王正全，崔云云，倪玲，陳力，黃寶勇，劉源，汪立平，趙勇,，王錫昌,，謝晶,

(1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海201306； 2.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海 201306；3.北京市農(nóng)業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(北京)，北京 100029； 4.農(nóng)業(yè)部冷庫(kù)及制冷設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(上海)，上海 201306)

丁香酚(eugenol,C10H12O2)是從芳香植物的精油中提取得到的，在常溫下呈黃色或透明的油狀苯丙類(lèi)化合物。丁香酚具有局部麻醉、防腐、鎮(zhèn)痛、抗炎和抗菌的作用，通過(guò)作用于生物體弓狀核區(qū)的敏感神經(jīng)元，影響其放電作用及相關(guān)細(xì)胞通路，從而產(chǎn)生局部降溫等作用，是清涼油等驅(qū)蚊蟲(chóng)藥物的有效成分[1]。日本最早發(fā)現(xiàn)丁香酚對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物具有麻醉作用并應(yīng)用于景觀魚(yú)運(yùn)輸，隨后世界各國(guó)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)丁香酚獨(dú)特的麻醉效果，且受試動(dòng)物能夠快速?gòu)?fù)蘇，開(kāi)發(fā)出專用劑型應(yīng)用于食用水產(chǎn)動(dòng)物的高密度運(yùn)輸[2-3]。但是，含有丁香酚的運(yùn)輸水長(zhǎng)時(shí)間浸泡水產(chǎn)動(dòng)物會(huì)導(dǎo)致其在動(dòng)物體內(nèi)蓄積并污染環(huán)境。有研究顯示，因丁香酚的芳香烴結(jié)構(gòu)具有脂溶性特點(diǎn)，使其在水產(chǎn)動(dòng)物中可以穩(wěn)定存在96h以上；丁香酚麻醉魚(yú)體20d后仍可被檢測(cè)，在500℃以上才會(huì)明顯降解；其前處理提取物有4d的穩(wěn)定期，可以積蓄在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)[4-7]。含有丁香酚的廢水最終排放入大海后，能?chē)?yán)重干擾珊瑚的繁殖，其對(duì)海洋環(huán)境的危害不可輕視[8]。

目前國(guó)際上流行3種丁香酚麻醉劑，即丁香油(cloveoil)、香精油(essentialoil)和AQUI-S?20E(10%丁香酚活性成份復(fù)配麻醉劑，僅限美國(guó)地區(qū)使用)，其中后者應(yīng)用最廣泛且相關(guān)研究最多[9-15]，而國(guó)內(nèi)流行使用的是純丁香油(醫(yī)用丁香酚)[16-18]。有學(xué)者指出，有效成分為丁香酚的復(fù)配制劑AQUI-S?20E一旦使用，必定會(huì)檢出丁香酚殘留，甚至在水產(chǎn)動(dòng)物表皮也能檢測(cè)到[11]。更有研究指出，使用AQUI-S?20E麻醉鱸需要50h～7d的時(shí)間才可以代謝干凈，并且這種麻醉劑的殘留會(huì)出現(xiàn)累積效應(yīng)，最終建議捕撈前休藥2d且運(yùn)輸結(jié)束后再需要暫養(yǎng)休藥7d才可食用，這是僅有的關(guān)于丁香酚在水產(chǎn)動(dòng)物麻醉后休藥期的研究報(bào)道[12]。美國(guó)、歐盟等國(guó)家和地區(qū)還允許使用推薦劑量的魚(yú)安定(甲磺酸三甲酯，MS-222)作為魚(yú)類(lèi)麻醉劑，該麻醉劑在中國(guó)較罕見(jiàn)。

