崔 偉，徐晶萍，蘆文城，蘇曉晨，高 鋒，鮑靜姣，郭遠(yuǎn)明

(1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021)

隨著生產(chǎn)的發(fā)展，能源需求量急劇增加，化石燃料消耗殆盡，開(kāi)發(fā)可再生的清潔能源以維持生產(chǎn)生活迫在眉睫。生物柴油因不含石蠟，閃點(diǎn)高，燃燒性能和和效率高于普通柴油，可再生等優(yōu)勢(shì)，被視作化石能源的理想替代品[1]。在諸多生產(chǎn)原料之中，微藻因培養(yǎng)周期短，產(chǎn)油效率高，油脂質(zhì)量好，培養(yǎng)過(guò)程可不占耕地，并可實(shí)現(xiàn)一年四季培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，成為新能源開(kāi)發(fā)的研究重點(diǎn)之一。

微藻的培養(yǎng)方式有自養(yǎng)和異養(yǎng)兩種。光自養(yǎng)培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，適用范圍廣，但培養(yǎng)時(shí)需要維持光照條件，且藻液密度升高到一定值會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)[4]，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。相比之下，異養(yǎng)微藻的培養(yǎng)不需要維持光照條件，培養(yǎng)密度更高，培養(yǎng)過(guò)程中的可控性明顯優(yōu)于自養(yǎng)培養(yǎng)[4-6]，且有研究表明，異養(yǎng)培養(yǎng)的微藻油脂含量明顯高于自養(yǎng)培養(yǎng)的微藻[7-9]。因此，就生產(chǎn)生物質(zhì)能而言，對(duì)異養(yǎng)微藻的研究更具有實(shí)際意義。

如何在微藻生長(zhǎng)的同時(shí)同步提升微藻的油脂含量從而提高系統(tǒng)油脂總產(chǎn)量是目前國(guó)內(nèi)外微藻油脂生產(chǎn)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[10-12]。微藻的油脂累積受培養(yǎng)條件、自身生長(zhǎng)狀態(tài)等多方面因素的影響。傳統(tǒng)提高微藻油脂含量的方法是氮缺乏異養(yǎng)培養(yǎng)。氮脅迫可以促進(jìn)微藻體內(nèi)油脂含量的增加，但也會(huì)抑制微藻的生長(zhǎng)，導(dǎo)致其生物量減少[13-15]。鹽度也是影響藻類生長(zhǎng)繁殖的重要因素，近年來(lái)有人采用鹽脅迫的方法成功提升了自養(yǎng)微藻體內(nèi)的油脂含量[16]，而對(duì)于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)則還缺乏這方面的研究。

本次實(shí)驗(yàn)從污水處理廠等水體中篩選獲得了異養(yǎng)微藻，通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了該藻株異養(yǎng)生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)碳源，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行不同鹽度的脅迫培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)微藻的生長(zhǎng)量和油脂含量得出異養(yǎng)產(chǎn)油微藻在鹽脅迫下的油脂累積特性。研究成果對(duì)于微藻生物能源的發(fā)展具有一定的理論價(jià)值和實(shí)際意義。

1 材料與方法

1.1 藻樣采集及篩選

從污水處理廠、天然水體及養(yǎng)殖廠廢水中采取水樣，過(guò)濾后接種于TAP及BG11培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)。然后經(jīng)過(guò)3次平板劃線分離得到純化藻株，編號(hào)為w1-w14，以不含有機(jī)物的TAP培養(yǎng)基為自養(yǎng)培養(yǎng)基，以添加了10 g/L葡萄糖為碳源的TAP培養(yǎng)基為異養(yǎng)培養(yǎng)基，分別進(jìn)行所得微藻的光自養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)，通過(guò)對(duì)比微藻的生長(zhǎng)量篩選有異養(yǎng)生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的藻株，其中w11表現(xiàn)出了最佳的異養(yǎng)生長(zhǎng)能力，對(duì)w11通過(guò)光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)觀察，初步鑒定為小球藻Chlorella vulgaris。

