張玉霞,崔玉超,李　燕,周　丹,陳　亮*

(1.廈門大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廈門市植物遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 廈門 361102;2.湖南理工學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,湖南 岳陽 414006)

水稻細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak,BLS)是由Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)侵染引起的細(xì)菌性病害,簡(jiǎn)稱細(xì)條病,現(xiàn)已成為威脅我國南方稻區(qū)水稻生產(chǎn)的重要病害[1-2]．水稻BLS是1918年在菲律賓首次發(fā)現(xiàn)[3],而在中國則是20世紀(jì)50年代在廣東省首次發(fā)現(xiàn)[4]．該病引起的水稻產(chǎn)量損失通常為15%～25%,嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%～60%．抗病育種是水稻BLS防治的重要方法之一,因此，挖掘并分離抗病基因,進(jìn)而培育抗逆品種有著非常重要的意義[5-7]．

用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分析Xoc侵染的水稻葉片蛋白表達(dá)的差異,從中鑒定差異表達(dá)的蛋白,是一種研究水稻與Xoc互作分子機(jī)制的重要方法,有望從中鑒定出參與水稻和Xoc互作的重要蛋白,包括參與水稻防御反應(yīng)的重要蛋白,進(jìn)而獲得相應(yīng)編碼基因[8],這有助于加深對(duì)水稻BLS防御信號(hào)網(wǎng)絡(luò)組分的認(rèn)識(shí),為進(jìn)一步探討水稻與Xoc互作的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)．

XCRK(Xoc-associatedreceptor-likekinase)基因是本課題組(指第一單位,下同)在水稻BLS侵染應(yīng)答的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)擬抗病基因,其GenBank登錄號(hào)為AK120121．本研究在對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上,分別構(gòu)建超量表達(dá)和RNA干擾(RNAi)抑制表達(dá)載體,并分析轉(zhuǎn)基因植株對(duì)BLS的抗性,為進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)基因植株抗性增強(qiáng)的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)．

1　材料與方法

1.1　材　料

所用水稻(OryzasativaL.)為粳稻品種臺(tái)北309(TP309)，由本課題組保存;克隆菌株為大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105菌株;所使用的載體包括采用Gateway技術(shù)克隆的中間載體pENTRTM/D-TOPO(Invitrogen，上海),超量表達(dá)載體pH7WG2、RNAi抑制表達(dá)載體pH7GWIWG2(Ⅱ)和組織表達(dá)分析載體pMDC164(本課題組保存)．

1.2　方　法

1.2.1水稻材料的培養(yǎng)及取樣

TP309水稻種子經(jīng)浸泡催芽后,播種于固定在保鮮盒的紗布上,保鮮盒內(nèi)保持一定水面(以浸濕紗布為準(zhǔn))．將這些水稻幼苗置于28 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下生長(zhǎng),每3 d換一次水并添加1/10體積的MS培養(yǎng)液以保持幼苗正常生長(zhǎng)．取四葉期幼苗及其根和葉,以及孕穗期植株的根、葉、莖、葉鞘、莖節(jié)和花序,用于組織表達(dá)分析．所有采集樣品立即用液氮速凍后置于-80 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

表1　本研究所用引物

Tab.1　Primers used in this study

名稱序列(5'→3')用途XCRK-FCACCGAAGATCTATGTTTCTGAAGACATATGG超量表達(dá)載體構(gòu)建XCRK-RCGCGGTAACCCTAAATCACAAGTTGATTTTXCRKi-FCACCCCGAAGTTAAGAAGATAGCG抑制表達(dá)載體構(gòu)建XCRKi-RAAATTCCGAGAATATAGTTCXCRKpro-FCACCACCCACAAGGTAGAATCAC啟動(dòng)子片段擴(kuò)增XCRKpro-RTGATGTCTGAGGCTCTGAGCAGXCRK-rq-FCCTCGGGCTATGCCTAAT基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)XCRK-rq-RGAACACGACGGGCTTTAAActin-rq-FTGTATGCCAGTGGTCGTACCA實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)內(nèi)參Actin-rq-RCCAGCAAGGTCGAGACGAA

1.2.2水稻基因組DNA和總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄

取四葉期水稻幼苗,采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法提取基因組DNA，采用Trizol試劑(Invitrogen,上海)提取不同組織的總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen,上海) 說明書利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa,大連)合成cDNA第一鏈．