調(diào)研發(fā)現(xiàn)，丁香酚作為一種漁用麻醉劑已在中國(guó)使用多年，特別是在水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸環(huán)節(jié)常使用丁香酚對(duì)密集運(yùn)輸?shù)聂~(yú)、蝦、蟹類(lèi)進(jìn)行麻醉，可以有效減少甚至避免水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程中的機(jī)體損耗，進(jìn)而減少鮮活水產(chǎn)品的死亡率，使養(yǎng)殖戶和各級(jí)經(jīng)銷(xiāo)商獲益。丁香酚麻醉水產(chǎn)動(dòng)物的復(fù)蘇時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，價(jià)格卻比MS-222占優(yōu)勢(shì)，歐美等國(guó)家和地區(qū)多用MS-222，而日本、新西蘭、澳大利亞、智利則多用丁香酚，中國(guó)的使用情況與亞太地區(qū)國(guó)家的大趨勢(shì)一致[16]。丁香酚能有效使羅非魚(yú)出現(xiàn)短暫呼吸停止，減少運(yùn)輸過(guò)程的應(yīng)激反應(yīng)，減少運(yùn)輸過(guò)程中的損失，實(shí)際運(yùn)輸中低水溫會(huì)影響魚(yú)體對(duì)麻醉劑的吸收效果，通常采用加大使用劑量(0.15mL/L)維持麻醉效果[17]。媒體曾報(bào)道丁香酚麻醉運(yùn)輸活魚(yú)的案例，引起了消費(fèi)者對(duì)食品安全的擔(dān)憂和恐慌，特別是一線城市的水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸過(guò)程長(zhǎng)、暫養(yǎng)銷(xiāo)售環(huán)節(jié)到餐桌的過(guò)程周期短、從業(yè)人員加藥隨意性大且缺少休藥期概念，導(dǎo)致丁香酚殘留安全風(fēng)險(xiǎn)陡升?？傊?，目前丁香酚殘留檢測(cè)監(jiān)管存在執(zhí)行難度大、風(fēng)險(xiǎn)排查困難多、標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法尚未建立等問(wèn)題，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物及其運(yùn)輸暫養(yǎng)水體等的快速、簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、有效、靈敏的檢驗(yàn)檢測(cè)方法[18-26]。文章歸納了近年來(lái)國(guó)內(nèi)外針對(duì)水體及類(lèi)似基質(zhì)中丁香酚的殘留檢測(cè)的方法，以期為中國(guó)漁用麻醉劑的監(jiān)測(cè)和監(jiān)管提供參考。

1　丁香酚作為麻醉劑的應(yīng)用背景

丁香酚在水產(chǎn)動(dòng)物高密度養(yǎng)殖時(shí)被用作麻醉劑的作用主要是降低新陳代謝和耗氧量，有研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖密度達(dá)到240 g/L時(shí)，使用30 mg/L的商用精油AQUI-S?20E(含10%丁香酚有效成分)可有效提升溫水魚(yú)(羅非魚(yú))和冷水魚(yú)(黃鱸)的存活率[9]。 另一研究表明運(yùn)輸水中添加丁香酚精油可以有效降低水產(chǎn)動(dòng)物血漿中的皮質(zhì)醇含量，減少血液中Na+、K+、C1-的損失，顯著降低運(yùn)輸終了時(shí)運(yùn)輸水中的總胺濃度，說(shuō)明丁香酚可以在運(yùn)輸過(guò)程中降低魚(yú)、蝦等水產(chǎn)動(dòng)物的代謝率，提高存活率[9-10]。

本實(shí)驗(yàn)室在2013—2016年間不間斷地對(duì)滬浙閩三地水產(chǎn)動(dòng)物批發(fā)市場(chǎng)的調(diào)研和排查中發(fā)現(xiàn)，樣品從未監(jiān)測(cè)出MS-222，而丁香酚在運(yùn)輸水和暫養(yǎng)水中則均有陽(yáng)性檢出，運(yùn)輸環(huán)節(jié)人工添加丁香酚行為歸納如圖1所示。

圖1　獨(dú)立的水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸水箱加入丁香酚過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic of the addition of eugenol in a self-contained fish transport box

2　殘留檢測(cè)方法國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展

2.1　國(guó)外研究概況

目前丁香酚的毒性機(jī)理和毒害作用尚未形成一致結(jié)論，國(guó)際上對(duì)其應(yīng)用的普遍性存在爭(zhēng)議，研究關(guān)注水產(chǎn)動(dòng)物及其運(yùn)輸和暫養(yǎng)環(huán)節(jié)的水生動(dòng)物產(chǎn)品、血清、精油、茶水、豆粉和環(huán)境水等基質(zhì)中的丁香酚含量或殘留檢測(cè)，如表1所示。

表1　外文文獻(xiàn)關(guān)于丁香酚的殘留檢測(cè)現(xiàn)狀Tab.1　Current status of residual analysis of eugenol in foreign literatures

