梁協(xié)稠，陳湛如，許經(jīng)逵，封潔珠，伍嘉寶，徐劍英，高　宏，譚秋嬋，陳麗新，王立偉

(暨南大學醫(yī)學院 1.生理學系、2.藥理學系，廣東 廣州　510632；3.廣東省計劃生育科學技術(shù)研究所，廣東 廣州　510600；4.暨南大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，廣東 廣州　510632 )

龍腦(冰片)是龍腦香科常綠喬木植物龍腦香樹脂的加工品，或龍腦香的樹干經(jīng)蒸餾冷卻而得的結(jié)晶，具有廣泛的藥理學作用，如開竅醒神、清熱止痛等。龍腦可提高血腦屏障及黏膜的通透性[1-3]，明顯促進細胞對藥物的轉(zhuǎn)運和吸收，增加透皮性吸收作用，是理想的透皮促進劑[ 4- 5]。

血腦屏障由毛細血管內(nèi)皮細胞、周細胞和星形膠質(zhì)細胞構(gòu)成，其中血管內(nèi)皮細胞是其主要結(jié)構(gòu)。龍腦可能通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的縫隙鏈接，從而提高血腦屏障通透性，促進藥物通過血腦屏障[6]，但龍腦提高血腦屏障通透性和促進細胞對藥物吸收的機制尚未見闡明。人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)因其干細胞潛能特性，被廣泛應用于血管內(nèi)皮細胞實驗，常用于建立血腦屏障模型[7]。人體細胞內(nèi)分布最廣的陰離子通道是氯離子通道，其參與多種細胞的生理活動調(diào)節(jié)。氯通道是細胞容積調(diào)節(jié)的重要通道。ClC-3是ClC氯通道家族中的一員，是調(diào)節(jié)細胞容量的主要參與者[8-9]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，ClC-3氯通道是鼻咽癌細胞容積激活性氯通道的分子基礎(chǔ)之一，參與調(diào)節(jié)鼻咽癌細胞容積調(diào)節(jié)[8-11]。龍腦可以激活低分化鼻咽癌細胞容積敏感性氯通道，導致細胞容積縮小[10-11]。龍腦是否可以作用于血管內(nèi)皮細胞氯通道，減小內(nèi)皮細胞容積，從而調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞的縫隙鏈接，提高血腦屏障通透性，有待研究。本實驗擬利用膜片鉗技術(shù)、細胞動態(tài)成像研究左旋龍腦對HUVECs細胞氯通道的激活作用，siRNA干擾技術(shù)探討左旋龍腦激活HUVECs氯通道的分子機制，為進一步探討氯通道在血腦屏障中的作用提供實驗基礎(chǔ)。

1　材料

1.1細胞株本研究所用人臍靜脈內(nèi)皮細胞株(HUVECs)由中山大學藥理教研室惠贈。

1.2藥物與試劑左旋龍腦(L-borneol)購自Macklin公司，純度≥98%，用DMSO配制成20 mmol·L-1的儲存液，實驗時用細胞外等滲灌流液稀釋成20 nmol·L-1的工作液。4,4′-diisothiocyanostibibene-2,2′-disulfonic acid(DIDS)、5-nitro-2-(3-phenlpropylamino)benzoic acid(NPPB)均購于Sigma公司；DIDS溶解于DMSO中，配制成濃度為100 mmol·L-1的儲存液，實驗時稀釋成100 μmol·L-1的工作液；NPPB用甲醇配制成100 mmol·L-1儲存液，實驗時稀釋至100 μmol·L-1工作液。ClC-3 siRNA購自上海吉馬制藥技術(shù)有限公司，根據(jù)說明書用DEPE水配制成20 nmol·L-1儲存液，-20℃凍存。

1.3儀器PB-10 pH計(德國Sartorius公司)；Micro-Osmometer 滲透壓計(德國Loser公司)；微電極拉制器PC-10(日本Narishige公司)；EPC-7膜片鉗放大器(德國HEKA公司)；CED 1401數(shù)據(jù)采集器(英國Cambridge)。