1.2 碳源對(duì)微藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

以不含有機(jī)物的TAP培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加10.0 g/L的葡萄糖、甲醇、乙醇、無(wú)水乙酸鈉、六水丁二酸鈉為有機(jī)碳源配制異養(yǎng)培養(yǎng)基，研究不同有機(jī)碳源對(duì)篩選的異養(yǎng)優(yōu)勢(shì)藻株w11生長(zhǎng)的影響，根據(jù)其生長(zhǎng)量和油脂產(chǎn)量挑選出優(yōu)勢(shì)碳源為葡萄糖。實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)3組平行樣。

1.3 鹽脅迫培養(yǎng)

以優(yōu)選的葡萄糖為有機(jī)碳源，對(duì)w11進(jìn)行鹽脅迫培養(yǎng)。設(shè)置鹽度(NaCl質(zhì)量百分?jǐn)?shù))為0%，0.4%，0.8%，1.2%，1.6%，2.0%。根據(jù)不同鹽度下藻的生長(zhǎng)量、油脂含量及油脂產(chǎn)量，得出在鹽脅迫下藻株的油脂累積特性。實(shí)驗(yàn)過(guò)程設(shè)3組平行樣。

1.4 培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)微藻的培養(yǎng)在250 mL錐形瓶中進(jìn)行，每次培養(yǎng)液體積均為150 mL，培養(yǎng)溫度維持在25～30℃，光照條件為60～85 μmol/(m2·s1)。為便于研究微藻自養(yǎng)生長(zhǎng)與異養(yǎng)生長(zhǎng)的差別，本實(shí)驗(yàn)中微藻的異養(yǎng)培養(yǎng)采用光異養(yǎng)培養(yǎng)的方式進(jìn)行，除添加有機(jī)物外，其余條件均與自養(yǎng)培養(yǎng)相同。

1.5 分析測(cè)定方法

1.5.1 微藻生長(zhǎng)量的測(cè)定

采用分光光度法測(cè)定微藻濃度具有用量少且操作方便等優(yōu)點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)干重法準(zhǔn)確確定了不同稀釋度的藻液濃度，對(duì)照其在680 nm波長(zhǎng)處的吸光度[17]，繪制了藻密度-OD680標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為：

1.5.2 微藻油脂累積量的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中微藻油脂含量的測(cè)定采用磷酸香草醛顯色法，磷酸香草醛溶液：0.6 g香草醛加入到10 mL無(wú)水乙醇與90 mL蒸餾水的混合溶液中，振動(dòng)，再加入400 mL濃磷酸，均勻后存放于暗處。

樣品測(cè)定：取100 μL樣品，加2 mL濃硫酸，100℃加熱10 min，再水浴冷卻5 min，加5 mL磷酸香草醛溶液，37℃水浴15 min，測(cè)定OD530。

用油茶籽油溶于氯仿做樣品測(cè)定油脂含量，繪制油脂含量-OD530標(biāo)準(zhǔn)曲線，每100 μL藻液中的油脂含量為：

油脂含量(mg)=0.123 1×OD530+0.002 8(R2=0.999 9)

結(jié)合1.5.1部分測(cè)定的微藻濃度，從而計(jì)算出微藻中的油脂含量(%)。

1.6 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0軟件，采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 異養(yǎng)藻種的篩選

從圖1可以看出，藻株w3，w6，w8和w11在培養(yǎng)過(guò)程中的異養(yǎng)生長(zhǎng)量均超過(guò)自養(yǎng)生長(zhǎng)量，表明它們均具有一定的異養(yǎng)生長(zhǎng)能力，其中w3和w6的自養(yǎng)生長(zhǎng)量較低，表明它們對(duì)于不含有機(jī)物的TAP培養(yǎng)基的適應(yīng)能力較差。另外，w11的異養(yǎng)生長(zhǎng)量遠(yuǎn)高于自養(yǎng)的生長(zhǎng)量，并且其最終獲得的藻濃度達(dá)到了2.0 g/L，遠(yuǎn)高于其他的藻株，所以選擇w11為異養(yǎng)優(yōu)勢(shì)藻株。