注： LOD(limit of detection)為檢測(cè)限；LOQ(limit of Quantity)為定量限；HPLC(high-performance liquid chromatography)為高效液相色譜；GC-MS/MS(gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry)為三重四級(jí)桿氣質(zhì)色譜儀；UV(ultra violet detectior)為紫外檢測(cè)器；LSC(liquid scintillation counter)為液體閃爍計(jì)數(shù)器；SIDA(stable isotope dilution assay)為穩(wěn)定同位素稀釋測(cè)定；FID(flame ionization detector)為火焰離子化檢測(cè)器。—表示文獻(xiàn)未記錄，下同。

國(guó)際上的相關(guān)研究多關(guān)注以丁香酚為主要功效成分的商業(yè)配方或者精油，如AQUI-S?20E、Aqui-S (10%異丁香酚)等的麻醉機(jī)理、麻醉效果、殘留穩(wěn)定性、代謝規(guī)律和環(huán)境影響等方面，研究的樣品基質(zhì)則多針對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物及其相關(guān)水樣[4, 7-15, 28, 30, 34]。以丁香酚及其同系物純品為研究對(duì)象的文獻(xiàn)并不多見(jiàn)，研究關(guān)注的樣品基質(zhì)也并不局限于水產(chǎn)動(dòng)物[6, 27-32]。另外，外文文獻(xiàn)中研究的樣品基質(zhì)差異非常大，既有簡(jiǎn)單的水產(chǎn)動(dòng)物肌肉組織勻漿樣品，又有環(huán)境水、茶水等均勻樣品，還有復(fù)雜的血清、血漿基質(zhì)，甚至還包括原始精油成分的常量分析，這些方法的檢出限、回收率的研究并不很全面，主要是輔助邏輯性推理和原理性推斷，檢驗(yàn)檢測(cè)僅為手段而非文獻(xiàn)的最終研究目的。

對(duì)于水產(chǎn)動(dòng)物的丁香酚研究，外文文獻(xiàn)關(guān)注點(diǎn)在于多品種的淡水魚(yú)[7]、高密度養(yǎng)殖的冷水魚(yú)和溫水魚(yú)[9, 34]中的丁香酚殘留或麻醉機(jī)理，也涉及某一種魚(yú)類(lèi)或其他水產(chǎn)動(dòng)物模型的可食性帶皮肌肉組織[7, 11, 35]，針對(duì)性較強(qiáng)。Becker等[10]發(fā)現(xiàn)丁香酚及由白棘枝提煉的精油同樣可以在運(yùn)輸銀鰱和克林雷氏鯰的過(guò)程中有效地減少緊張素，降低運(yùn)輸過(guò)程中氧氣的消耗和二氧化碳與總胺的積累程度，可以保障更長(zhǎng)的運(yùn)輸時(shí)間后銀鰱不因總胺含量急速上升而死亡。Kaiser等[14]專門(mén)研究了丁香油在長(zhǎng)途運(yùn)輸鮮活維多利亞麗池魚(yú)過(guò)程中有效減輕魚(yú)類(lèi)的壓力反應(yīng)的作用，發(fā)現(xiàn)丁香油搭配選擇性銨離子交換沸石可控制總氨水平降幅達(dá)82%，另外關(guān)于長(zhǎng)距離運(yùn)輸鮮活水產(chǎn)品的研究還可以借鑒參考大鼠血漿、人血清和茶水為基質(zhì)的研究[29-31]。

2.2　國(guó)內(nèi)研究概況

鑒于丁香酚作為麻醉劑的風(fēng)險(xiǎn)性以及國(guó)標(biāo)和殘留限量值的空缺現(xiàn)狀(僅有地標(biāo)DB22/T 1988—2013水產(chǎn)品中丁香酚的測(cè)定高效液相色譜法)，中國(guó)近年也涌現(xiàn)出大量針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物以及運(yùn)輸、暫養(yǎng)水體中丁香酚殘留檢測(cè)的研究。目前常見(jiàn)的檢測(cè)方法包含有固相萃取-高效液相色譜-熒光法(SPE-HPLC-FLD)、固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法(SPE-HPLC-MS)、基質(zhì)固相分散萃取-氣相色譜法(d-SPE-GC)、液液萃取-高效液相色譜-紫外法(LLE-HPLC-UV)、固相萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(SPE-GC/MS)和固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法(SPME-GC/MS)法等，丁香酚殘留檢測(cè)研究進(jìn)展如表2所示。國(guó)內(nèi)儀器設(shè)備傾向于選用更加優(yōu)越的三重四級(jí)桿串聯(lián)技術(shù)(MS/MS)，而國(guó)際研究則傾向于選用更加基礎(chǔ)的紫外(UV)和單四極桿(MS)檢測(cè)設(shè)備，國(guó)內(nèi)研究明顯檢測(cè)限更低、基質(zhì)更全面、應(yīng)用更廣泛，殘留檢測(cè)已經(jīng)處于世界領(lǐng)先水平。