1.2.3水稻幼苗的脅迫處理

非生物脅迫處理參照Xiang等[9]的方法,取四葉期水稻幼苗分別進(jìn)行以下處理:高鹽脅迫采用150 mmol/L NaCl溶液浸泡幼苗根部;干旱脅迫將正常生長(zhǎng)的幼苗根部浸泡于20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))聚乙二醇 (PEG) 溶液中;低溫脅迫將幼苗轉(zhuǎn)移至4 ℃的光照培養(yǎng)箱中;H2O2處理采用1% (體積分?jǐn)?shù))H2O2溶液浸泡幼苗根部并噴灑葉片．植物激素處理參照Song等[10]的方法,分別用乙烯前體 (ACC)、生長(zhǎng)素 (IAA)、脫落酸(ABA)、赤霉素 (GA3) 以及水楊酸 (SA) 溶液噴灑幼苗葉片，激素質(zhì)量濃度均為100 μmol/L．上述4種非生物脅迫和5種植物激素處理均在處理0,1,2,4,8,12,24 和48 h時(shí)分別取樣,用液氮速凍后置于-80 ℃下保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.4引物設(shè)計(jì)與載體構(gòu)建

根據(jù)水稻XCRK基因序列,使用 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異引物(見表1)用于基因表達(dá)水平檢測(cè)與載體構(gòu)建．以四葉期水稻基因組DNA為模板,擴(kuò)增XCRK基因啟動(dòng)子片段,用于XCRK基因組織表達(dá)分析載體構(gòu)建;以XCRK基因全長(zhǎng)cDNA為模板,擴(kuò)增用于構(gòu)建超量表達(dá)和抑制表達(dá)載體的目的基因平末端產(chǎn)物,所得產(chǎn)物再與pENTRTM/D-TOPO 載體進(jìn)行 TOPO 反應(yīng),PCR 檢測(cè)目的基因片段是否插入pENTRTM/D-TOPO 載體,將含有陽性克隆質(zhì)粒的菌液送Invitrogen 公司測(cè)序驗(yàn)證．

1.2.5根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

水稻成熟種子去除稻殼后消毒,將消毒的種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基N6D上,28 ℃黑暗條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)2周,然后挑選誘導(dǎo)的愈傷組織在新鮮的N6D上繼代培養(yǎng)；挑選生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織置于根癌農(nóng)桿菌懸浮液中,于23 ℃黑暗條件下共培養(yǎng)3 d;取共培養(yǎng)的愈傷組織用無菌水洗凈根癌農(nóng)桿菌懸浮液后,轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基N6S上,置于28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至長(zhǎng)出抗性愈傷組織;將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基RGH上,置于23 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下培養(yǎng)直至長(zhǎng)出綠色再生苗；將已分化的再生苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基1/2MS上培養(yǎng),讓其根系充分生長(zhǎng)．

1.2.6qRT-PCR檢測(cè)XCRK基因表達(dá)水平

采用RNAprep pure 植物總 RNA 提取試劑盒 (北京天根生化科技有限公司) 提取野生型和轉(zhuǎn)基因水稻植株成熟葉片的總 RNA;用 Invitrogen 公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄．取反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板,以水稻Actin基因作為內(nèi)參,用qRT-PCR 檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平．反應(yīng)體系為:2×SYBR?Premix ExTaqTMⅡ5 μL,上、下游引物各0.4 μL,cDNA模板1 μL,ROX Reference Dye 0.2 μL,用ddH2O補(bǔ)足至10 μL．反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,40個(gè)循環(huán),在每個(gè)循環(huán)72 ℃延伸最后5 s進(jìn)行熒光采集．每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次．采用2-ΔΔCT方法[11]進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析．

1.2.7β-葡萄糖醛酸酶(GUS)組織化學(xué)分析

分別取正常生長(zhǎng)條件下XCRK基因啟動(dòng)子融合GUS基因的不同轉(zhuǎn)基因株系(至少 3株)的各組織器官,浸入 GUS 染色液中于 37 ℃恒溫箱中過夜染色,倒去染色液后先加入 95%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙醇脫色,再用 75%乙醇脫色后觀察并拍照記錄[12]．

100 mL GUS 染色液配方為:50 mmol/L NaH2PO4,50 mmol/L Na2HPO4,10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA),0.1%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100,0.65 mg/mL K3Fe(CN)6,0.85 mg/mL K4Fe(CN)6,1 mg/mL X-gluc,100 μg/mL 氯霉素,pH 7.0．配制好的GUS 染色液于4 ℃下貯存．