2　方法

2.1細胞培養(yǎng)HUVEC細胞用含10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。間隔48 h用含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化傳代。

2.2膜片鉗實驗

2.2.1電極內(nèi)液、灌流液的配制等滲灌流液(isotonic solution, ISO)含(mmol·L-1): NaCl 70, MgCl20.5, CaCl22, HEPES 10，D-mannitol 140；配制好的ISO用Tris堿調(diào)pH值至7.4，滲透壓為300 mOsmol·L-1。電極內(nèi)液含(mmol·L-1)：N-methyl-d-glucamine chloride (NMDG-Cl) 70, MgCl21.2, EGTA 1, HEPES 10, D-mannitol 140, ATP 2。

2.2.2全細胞膜片鉗記錄常規(guī)消化HUVEC，吹打配制成單細胞懸液，滴加于直徑22 mm圓形玻片，靜置10 min，然后貼于灌流槽內(nèi)進行實驗。用微電極拉制器PC-10拉制玻璃微電極。用EPC-7膜片鉗放大器在全細胞電壓鉗制模式下記錄全細胞電流，鉗制細胞在0 mV、± 40 mV、± 80 mV循環(huán)往復，脈沖波寬200 ms，間隔4 s。用CED 1401采集電流和電壓信號，用EPC軟件(CED, Cambridge Electronic Design, UK)記錄并分析實驗數(shù)據(jù)。在等滲灌流下，記錄穩(wěn)定的基礎(chǔ)電流2～5 min，加入20 nmol·L-1左旋龍腦，待電流達到穩(wěn)定峰值，加入100 μmol·L-1NPPB或100 μmol·L-1DIDS阻斷電流，并計算抑制率=[(Cmax-Ciso)-(Cbloc-Ciso)]/(Cmax-Ciso)×100%，其中Ciso是等滲溶液中的基礎(chǔ)電流值，Cmax是激活電流最大值，Cbloc是加入阻斷劑后的最大效應時的電流值。

2.3siRNA干擾ClC-3基因的表達對照組無序siRNA(NC siRNA)正義鏈序列5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈序列5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′； ClC-3 siRNA 正義鏈序列5′-CAAUGGAUUUCCUGUCAUATT-3′，反義鏈序列5′-UAUGACAGGAAAUCCAUUGTA-3′。常規(guī)消化細胞種于6孔板中，24 h后進行siRNA轉(zhuǎn)染。用無血清、無抗生素的DMEM稀釋Mate(1 ∶20)和20 mol·L-1siRNA(1 ∶20)，靜置10 min。每孔加入200 μL稀釋液和1.8 mL無雙抗DMEM。培養(yǎng)箱孵育48 h后，提取蛋白進行Western blot分析；或消化細胞貼片進行膜片鉗記錄，分析用20 nmol·L-1左旋龍腦灌流后電流特性改變。

2.4細胞動態(tài)成像分析如同膜片鉗實驗處理細胞，細胞貼于玻片上，置于灌流槽中，在倒置熒光顯微鏡上，用Image Pro Plus 6.3軟件設(shè)置好動態(tài)拍攝，每1 min拍1幅圖像。實驗設(shè)對照組、左旋龍腦組、氯通道阻斷劑+左旋龍腦組。用Scion Image圖像分析軟件處理圖像，細胞容積：V=4/3×π×(S/π)3/2；用公式：Vst=Vt/Viso×100% 進行細胞容積標準化；其中Vt作為龍腦作用后的體積，Viso為ISO作用下的平均體積；細胞容積縮小率：V%=(Viso-Vmin)/Viso×100%，Vmin為左旋龍腦處理后細胞的最小容積。