表2　中文文獻(xiàn)關(guān)于丁香酚的殘留檢測(cè)現(xiàn)狀Tab.2　Current status of residual analysis of eugenol in domestic literatures

目前國(guó)內(nèi)關(guān)于丁香酚在水體及水產(chǎn)品中殘留檢測(cè)的研究尚處于起步階段。文獻(xiàn)調(diào)查顯示，常量分析[20, 36]、靈敏度不高的UV檢測(cè)器[21-23]、過(guò)于粗放的前處理方法[26]、穩(wěn)定性不佳的外標(biāo)法[23]占國(guó)內(nèi)研究主體。也有一些文獻(xiàn)的方法學(xué)研究做的比較完善，如針對(duì)魚(yú)肉組織和暫養(yǎng)水、環(huán)境水的研究比較深入，方法建立的比較完善，可供借鑒[18-19, 24]。

3　前處理技術(shù)研究概況

3.1　檢測(cè)方法的基質(zhì)

殘留檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)都是基于實(shí)際應(yīng)用中的社會(huì)需求所開(kāi)展的，除藥物濫用外，丁香酚主要是供鮮活水產(chǎn)動(dòng)物的運(yùn)輸使用，所以國(guó)內(nèi)外主要關(guān)注的研究基質(zhì)為水產(chǎn)動(dòng)物可食性肌肉組織和運(yùn)輸及暫養(yǎng)水體[4, 6-7, 10-15, 17-20, 22-28, 30-31, 35]，還有少數(shù)研究關(guān)注代謝過(guò)程中的血液樣品的丁香酚殘留情況[9, 21, 29-30, 36]。但水樣基質(zhì)的方法開(kāi)發(fā)的較少，僅有部分以血液、茴香茶和環(huán)境水樣品為基質(zhì)的方法開(kāi)發(fā)[27, 29-31]。國(guó)內(nèi)針對(duì)液體樣品基質(zhì)的方法相對(duì)數(shù)量多且更加具體，反映出國(guó)內(nèi)強(qiáng)烈的檢測(cè)需求和更細(xì)化的領(lǐng)域關(guān)注，如趙東豪等[19]和劉海新等[25]開(kāi)發(fā)的養(yǎng)殖水體中丁香酚殘留的HPLC-MS/MS檢測(cè)法和不確定度分析，柯常亮等[24]使用GC-MS/MS檢測(cè)純凈水中丁香酚的殘留。然而HPLC-MS/MS雖然檢測(cè)速度快卻消耗太多有機(jī)試劑，既不經(jīng)濟(jì)又不環(huán)保，而GC-MS/MS的研究相對(duì)簡(jiǎn)單，可深入優(yōu)化。

3.2　前處理方法的研究

所有丁香酚殘留檢測(cè)方法在拋去差異化的儀器設(shè)備和研究基質(zhì)的因素外，最大的區(qū)別就在于前處理技術(shù)。外文文獻(xiàn)主要選用LLE、SPE、UE、SPME、HS及幾種方法的串聯(lián)技術(shù)做丁香酚的殘留檢測(cè)前處理手段，使用的輔助吸附劑涵蓋丹磺酰氯、過(guò)濾棉和氯化鉀等，萃取溶劑則多使用甲醇、乙腈、正己烷、氫氧化鈉、丙酮和乙醇等[6-7, 27-28, 30-32, 35, 37-38]。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)則主要選用SPE、d-SPE、SPME和LLE方法，較少使用串聯(lián)的方法，輔助吸附劑多選擇PSA、C18、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和硅膠等，萃取溶劑則多使用甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正己烷等[18-26, 36]，國(guó)內(nèi)研究比國(guó)外研究在殘留檢測(cè)設(shè)備儀器和新型萃取技術(shù)方面有優(yōu)勢(shì)，但在傳統(tǒng)的前處理技術(shù)的串聯(lián)和方法細(xì)化方面還有一些差距。