1.2.8BLS致病菌Xoc的接種

預(yù)先將Xoc強(qiáng)毒力菌株RS105在NA平板(加利福平至終質(zhì)量濃度為100 μg/L)上劃線培養(yǎng)2～3 d,然后用無菌水洗下菌體,配制細(xì)胞密度為1×108mL-1左右的菌液,最后加Tween-20至終體積分?jǐn)?shù)為0.1%(下同),混勻備用．接種時(shí)間選擇在8月,用上述菌液和無菌水(含0.1% Tween-20)分別在分蘗期水稻完全展開的葉片上用針刺法接種,在葉脈的兩側(cè)以及靠葉鞘端、中間和葉尖端分別扎針接種．

1.2.9生物信息學(xué)分析

利用NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)、RiceXPro(http:∥ricexpro.dna.affrc.go.jp/index.html)和RGAP(http:∥rice.plantbiology.msu.edu)數(shù)據(jù)庫查找目的基因序列和注釋信息;利用PLACE (http:∥www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 數(shù)據(jù)庫提供的在線工具對(duì)目的基因上游啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè);利用Genevestigator(https:∥genevestigator.com/)數(shù)據(jù)庫分析XCRK基因在各種逆境處理下的表達(dá)情況;利用NCBI 中的 BLAST(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行在線序列同源性檢索;利用 NCBI 網(wǎng)站的CCD(conserved domains)程序?qū)Φ鞍踪|(zhì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè);利用ClustalX(http:∥bioinformatics.ubc.ca/resources/tools/clustalx)進(jìn)行多重序列比對(duì)．

2　結(jié)果與分析

2.1　XCRK基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

利用PLACE數(shù)據(jù)庫對(duì)XCRK基因編碼區(qū)上游約1 kb的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,結(jié)果顯示該序列中含有大量的順式作用元件,其中包括多個(gè)非生物脅迫和激素響應(yīng)元件:干旱響應(yīng)元件(DRE)6個(gè),MYB結(jié)合位點(diǎn)(MYBRS)12個(gè),MYC結(jié)合位點(diǎn)(MYCRS)5個(gè),ABA響應(yīng)元件(ABRE)4個(gè),生長(zhǎng)素響應(yīng)元件(AuRE)4個(gè),病原體響應(yīng)元件2個(gè)以及NPR1響應(yīng)元件5個(gè)(圖1(A))．因此，推測(cè)XCRK基因可能參與了水稻的多種生物學(xué)過程,并在脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮作用．

搜索RGAP數(shù)據(jù)庫獲得XCRK基因及其編碼蛋白的信息,結(jié)果顯示該基因位于水稻1號(hào)染色體上,編碼一個(gè)含有322個(gè)氨基酸的蛋白激酶 (圖1(B))．利用NCBI網(wǎng)站的CCD程序?qū)CRK基因編碼的蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),結(jié)果表明該蛋白含有一個(gè)保守的S/TKc結(jié)構(gòu)域.使用ClustalX進(jìn)行多重序列比對(duì),結(jié)果顯示XCRK蛋白的S/TKc結(jié)構(gòu)域在水稻中有一個(gè)同源蛋白Os01g0115900,序列相似性高達(dá)84%;此外XCRK蛋白與水稻的Lr10蛋白,燕麥(Avenasativa)的LRK9和LRK45蛋白,小麥(Triticumaestivum)的 LRK14和Lr10同源蛋白及大麥(Hordeumvulgare)的 LRK10蛋白都有著高度相似性(見附錄圖S1,http:∥jxmu.xmu.edu.cn/upload/html/20180208.html)．

黑色框、灰色框和斜紋框分別為 5′-非編碼區(qū)、3′-非編碼區(qū)和編碼區(qū),ATG和TGA分別為翻譯起始密碼子和終止密碼子，kinase domain為蛋白激酶結(jié)構(gòu)域．圖1　XCRK基因及其編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析Fig.1 Bioinformatic analysis of XCRKgene and the coding protein

2.2　XCRK基因在水稻不同組織中的表達(dá)分析

圖2　qRT-PCR檢測(cè)XCRK基因在不同組織中的表達(dá)Fig.2 Expression analysis of XCRK gene in different tissues by qRT-PCR

為了探究XCRK基因的表達(dá)是否具有組織特異性,利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了XCRK基因的組織表達(dá)譜．結(jié)果如圖2所示:XCRK基因在根、莖、葉、花序、莖節(jié)和葉鞘中均有表達(dá),其中根、葉、花序和莖中的表達(dá)量明顯高于其他組織,具體表現(xiàn)為花序中的表達(dá)量最高,根和葉中的表達(dá)量次之,莖節(jié)和葉鞘中的表達(dá)量較低．

