劉傳志，李偉，劉桂瑩，楊羽，宮平，侯玥

長(zhǎng)春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春　130021

目前臨床上PCT的檢測(cè)方法主要有兩種：半定量法和定量法[1-5]。半定量法主要是膠體金法，但其只能依靠肉眼觀察顏色深淺來(lái)估計(jì)PCT含量的大概范圍，人的主觀性較強(qiáng)，影響后期用藥。定量法主要是免疫發(fā)光法，臨床應(yīng)用較多，但其對(duì)檢測(cè)人員的專業(yè)化水平要求較高，應(yīng)用限制也較大。

熒光定量免疫層析是免疫熒光技術(shù)和傳統(tǒng)免疫層析技術(shù)相結(jié)合，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、便攜性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果更為精確和靈敏[6-9]。熒光標(biāo)記物采用一種新型標(biāo)記方法——量子點(diǎn)(Quantum dots，ODs)，它是一種半導(dǎo)體熒光納米材料，具有激發(fā)譜線范圍寬、發(fā)射譜線窄、發(fā)光效率高、發(fā)光顏色可調(diào)、光穩(wěn)定性好等優(yōu)良特征，十分適合作為熒光標(biāo)記物[10-13]。2009年宋健等[14]首次應(yīng)用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體對(duì)心肌肌鈣蛋白進(jìn)行特異性定量檢測(cè)，檢測(cè)限達(dá) 0.4 μg/L，比其他方法的最低檢出度降低了 10倍。2014年，Taranova等[15]研究了一種基于多色量子點(diǎn)同步時(shí)檢測(cè)牛奶中多種抗生素的方法，氧氟沙星、氯霉素、鏈霉素的檢測(cè)限分別達(dá)0.3、0.12、0.2 ng/mL，且僅在10 min中內(nèi)就能完成檢測(cè)。此種方法不僅快速、成本低，而且具有高特異性和靈敏性。建立一種操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高的PCT檢測(cè)方法，定量檢測(cè) PCT的含量為開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品及試劑盒提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，對(duì)臨床治療和檢測(cè)具有重大實(shí)際價(jià)值[16-20]。本文利用實(shí)驗(yàn)室已純化好的降鈣素原抗原，經(jīng)弗氏佐劑混合免疫Balb/c小鼠制備PCT多克免疫腹水、取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合制備單克隆抗體；將制備得到的抗體與 CdSe/ZnS量子點(diǎn)偶聯(lián)，研究一種基于量子點(diǎn)標(biāo)記的熒光免疫層析方法，制備出試紙條，設(shè)立對(duì)照C線，并對(duì)檢測(cè)的T線進(jìn)行了分析檢測(cè)范圍、誤差、穩(wěn)定性等。對(duì)制備的試紙條行了初步應(yīng)用，與現(xiàn)有市售產(chǎn)品進(jìn)行了檢驗(yàn)比對(duì)，檢測(cè)效果較好，可用于替代進(jìn)口產(chǎn)品。

1　材料

1.1　實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備

熒光檢測(cè)儀TBS-380購(gòu)于上海捷寧生物科技有限公司；YHQ-LS-50A型立式壓力蒸汽滅菌器；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)；BioTeK Synergy型多功能微孔板檢測(cè)儀；Galaxy170s型CO2培養(yǎng)箱；三維劃膜噴金儀購(gòu)于上海金標(biāo)實(shí)業(yè)有限公司；Deaou-308C熒光檢測(cè)儀購(gòu)于迪奧生物生物科技有限公司。

1.2　材料與藥品

新西蘭大耳兔、Balb/c小鼠購(gòu)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；SP2/0骨髓瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室存種；血清樣本來(lái)自長(zhǎng)春461醫(yī)院。

PCT抗原為本實(shí)驗(yàn)制備保存；聚乙二醇、HAT培養(yǎng)液、HT培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素購(gòu)于美國(guó)SIGMA公司；培養(yǎng)細(xì)胞用小牛血清購(gòu)于杭州四季青公司；蛋白親和層析柱購(gòu)于Amersham；量子點(diǎn)CdSe/ZnS購(gòu)于深圳海王英特龍生物有限公司；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和 N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS) 購(gòu)于深圳海王英特龍生物有限公司；試紙條材料購(gòu)于上海杰一公司；降鈣素原 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于德國(guó)IBL公司。

2　方法

2.1　PCT抗體的制備

取實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)制備純化好的PCT抗原，免疫新西蘭大白兔，經(jīng)4次兔子皮下多點(diǎn)注射免疫接種，每只兔子注射蛋白20 μg。免疫完成5 d后進(jìn)行耳緣靜脈采血測(cè)定效價(jià)，達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后2周進(jìn)行頸動(dòng)脈采血，離心分離血清，采用間接ELISA方法測(cè)定效價(jià)，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃度，分裝后于–20 ℃冰箱保存。