目前，丁香酚的殘留檢測(cè)最常用的凈化方法如表3所示，可知SPE和液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)是研究中最常使用的前處理方式也是最穩(wěn)定方法，超聲萃取作為一種基本的前處理操作也可以用于丁香酚的殘留分析。

表3　丁香酚凈化方法評(píng)價(jià)Tab.3　The purification method reference table of eugenol and evaluation

注： LLE(liquid to liquid extraction)為液液萃?。籙E(ultrasonic extraction)為超聲萃?。籋S(headspace)為微波輔助萃??；SPE(solid-phase extraction)為固相萃?。籗PME(solid-phase microextraction)為固相微萃?。籨-SPE(dispersive solid phaseextraction)為基質(zhì)分散固相萃取。

關(guān)于3種常見(jiàn)的水產(chǎn)動(dòng)物前處理方法的流程圖如圖2所示。LLE是最經(jīng)典的萃取方法，但是因?yàn)橄挠袡C(jī)溶劑量大且萃取效率較低，被SPE法逐步取代。目前最經(jīng)典的從肌肉組織和水體中萃取有機(jī)物的前處理方式就是SPE，但SPE小柱作為實(shí)驗(yàn)耗材比較昂貴。近年來(lái)國(guó)際流行的趨勢(shì)著眼于開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、有效、經(jīng)濟(jì)、節(jié)省的前處理技術(shù)，基質(zhì)分散固相萃取(dispersive solid phaseextraction, d-SPE)方法因此誕生，該方法的優(yōu)點(diǎn)是需要的樣品量較少，可以有效萃取濃縮凈化復(fù)雜基質(zhì)中的目標(biāo)物，缺點(diǎn)是方法穩(wěn)定性有限，更適合于做科學(xué)研究，而針對(duì)大批量的樣品檢測(cè)，還應(yīng)選擇經(jīng)典的SPE方法提高準(zhǔn)確率和效率。

3.3　檢測(cè)設(shè)備儀器

丁香酚的殘留檢測(cè)方法按照檢測(cè)設(shè)備劃分可分為3大類(lèi)：第一類(lèi)是氣相色譜類(lèi)，使用的設(shè)備涵蓋GC-MS、GC-FID、GC-MS/MS、HS-GC/MS等，后兩者較為先進(jìn)和精準(zhǔn)；第二類(lèi)是液相色譜類(lèi)，使用的設(shè)備主要有HPLC-UV、HPLC-MS、HPLC-MS/MS這三種，后者最為精準(zhǔn)和先進(jìn)；第三類(lèi)是非常規(guī)設(shè)備類(lèi)，包含有流通液體閃爍計(jì)(LSC)和同位素稀釋測(cè)定儀(SIDA)等稀有設(shè)備[11, 27]，條件較為苛刻，且大多數(shù)檢測(cè)機(jī)構(gòu)不具備條件，參考價(jià)值低，如表1和表2所示。但是在檢測(cè)水產(chǎn)動(dòng)物中14C標(biāo)記的丁香酚的暴露水平和代謝途徑方面，非常規(guī)設(shè)備可以發(fā)揮出其無(wú)可替代的作用[35]。

3.4　氣相色譜內(nèi)標(biāo)法的內(nèi)標(biāo)物選擇及其質(zhì)譜參數(shù)

質(zhì)譜檢測(cè)已經(jīng)成為主流的殘留檢測(cè)的手段，國(guó)內(nèi)研究機(jī)構(gòu)多使用MS/MS技術(shù)提高檢測(cè)方法靈敏度和定性定量檢測(cè)準(zhǔn)確度，該技術(shù)可有效排除丁香酚殘留檢測(cè)過(guò)程中的基質(zhì)干擾[39]，在氣相和液相色譜法檢測(cè)丁香酚的殘留時(shí)都可以選用內(nèi)標(biāo)法以避免引入系統(tǒng)誤差，而對(duì)于可精準(zhǔn)定量的液相色譜法則可選用外標(biāo)法來(lái)降低選擇合適內(nèi)標(biāo)物的難度，對(duì)于常量分析或成分分析則可使用更簡(jiǎn)單的歸一化法[11-12, 19-25, 27-31, 35-36]。由于氣相色譜法具有最經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、定性定量準(zhǔn)確、易操作等優(yōu)點(diǎn)，最適合丁香酚的殘留檢測(cè)，相關(guān)文獻(xiàn)研究數(shù)目也最多，應(yīng)用最為廣泛，其中常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜參數(shù)總結(jié)如圖3和表4所示。