為了進(jìn)一步檢測(cè)XCRK基因的組織表達(dá)模式,選取組織表達(dá)分析轉(zhuǎn)基因植株的幼苗和生殖期成株的不同組織進(jìn)行GUS活性檢測(cè),結(jié)果如圖3所示:GUS活性在T0代幼苗的根、葉鞘、葉、稃片、花藥和發(fā)育的種子中均有表達(dá),與qRT-PCR檢測(cè)顯示在葉中的高表達(dá)相比,轉(zhuǎn)基因植株葉中僅檢測(cè)到較弱的GUS活性,這可能與qRT-PCR的高度靈敏性有關(guān)．由上述結(jié)果可知XCRK基因的表達(dá)具有一定的組織特異性．

(A)根;(B)葉鞘;(C)葉片;(D)稃片及花藥;(E)發(fā)育的種子.圖3　組織表達(dá)分析轉(zhuǎn)基因植株的GUS活性檢測(cè)Fig.3 GUS activity analysis of tissue-specific expression transgenic plants

2.3　XCRK基因的逆境表達(dá)模式分析

Genevestigator和RiceXPro公共數(shù)據(jù)庫顯示,XCRK基因的表達(dá)受到多種脅迫的影響．本研究利用qRT-PCR檢測(cè)了該基因在不同非生物逆境脅迫下的表達(dá)譜，結(jié)果如圖4(A)所示:XCRK基因顯著被高鹽和H2O2誘導(dǎo),表達(dá)量在高鹽處理12 h時(shí)提高約5.5倍,在H2O2處理24 h時(shí)提高約1.5倍;在干旱脅迫下,XCRK基因的響應(yīng)不明顯,表達(dá)水平略有降低;在4 ℃低溫處理下,XCRK基因在脅迫1～8 h內(nèi)快速下調(diào)至較低水平,12 h時(shí)被快速誘導(dǎo)而呈現(xiàn)高水平表達(dá)．

同時(shí)分析了四葉期的水稻幼苗在不同植物激素處理下XCRK基因的表達(dá)譜，結(jié)果如圖4(B)所示:在ABA處理8 h時(shí)，XCRK基因表達(dá)量提高約4.5倍;在GA3和ACC處理下沒有明顯變化;而在SA處理下,1～8 h時(shí)沒有明顯變化,12 h時(shí)XCRK基因表達(dá)量有所提高,24 h時(shí)提高約4倍;在IAA處理下,XCRK基因表達(dá)水平總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì),在IAA處理2 h時(shí)顯著下調(diào)至最低水平,4 h時(shí)表達(dá)量有所提高,12 h時(shí)最高，約提高12倍．以上結(jié)果表明XCRK基因的表達(dá)受高鹽、H2O2和ABA的顯著誘導(dǎo),由此推測(cè)XCRK基因可能在植物的高鹽脅迫、氧化脅迫等應(yīng)答過程中發(fā)揮作用．

與同組0 h(初始狀態(tài))比較(t-檢驗(yàn)),a.表示差異顯著(p<0.05)，b.表示差異很顯著(p<0.01),c.表示差異極顯著(p<0.001),下同．圖4　XCRK基因在不同非生物脅迫(A)及植物激素處理(B)下的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of XCRK gene in response to different abiotic stresses (A) and plant hormones (B)

2.4　轉(zhuǎn)基因植株的獲得與鑒定

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,分別將構(gòu)建好的XCRK基因超量表達(dá)和抑制表達(dá)重組質(zhì)粒導(dǎo)入 TP309 中,獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株．取19株P(guān)CR鑒定為陽性的XCRK基因超量表達(dá)T0代轉(zhuǎn)基因植株(分別命名為OE1～19),通過qRT-PCR檢測(cè)目的基因XCRK的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:相對(duì)于野生型(WT)植株,XCRK基因在所選轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量均有不同程度的提高,其中株系OE3和OE8的表達(dá)量較高(圖5(A)),故選取其作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料．同樣地,選取10棵PCR鑒定為陽性的XCRK基因抑制表達(dá)T0代轉(zhuǎn)基因植株(分別命名為RNAi1～10),并檢測(cè)目的基因XCRK的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:相對(duì)于WT植株,XCRK基因在所選植株中的表達(dá)量均有不同程度的下降,選取表達(dá)量下降較大的株系RNAi2和RNAi8(圖5(B))作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料．

(A)中1～19分別對(duì)應(yīng)OE1～19，(B)中1～10分別對(duì)應(yīng)RNAi1～10.圖5　XCRK基因超量表達(dá)(A)和抑制表達(dá)(B)轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)水平分析Fig.5 Exprssion analysis of XCRK gene over-expression (A) and RNAi (B) transgenic lines