圖1 不同藻株的光自養(yǎng)和光異養(yǎng)生長(zhǎng)量對(duì)比Fig.1 Autotrophic and heterotrophic growth of different algae strains

2.2 碳源對(duì)微藻異養(yǎng)生長(zhǎng)的影響

圖2對(duì)比了優(yōu)選的藻株w11在添加了不同有機(jī)碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況。從圖2可以看出，經(jīng)過(guò)17 d生長(zhǎng)以后，微藻在以葡萄糖為碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最為迅速，最高生物量達(dá)到了1.63 g/L，其他碳源條件下的微藻生長(zhǎng)量沒(méi)有較大差別，均在1.0 g/L左右(表1)，對(duì)比圖2中的生長(zhǎng)曲線可以發(fā)現(xiàn)在微藻的生長(zhǎng)前期，5種有機(jī)碳源作用相似，而在培養(yǎng)的后期，以葡萄糖為碳源的微藻生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)逐漸變得明顯，在第17天左右達(dá)到穩(wěn)定期；而在其他4種碳源環(huán)境下的微藻基本在第10天左右就達(dá)到了穩(wěn)定期，說(shuō)明葡萄糖做為有機(jī)碳源時(shí)延長(zhǎng)了微藻的生長(zhǎng)期，從而獲得了更高的微藻生長(zhǎng)量。

圖2 不同碳源環(huán)境下微藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.2 Microalgae growth under different carbon source(n=3)

另外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)微藻在不同有機(jī)碳源下生長(zhǎng)的油脂累積量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，在以葡萄糖為有機(jī)碳源的異養(yǎng)培養(yǎng)基中，微藻在獲得最高生長(zhǎng)量的同時(shí)也累積了最高的油脂含量(35.96%)。結(jié)合微藻生長(zhǎng)量，可以計(jì)算出微藻在以葡萄糖為有機(jī)碳源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)獲得的油脂產(chǎn)量達(dá)到了0.57 g/L，是其他有機(jī)碳源下微藻油脂產(chǎn)量的3倍左右。因此，葡萄糖被優(yōu)選為該藻株異養(yǎng)生長(zhǎng)的理想有機(jī)碳源，進(jìn)行后續(xù)的鹽脅迫生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)。

表1 不同碳源條件下藻的最大生長(zhǎng)量Tab.1 The biggest biomass under the conditions of different carbon sources

2.3 鹽脅迫下的油脂累積

微藻在不同NaCl鹽度異養(yǎng)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況如圖3所示。從圖3可以看出，當(dāng)培養(yǎng)液中的NaCl鹽度為0.4%時(shí)，微藻生長(zhǎng)幾乎不受培養(yǎng)基鹽度的影響，培養(yǎng)結(jié)束后獲得的微藻生長(zhǎng)量與不添加NaCl的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)量極為接近(表2)。隨著培養(yǎng)液中鹽度的進(jìn)一步提升，培養(yǎng)過(guò)程中獲得的微藻生長(zhǎng)量隨著培養(yǎng)液鹽度的上升而逐漸降低(表2)，表明微藻的生長(zhǎng)逐漸受到了明顯的抑制作用。另外，由表2中的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，當(dāng)培養(yǎng)液鹽度上升至2.0%的較高水平時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中仍然取得了較高的微藻生長(zhǎng)量(0.98 g/L)，表明篩選的藻株具有較好的耐鹽性能。

圖3 不同鹽度脅迫下微藻的生長(zhǎng)曲線(n=3)Fig.3 Microalgae growth under different salt stress(n=3)

表2 不同鹽度脅迫下藻的生長(zhǎng)量、油脂含量和油脂產(chǎn)量Tab.2 The biomass yield,lipids content and lipids yield of microalgae under different salt stress