圖2　三個(gè)典型水產(chǎn)動(dòng)物基質(zhì)中丁香酚前處理方法對(duì)比Fig.2 Comparison of 3 pretreatment methods of eugenol residues in aquatic animals

圖3　丁香酚三維結(jié)構(gòu)圖以及丁香酚殘留檢測(cè)常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(a)丁香酚3D；(b)丁香酚；(c)d3-丁香酚；(d)百里香酚；(e)對(duì)二苯基苯；(f)二環(huán)己基甲醇；(g)甲基丁香酚。Fig.3 Chemical structures of eugenol and internal standards(a) eugenol 3D; (b) eugenol; (c) d3-eugenol;(d) thymol; (e) p-diphenylbenzene; (f) dicyclohexyl methanol;(g) methyl eugenol.

異丁香酚作為內(nèi)標(biāo)物時(shí)會(huì)發(fā)生隨儲(chǔ)存時(shí)間延長(zhǎng)而轉(zhuǎn)化為丁香酚的情況，甲基丁香酚在特定條件下也可以轉(zhuǎn)化為丁香酚，這兩種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)在選用時(shí)需要每次實(shí)驗(yàn)重新配置母液。對(duì)二苯基苯、百里香酚和二環(huán)己基甲醇與丁香酚結(jié)構(gòu)差異大，雖然也可以精準(zhǔn)定量，但存在基質(zhì)不同時(shí)響應(yīng)與丁香酚不同步的可能性。d3-丁香酚和14C-丁香酚是丁香酚的氘代內(nèi)標(biāo)，是最好的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)候選項(xiàng)，但也存在著價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，具體操作可根據(jù)需求選用合適的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

4　結(jié)語(yǔ)

丁香酚麻醉劑因具有毒性低、效率高、成本低等特點(diǎn)被應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物運(yùn)輸環(huán)節(jié)，但是丁香酚殘留對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量和人體健康可能存在潛在危害。由于丁香酚殘留的毒性沒(méi)有持久性環(huán)境污染物和農(nóng)藥殘留危害大，相關(guān)的方法學(xué)研究還不夠豐富。建議進(jìn)一步加強(qiáng)針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的運(yùn)輸和暫養(yǎng)水體檢驗(yàn)檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)、實(shí)際樣品的檢測(cè)、麻醉機(jī)理的研究等。該研究為運(yùn)輸環(huán)節(jié)的丁香酚合理使用提供了參考，對(duì)不同基質(zhì)樣品的檢驗(yàn)檢測(cè)提供了借鑒方法，對(duì)檢測(cè)設(shè)備應(yīng)用和參數(shù)設(shè)置情況提供了理論支撐。通過(guò)有效利用串聯(lián)四級(jí)桿技術(shù)配合內(nèi)標(biāo)法與合適的前處理技術(shù)檢測(cè)水體基質(zhì)中丁香酚殘留，提高水產(chǎn)動(dòng)物存活率、提升水產(chǎn)品的質(zhì)量、增加經(jīng)濟(jì)效益[40-42]。

表4　丁香酚殘留檢測(cè)常用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)及其質(zhì)譜參數(shù)Tab.4　Mass spectrometric acquisition parameters of the internal standard for measuring eugenol byGC/HPLC-MS/MS in SRM mode

注：*為定量離子。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊亞軍, 劉希望, 趙曉樂(lè), 等. 丁香酚解熱作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2016(5) : 24-27.

[2]Endo T, Ogishima K, Tanaka H, et al. Studies on the anesthetic effect of eugenol in some fresh water fishes[J]. Nihon-suisan-gakkai-shi, 1972, 38(7) : 761-767.

[3]李晉成, 劉歡, 王群, 等. 水產(chǎn)品中丁香酚的殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2014，5(11) : 3598-3602.

[4]Liaw S S, Perez V H, Zhou S, et al. Py-GC/MS studies and principal component analysis to evaluate the impact of feedstock and temperature on the distribution of products during fast pyrolysis[J]. J Analy Appl Pyrol, 2014, 109: 140 - 151.