2.5　轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Xoc的抗性

依據(jù)T0代植株的鑒定結(jié)果,選取超量表達(dá)效果明顯的OE3和OE8植株以及抑制表達(dá)效果明顯的RNAi2和RNAi8 植株,通過qRT-PCR分析XCRK基因在T1代超量、抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中的相對(duì)表達(dá)水平,結(jié)果如圖6(A)所示,可見所選植株中XCRK基因的表達(dá)情況與T0代植株中基本一致．在分蘗期對(duì)水稻植株進(jìn)行接菌實(shí)驗(yàn),結(jié)果如圖6(B)所示:接菌10 d后,超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株OE3的病斑長(zhǎng)度明顯比WT植株的短,而抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株RNAi2的病斑長(zhǎng)度則略長(zhǎng)于WT植株．在接菌10和15 d后分別統(tǒng)計(jì)分析不同超量、抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株和WT植株的病斑長(zhǎng)度,結(jié)果如圖6(C)所示:接菌10 d后,2株超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的平均病斑長(zhǎng)度分別為2.5和2.1 mm,顯著短于WT植株 (p<0.01),其中OE8與WT的差異極顯著(p<0.001);抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株則表現(xiàn)出相反的表型,2株T1代抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株病斑長(zhǎng)度分別為4.1和3.8 mm,均略長(zhǎng)于WT植株,但差異不顯著(p>0.05)．接菌15 d后,OE3(4.0 mm)、OE8(3.6 mm) 與WT(6.5 mm)相比,病斑長(zhǎng)度均達(dá)到極顯著差異(p<0.001),而RNAi2和RNAi8與WT相比差異仍不顯著(p>0.05)．由此可見,T1代XCRK超量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Xoc的抗性明顯增強(qiáng),而抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗性則變化不明顯．

圖6　T1代XCRK超量、抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)Xoc的抗性Fig.6 Resistant acitivity of T1 XCRK gene over-expression and RNAi transgenic plants upon Xoc challenge

3　討　論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中,不斷感受外界生物和非生物因子的刺激,引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激活防御基因的表達(dá),來避免或減輕由此帶來的傷害．許多植物類受體激酶基因在病原菌侵染時(shí)被誘導(dǎo)表達(dá)．?dāng)M南芥(Arabidopsisthaliana)RBK1基因的表達(dá)受病原菌致病疫霉(Phytophthorainfestans)和灰霉葡萄孢菌(Botrytiscinerea)的誘導(dǎo),RBK1蛋白通過與Rop GTPase互作參與植物生長(zhǎng)和病原菌防御反應(yīng)[13]．Royo等[14]報(bào)道玉米(Zeamays)ZmLrk-1基因編碼一個(gè)類受體激酶,受病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)的誘導(dǎo),參與真菌病原菌的防御反應(yīng)．在本研究中,XCRK基因在Xoc侵染激發(fā)的防御反應(yīng)中被誘導(dǎo)表達(dá),這為XCRK基因參與水稻對(duì)Xoc的防御反應(yīng)提供了證據(jù)．XCRK基因被誘導(dǎo)表達(dá)后,是否會(huì)進(jìn)一步調(diào)控下游基因表達(dá)有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證．

植物免疫系統(tǒng)的激活依賴于植物抗性蛋白對(duì)病原菌的識(shí)別,這一識(shí)別過程通常會(huì)伴隨強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),即局部程序性細(xì)胞死亡[15],這是植物普遍具有的一種抗病反應(yīng)[16-17],以此保護(hù)植物免受病原菌侵染[18]．在此過程中氧爆發(fā)(oxygen burst)導(dǎo)致活性氧中間體(ractive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,對(duì)入侵病原物有直接殺死作用[19]．本研究中發(fā)現(xiàn)XCRK基因的表達(dá)明顯受到H2O2的誘導(dǎo),后續(xù)可通過對(duì)轉(zhuǎn)基因植株在Xoc侵染下的生理變化，進(jìn)一步研究XCRK基因是否通過抗氧化途徑來抵御Xoc的侵染．

XCRK基因編碼胞質(zhì)類受體激酶,超量表達(dá)XCRK基因的T1代轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)Xoc的抗性明顯增強(qiáng),抑制XCRK基因表達(dá)的T1代轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)Xoc的敏感性也略增強(qiáng),表明XCRK基因是水稻對(duì)Xoc抗性的正調(diào)控因子．綜上所述,XCRK基因在水稻和Xoc的互作中發(fā)揮重要作用,參與調(diào)控水稻對(duì)BLS的抗性,并響應(yīng)多種防御信號(hào)．這為進(jìn)一步解析Xoc侵染下復(fù)雜的水稻防御信號(hào)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)．

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