感水平。DMF溶液對(duì)各細(xì)菌或霉菌的抑菌圈均為6 mm，表明它對(duì)各菌均沒(méi)有抑制作用。此外，當(dāng)溶液質(zhì)量濃度為5 mg/mL時(shí)，新希夫堿對(duì)沙門(mén)氏菌、枯草桿菌的抑菌圈比在10 mg/mL時(shí)的直徑大，這表明抑菌圈大小并不是簡(jiǎn)單隨著溶液質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，而是在其質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有最大值，此時(shí)達(dá)到最強(qiáng)的抑菌效果。在對(duì)霉菌的抑制效果中，本文中合成的新希夫堿對(duì)黑根霉的抗菌性沒(méi)有被檢測(cè)出，對(duì)黑曲霉和毛霉的抑菌圈效果隨新希夫堿質(zhì)量濃度的增加而略有提高。依據(jù)本文的抑菌評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，除在1 mg/mL時(shí)對(duì)毛霉沒(méi)有抑菌圈的產(chǎn)生，新希夫堿對(duì)黑曲霉和毛霉的抑菌結(jié)果均為低度敏感，存在一定的抑菌效果。

2.6　抗氧化能力的測(cè)定結(jié)果

使用UVmini-1240（SHIMADZU） 測(cè)定紫外吸光度，得出清除能力工作曲線，新希夫堿和Vc溶液對(duì)DPPH自由基清除能力如下頁(yè)圖10、下頁(yè)圖11所示。

圖10　希夫堿對(duì)DPPH的清除能力

由圖10和圖11可以看出，在一定范圍內(nèi)，新希夫堿和Vc溶液對(duì)DPPH自由基的清除能力表現(xiàn)出較好的劑量效應(yīng)關(guān)系，隨試驗(yàn)溶液質(zhì)量濃度的增加呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)。根據(jù)線性方程y=4.5213x+18.759，R2=0.988，算出希出堿對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率為6.92 mg/mL。根據(jù)線性方程y=1431.9x+38.638，R2=0.918 3，算出希出堿對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率為0.007 9 mg/mL。IC50的結(jié)果表明，與Vc相比，新希夫堿對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)較弱。當(dāng)IC50小于10 mg/mL時(shí)，則說(shuō)明抗氧化劑具有良好的自由基清除活性。依據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)，化合物的IC50為6.92 mg/mL，小于10 mg/mL，其對(duì)DPPH自由基的清除能力相對(duì)較弱，但也保有一定的自由基清除活性。

3　結(jié)論

通過(guò)用3,5-二溴水楊醛和4-乙基苯胺合成的新希夫堿樣品為橙紅色晶體，產(chǎn)率為74.3%，熔點(diǎn)約為102.6℃。通過(guò)紅外、紫外光譜分析、核磁共振譜圖分析對(duì)新希夫堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，表征的結(jié)果表明合成產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物基本相一致。采用濾紙片法對(duì)希夫堿樣品進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果表明，新型希夫堿對(duì)細(xì)菌具有良好的抑制性，同時(shí)它對(duì)細(xì)菌的抑制效果整體高于真菌。對(duì)細(xì)菌的抑菌效果普遍在高濃度時(shí)達(dá)到高度敏感，其中對(duì)大腸桿菌可達(dá)到極度敏感程度。在抗氧化活性測(cè)定結(jié)果中，新希夫堿對(duì)DPPH自由基的IC50為6.92 mg/mL，清除

DPPH自由基的能力明顯比Vc弱，但仍具備一定的抗氧化活性。

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