3　結(jié)果

3.2氯通道阻斷劑NPPB和DIDS抑制左旋龍腦激活的氯電流20 nmol·L-1左旋龍腦激活HUVECs電流，待其穩(wěn)定后，分別加入100 μmol·L-1氯通道阻斷劑NPPB或100 μmol·L-1氯通道阻斷劑DIDS。如Fig 2所示，±80 mV電壓鉗制下，NPPB使激活的外向、內(nèi)向電流分別從(78.63±8.3)pA/pF下降到(18.23±2.83)pA/pF、(-53.18±5.48)pA/pF下降到(-13.14±2.50)pA/pF(P<0.01)，外向、內(nèi)向電流抑制率分別為(95.57±2.57)%、(94.58±2.13)%(P=0.78)。而灌流DIDS工作液后，外向、內(nèi)向電流分別從(80.36±6.67)pA/pF下降到(16.38±2.68)pA/pF、(-66.66±5.92)pA/pF下降到(-19.35±4.21)pA/pF(P<0.01)，外向、內(nèi)向電流抑制率分別為(97.28±6.36)%、(85.74±7.46)%(P=0.27)。NPPB和DIDS對外向、內(nèi)向電流的抑制率沒有統(tǒng)計學差異。以上結(jié)果進一步證實了左旋龍腦激活HUVECS的氯通道。

3.3siRNA干擾ClC-3基因表達對左旋龍腦激活氯電流的抑制作用在HUVECs與ClC-3 siRNA共培養(yǎng)48 h后，收集細胞進行Western blot檢測。如Fig 3所示， ClC-3氯通道蛋白表達被ClC-3 siRNA明顯沉默，與空白對照組(P=0.018)和NC siRNA組(P=0.028)相比，差異有統(tǒng)計學意義。

±80 mV電壓鉗制下，NC siRNA組HUVECs在20 nmol·L-1左旋龍腦溶液灌流后，外向、內(nèi)向電流密度分別激活至(69.95±10.05)pA/pF、(-52.50±8.73)pA/pF(Fig 4A、4C、4E)，與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.993)。ClC-3 siRNA組

Fig 1　L-borneol induced chloride currents in HUVECs (±s)

A: The typical time course of 20 nmol·L-1L-borneol induced currents in HUVECs; B: The current-voltage relationships of L-borneol initiated currents (n=9); C: Traces of Cisoin Cl-free ISO; D: Traces of L-borneol activated current.**P<0.01vsISO.

HUVECs在左旋龍腦溶液灌流后，外向、內(nèi)向電流密度僅為(27.03±3.89)pA/pF、(-24.85±2.23)pA/pF(Fig 4B、4D、4E)，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，與NC siRNA組相比差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)。進一步提示了左旋龍腦激活的氯電流可能由ClC-3氯通道蛋白介導。

3.4左旋龍腦對HUVEC容積影響如Fig 5A所示，灌流ISO 60 min，HUVECs細胞容積僅小幅波動。細胞外灌流20 nmol·L-1左旋龍腦溶液60 min時，HUVECs細胞容積減小(14.38±1.58)%(P<0.01)。胞外灌流100 μmol·L-1NPPB 可以阻斷左旋龍腦誘導的細胞容積減小，細胞容積僅減小(4.51±1.34)%，明顯小于左旋龍腦所引起細胞容積減小(P<0.01)。表明左旋龍腦可誘導細胞容積減小，阻斷氯通道可以抑制左旋龍腦誘導的細胞容積減小。

Fig 2　Inhibition of L-borneol induced current by NPPB and DIDS (±s)

A: The typical time course of 20 nmol·L-1L-borneol induced currents which inhibited by NPPB; B: The typical time course of 20 nmol·L-1L-borneol activated currents that suppressed by DIDS; C: Traces of L-borneol activated current suppressed by NPPB; D: Traces of activated-current suppressed by DIDS; E: The current-voltage relationships of L-borneol initiated currents and NPPB inhibited currents (n=4); F: The current-voltage relationships of L-borneol initiated currents and currents inhibited by DIDS (n=5).**P<0.01vsL-borneol.

Fig 3　ClC-3 siRNA knockdowned ClC-3 protein expression in HUVECs (±s, n=3)

A: ClC-3 protein expression detected with Western blot; B: The relative intensity of ClC-3 protein expression in different treatment.*P<0.05vscontrol group.