[5]Saran S, Menon S, Shailajan S, et al. Validated RP-HPLC method to estimate eugenol from commercial formulations likeCaturjataChurna,LavangadiVati,JatiphaladiChurna,SitopaladiChurna, and clove oil[J]. J Pharm Res, 2013, 6(1): 53 - 60.

[6]Li J, Zhang J, Liu Y. Optimization of solid-phase-extraction cleanup and validation of quantitative determination of eugenol in fish samples by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Anal Bioanal Chem, 2015, 407(21): 6563 - 6568.

[7]Meinertz J R, Schreier T M, Porcher S T, et al. Evaluation of a method for quantifying eugenol concentrations in the fillet tissue from freshwater fish species[J]. J Aoac Int, 2016, 99(2): 558 - 564.

[8]Boyer S E, White J S, Stier A C, et al. Effects of the fish anesthetic, clove oil (eugenol), on coral health and growth[J]. Exp Mar Biol Ecol, 2009, 369(1): 53 - 57.

[9]Cupp A R, Hartleb C F, Fredricks K T, et al. Effectiveness of eugenol sedation to reduce the metabolic rates of cool and warm water fish at high loading densities[J]. Aquac Res, 2016, 47(1): 234 - 242.

[10]Becker A G, Parodi T V, Heldwein C G, et al. Transportation of silver catfish,Rhamdiaquelen, in water with eugenol and the essential oil ofLippiaalba[J]. Fish Physiol Biochem, 2012, 38(3): 789 - 796.

[11]Meinertz J R, Porcher S T, Smerud J R, et al. Determination of the exposure parameters that maximise the concentrations of the anaesthetic/sedative eugenol in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) skin-on fillet tissue[J]. Food Addit Contam A, 2014, 31(9): 1522 - 1528.

[12]Kildea M A, Allan G L, Kearney R E. Accumulation and clearance of the anaesthetics clove oil and AQUI-S from the edible tissue of silver perch (Bidyanusbidyanus)[J]. Aquaculture, 2004, 232(1): 265 - 277.

[13]Juell R A. The physiological stress response of bighead carpHypophthalmichthysnobilis, and the efficacy of three chemical anaesthetics in bighead carp fingerlings[D]. Trondleim：Norwegian University of Science and Techology，2013.

[14]Kaiser H, Brill G, Cahill J, et al. Testing clove oil as an anaesthetic for long-distance transport of live fish: the case of the Lake Victoria cichlidHaplochromisobliquidens[J]. J Appl Ichthyol, 2010, 22(6): 510 - 514.

[15]Zeppenfeld C C, Toni C, Becker A G, et al. Physiological and biochemical responses of silver catfish,Rhamdiaquelen, after transport in water with essential oil ofAloysiatriphylla(L′Herit) Britton[J]. Aquaculture, 2014, 418/419: 101-107.

[16]呂書(shū)為, 雷紅濤, 孫遠(yuǎn)明. 魚(yú)用麻醉劑安全性研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(1): 267 - 270.

[17]梁政遠(yuǎn), 安麗娜, 董在杰, 等. 丁香油對(duì)羅非魚(yú)的麻醉作用及其對(duì)血液指標(biāo)和激素水平的影響[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 18(5): 629 - 635.

[18]付曉蘋(píng), 彭婕, 李晉成, 等. 流通環(huán)節(jié)水產(chǎn)品及暫養(yǎng)水中孔雀石綠和麻醉劑風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2016, 7(12): 5040 - 5045.

[19]趙東豪, 王強(qiáng), 王旭峰, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚(yú)肉和暫養(yǎng)水中丁香酚殘留量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(24): 252 - 256.

[20]陳煥, 黃和, 高平, 等. 分散固相萃取-氣相色譜法同時(shí)測(cè)定水產(chǎn)品中六種丁香酚類(lèi)麻醉劑的殘留量[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(8): 88 - 92.

[21]焦亞琴, 呂世明, 譚艾娟, 等. 高效液相色譜法測(cè)定鯉魚(yú)血漿中丁香酚含量[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2016, 35(8): 2022 - 2026.

[22]陳煥, 黃和, 高平, 等. 高效液相色譜法測(cè)定水產(chǎn)品中丁香酚類(lèi)麻醉劑的殘留量[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2014, 40(12): 156 - 160.

[23]高平, 黃和, 劉文俠,等. 固相萃取-高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定水產(chǎn)品中4種丁香酚類(lèi)化合物[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2016, 28(1): 56 - 61.