在培養(yǎng)結(jié)束后，對(duì)微藻的油脂含量進(jìn)行了測(cè)定，并計(jì)算了相應(yīng)的油脂產(chǎn)量，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以看出，除鹽度為0.4%的培養(yǎng)基以外，微藻在含鹽培養(yǎng)基中異養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)出現(xiàn)了明顯的油脂累積現(xiàn)象，培養(yǎng)結(jié)束后獲得的油脂含量均明顯高于在不添加NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微藻的油脂含量，并且油脂累積量呈現(xiàn)隨著培養(yǎng)液鹽度上升而逐漸上升的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)液鹽度上升至2.0%時(shí)，微藻鹽度累積至47.75%的較高水平，達(dá)到了生長(zhǎng)在不添加NaCl培養(yǎng)基中微藻的油脂含量的1.6倍(由表2中數(shù)據(jù)計(jì)算)，表明通過(guò)一定的鹽度脅迫將微藻的油脂含量提升了60%左右。

圖4 不同鹽度脅迫下微藻的油脂含量和油脂產(chǎn)量(n=3)Fig.4 The lipids content and lipids production of microalgae under different salinity stress(n=3)

對(duì)比圖3和圖4可以發(fā)現(xiàn)，微藻的生長(zhǎng)速率與油脂累積之間存在一定的關(guān)聯(lián)，微藻在低鹽度環(huán)境下生長(zhǎng)時(shí)生長(zhǎng)速率較快，所獲得的生物量較大，但相應(yīng)的油脂累積含量較低，隨著鹽度的增加，微藻的生長(zhǎng)逐漸受到了明顯的抑制，從而累積了更高的油脂含量。這一發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)中采用氮缺乏脅迫方法促使微藻油脂累積的現(xiàn)象較為相似，在促使微藻進(jìn)行油脂累積的同時(shí)，微藻生長(zhǎng)速率會(huì)明顯降低，從而使最終獲得的油脂產(chǎn)量無(wú)法獲得提升[18]。本實(shí)驗(yàn)中，微藻在較高鹽度下生長(zhǎng)時(shí)雖然累積了更高的油脂含量，但最終獲得的油脂產(chǎn)量均略低于不含NaCl的培養(yǎng)基中的油脂產(chǎn)量(圖4)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，鹽度對(duì)于提高微藻的油脂含量具有明顯的促進(jìn)作用，但由于鹽度對(duì)微藻生長(zhǎng)的抑制作用，最終油脂產(chǎn)量并沒(méi)能提高。這一現(xiàn)象與王濤等[19]的研究結(jié)果較為一致，其原因可能為，在鹽度脅迫環(huán)境下，藻細(xì)胞內(nèi)的活性氧增多，當(dāng)有限的抗氧化酶無(wú)法及時(shí)清除活性氧時(shí)，細(xì)胞油脂的過(guò)氧化就會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成一定損傷，從而影響到微藻細(xì)胞的生長(zhǎng)[19]。所以，利用鹽度脅迫提高油脂累積一定要控制好鹽濃度。如何在促使微藻進(jìn)行油脂累積的同時(shí)提高最終的油脂產(chǎn)量將是后續(xù)研究的重點(diǎn)。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)篩選獲得1株以葡萄糖為優(yōu)勢(shì)碳源能進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)的小球藻。對(duì)其進(jìn)行鹽脅迫處理以后能顯著提升其油脂含量，培養(yǎng)的微藻體內(nèi)的油脂含量隨著培養(yǎng)液鹽度的上升而逐漸上升，培養(yǎng)液中NaCl鹽度達(dá)到2.0%時(shí)可使微藻的油脂含量提升約60%左右。由于鹽度脅迫在促進(jìn)微藻進(jìn)行油脂累積的同時(shí)也抑制了微藻的生長(zhǎng)速率，因此，最終獲得的油脂產(chǎn)量并沒(méi)有增加?？梢?jiàn)鹽脅迫方法存在與文獻(xiàn)中氮缺乏脅迫促使微藻累積油脂等方法相似的問(wèn)題，需要后續(xù)研究繼續(xù)探索。