4　討論

左旋龍腦能明顯提高丹酚酸B的小腸吸收[3]，促進依文思藍和順鉑透過血腦屏障進入腦組織和膠質(zhì)瘤組織[4]，可以提高梔子苷的皮膚黏膜吸收[5]。龍腦因其引藥上行，促使藥物跨血腦屏障轉(zhuǎn)運，及其引藥旁行，促使藥物轉(zhuǎn)運和吸收。臨床上，龍腦多用于心腦血管疾病防治藥物的輔劑，如復方丹參滴丸、麝香保心丸、川冰噴霧劑、通竅膠囊等[12]。近年來，龍腦的作用引起研究者的關(guān)注，其中研究較多的是龍腦增加生物膜屏障通透性作用。有研究認為，龍腦開放血腦屏障機制在于抑制了P-gp的活性[13]，也有報道認為，龍腦是通過開放細胞間緊密連接、增加細胞吞飲小泡數(shù)量，從而提高屏障通透性[6]。

A: The time course of 20 nmol·L-1L-borneol activated currents inhibited by NPPB in HUVECs treated with negative control siRNA (NC siRNA); B: The time course of L-borneol induced currents in HUVECs treated with ClC-3 siRNA; C: Traces of current recording in HUVECs treated with NC siRNA; D: Traces of current recording in HUVECs treated with ClC-3 siRNA; E: The current-voltage relationships of ClC-3 siRNA group, negative siRNA group and blank control group.**P<0.01vsblank control group.

Fig 5　Chloride channels blocker inhibited cell volume changes induced by L-borneol (±s)

A: The cell volume changes of HUVECs in ISO bath (n=32), L-borneol (n=38) and L-borneol + NPPB (n=28) solution bath.**P<0.01vsISO;##P<0.01vsL-borneol; B: The cell images of different treatment at different time points.

氯通道參與多種細胞的生理活動調(diào)節(jié)，其中容積敏感性氯通道ClC-3是ClC氯通道家族中十分重要的一員，并在細胞容積、物質(zhì)轉(zhuǎn)運中起重要作用[8-9]。本實驗室前期對龍腦的研究顯示，龍腦可以激活鼻咽癌細胞CNE-2Z細胞氯電流，氯通道是龍腦促進阿霉素跨CNE-2Z細胞膜轉(zhuǎn)運和促進阿霉素、羅丹明跨血腦屏障的作用靶點[14]，而氯通道ClC-3在其中起重要作用。本實驗使用全細胞膜片鉗技術(shù)觀察到左旋龍腦可以開放HUVEC氯通道，明顯激活HUVEC氯電流。為進一步探討左旋龍腦激活HUVECs氯電流的分子機制，采用siRNA技術(shù)下調(diào)HUVECs細胞ClC-3氯通道蛋白的表達后，發(fā)現(xiàn)左旋龍腦激活HUVECs的氯電流較正常HUVECs激活的電流明顯減小，提示ClC-3氯通道可能是龍腦激活氯通道的主要分子基礎(chǔ)。

氯通道參與維持細胞容積和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。本實驗室前期研究結(jié)果顯示，當用低滲溶液灌流細胞時，細胞腫脹引起氯通道開放，觸發(fā)調(diào)節(jié)性細胞容積回縮，從而維持細胞容積。當用抗腫瘤等藥物灌流細胞時，細胞容積發(fā)生容積凋亡性縮小[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，左旋龍腦對HUVEC細胞容積減小作用明顯，結(jié)合其對HUVEC氯通道開放作用，表明左旋龍腦大量開放氯通道，使Cl-和水外流誘發(fā)HUVEC細胞容積減小。細胞容積是縫隙連接通道的調(diào)控因素，細胞皺縮時，可探測到縫隙連接通道的開放。因此，左旋龍腦很可能通過激活氯通道，觸發(fā)細胞容積減小，開放縫隙連接，從而增加生物屏障通透性。這為進一步探討氯通道在左旋龍腦提高血腦屏障通透性和促進細胞吸收藥物中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。

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