[24]柯常亮, 劉奇, 陳潔文, 等. 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定水中丁香酚殘留[J]. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2014, 4(4): 49 - 55.

[25]劉海新, 余穎, 湯水粉, 等. 氣相色譜質(zhì)譜法測(cè)定養(yǎng)殖水體中丁香酚含量不確定度評(píng)定[J]. 漁業(yè)研究, 2016, 38(4): 310 - 317.

[26]蘆智遠(yuǎn), 劉辰乾, 馮歆軼, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法魚(yú)肉丁香酚的殘留量測(cè)定[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú), 2016(7): 76 - 77.

[27]Li J, Liu H, Wang C, et al. Determination of eugenol in fish and shrimp muscle tissue by stable isotope dilution assay and solid-phase extraction coupled gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry[J]. Anal Bioanaly Chem, 2016, 408(24): 6537 - 6544.

[28]Ye L. Development and validation of a LC-MS/MS method for the determination of isoeugenol in finfish[J]. Food Chem, 2017, 228:70 - 76.

[29]Beaudry F, Guénette S A, Vachon P. Determination of eugenol in rat plasma by liquid chromatography-quadrupole ion trap mass spectrometry using a simple off-line dansyl chloride derivatization reaction to enhance signal intensity[J]. Biome Chromatogr BMC, 2006, 20(11): 1216 - 1222.

[30]Schulz K, Schlenz K, Malt S, et al. Headspace solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry for the quantitative determination of the characteristic flavouring agent eugenol in serum samples after enzymatic cleavage to validate post-offence alcohol drinking claims[J]. J Chromatogr A, 2008, 1211(1): 113 - 119.

[31]Bilia A R, Flamini G, Taglioli V, et al. GC-MS analysis of essential oil of some commercial Fennel teas[J]. Food Chem, 2002, 76(3): 307 - 310.

[32]Li Y H, Sun Z H, Zheng P. Determination of vanillin, eugenol and isoeugenol by RP-HPLC[J]. Chromatographia, 2004, 60(11/12): 709 - 713.

[33]Meinertz J R, Hess K R. Evaluation of analytical techniques to determine AQUI-S?20E (eugenol) concentrations in water[J]. Aquaculture, 2014, 418/419:62- 66.

[34]Cupp A R, Fredricks K T, Porcher S T, et al. Survival and behavioural responses of cool and warm water fish sedated with AQUI-S?20E (10% eugenol) at high loading densities[J]. Aquacul Res, 2016: 1 - 14.

[35]Meinertz J R, Schreier T M, Porcher S T, et al. Depletion of eugenol residues from the skin-on fillet tissue of rainbow trout exposed to14C-labeled eugenol[J]. Aquaculture, 2014, 430: 74 - 78.

[36]張子為, 劉廣學(xué), 謝德媚, 等. 頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)灌胃細(xì)辛后小鼠腦、肝和血液中7個(gè)揮發(fā)性主要成分的定量分析研究[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2016, 41(2): 285 - 293.

[37]Meinertz J R, Greseth S L, Schreier T M, et al. Isoeugenol concentrations in rainbow trout (Oncorhynchusmykiss)skin-on fillet tissue after exposure to AQUI-STMat different temperatures, durations, and concentrations[J]. Aquaculture, 2006, 254(1/2/3/4): 347 - 354.

[38]Wang Z, Wang Q, Yang B, et al. GC-MS method for determination and pharmacokinetic study of four phenylpropanoids in rat plasma after oral administration of the essential oil ofAcorustatarinowiiSchott rhizomes[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 155(2): 1134 - 1140..

[39]李晉成, 劉歡, 馬兵, 等. 丁香酚的電噴霧負(fù)離子質(zhì)譜裂解規(guī)律研究[J]. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2013, 3(4): 11 - 14.

[40]蘇明明, 孫興權(quán), 楊春光, 等. 漁用麻醉劑MS-222、丁香酚在鮮活水產(chǎn)品運(yùn)輸中的應(yīng)用及檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào), 2015,6(1): 25 - 29.

[41]Harmon T S. Methods for reducing stressors and maintaining water quality associated with live fish transport in tanks: a review of the basics[J]. Rev Aquacult, 2010, 1(1): 58-66.

[42]李晉成, 劉歡, 吳立冬, 等. 動(dòng)物體內(nèi)麻醉劑殘留檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(5): 251-256.