選取3只6周齡的Balb/c鼠，用實(shí)驗(yàn)室已制備好的PCT抗原進(jìn)行免疫，經(jīng)4次小鼠皮下多點(diǎn)注射免疫接種。第4次免疫7 d后，斷尾取血，用ELISA方法測(cè)定血清中抗體效價(jià)。選取免疫效價(jià)高小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞sp2/0進(jìn)行融合，培養(yǎng)10–20 d，用間接ELISA方法篩選產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞，有限稀釋法進(jìn)行3次克隆化，將最后克隆出的細(xì)胞株注入小鼠腹腔得到腹水。

收集細(xì)胞破碎離心，回收蛋白，抗體純化采用辛酸-硫酸銨法得到初步純化的抗體，然后再經(jīng)親和層析柱得到最終純化的抗體。純化抗體用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其濃度，ELISA法測(cè)其效價(jià)，并用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采取無(wú)關(guān)蛋白BSA、CRP和常見交叉物CT、CGRP為對(duì)照對(duì)其特異性進(jìn)行鑒定。

2.2　PCT抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)及試紙條的制備

活化量子點(diǎn)CdSe，通過(guò)透射電鏡進(jìn)行分析。用MES緩沖液進(jìn)行初洗3次，然后用EDC和NHS避光活化，加入PCT抗體偶聯(lián)過(guò)夜，次日離心收集沉淀，用緩沖液重懸，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后即可使用。

在硝酸纖維素膜上用劃線機(jī)劃好由 PCT-自備鼠源抗體形成的檢測(cè)線，將制備好的量子點(diǎn)標(biāo)記的PCT單抗均勻地加在釋放墊上，并用凍干機(jī)冷凍干燥2 h，完成后，將樣品墊、釋放墊、硝酸纖維膜和吸水紙依次疊加組裝，用機(jī)器切割成寬為0.4 cm、長(zhǎng)為7 cm大小的試紙條。

2.3　PCT質(zhì)控線控制和特異性

質(zhì)控線C的制備：羊抗鼠二抗質(zhì)控線于硝酸纖維素膜上，膠體金與抗體的連接同PCT-自備鼠源抗體的方法相同。

取血清中常見干擾物質(zhì)膽紅素 (2.0 g/L)、三酰甘油(30.0 g/L)和 PCT常見干擾物CGRP (10 μg/L)來(lái)進(jìn)行試紙條的特異性檢測(cè)。每種物質(zhì)重復(fù)進(jìn)行3次檢測(cè)。

2.4　PCT試紙條的性能測(cè)試

將試紙條依次排開，取80 μL待測(cè)樣品加到樣品墊上，每個(gè)待測(cè)樣品重復(fù)檢驗(yàn)6次，10 min后，用熒光檢測(cè)儀測(cè)定其熒光值，取其平均值。

2.4.1　檢測(cè)范圍

對(duì)PCT蛋白濃度進(jìn)行梯度稀釋，分別為750、350、150、80、50、30、15、7.5、3.5、0.15、0.075 μg/L，每個(gè)濃度作6個(gè)試紙條，用熒光檢測(cè)儀測(cè)定，剔除跳值，取其平均值制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4.2　靈敏度

將PCT抗原從1.5 μg/L的濃度用PB液開始稀釋 1.5、0.15、0.075、0.015、0.007 5、0.001 5 μg/L，確定該方法的最低檢出量，即為靈敏度。

2.4.3　回收率

定量檢測(cè)方法的回收實(shí)驗(yàn)作為評(píng)估準(zhǔn)確度的一種方法，可用于對(duì)定量檢測(cè)方法準(zhǔn)確測(cè)定加入純分析物的能力進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果的表示指標(biāo)是回收率。采用基礎(chǔ)樣本PCT抗原濃度為5 μg/L，分別向其中加入不同濃度的PCT抗原，檢測(cè)其回收濃度，并計(jì)算出回收率。

2.4.4　精密度

分別選取不同濃度共6個(gè)血清樣本進(jìn)行批內(nèi)精密度測(cè)定，一個(gè)批次的試紙條1 d內(nèi)檢測(cè)完成，為熒光免疫層析法檢測(cè)PCT批內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。取10 d每天做一個(gè)批次的試紙條，每天檢測(cè) 6個(gè)濃度的PCT抗原樣本并重復(fù)檢測(cè)2次取平均值，10 d的批間實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)算其平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)。

2.4.5　穩(wěn)定性

根據(jù)4 ℃蛋白保存變性標(biāo)準(zhǔn)，放置37 ℃、3 d相當(dāng)于置于4 ℃半年，放置37 ℃、3 d相當(dāng)于置于4 ℃一年。將制備好的試紙條分3次檢測(cè)，第1次是制備好后37℃第2天檢測(cè)，第2次是置于37 ℃培養(yǎng)箱第3天檢測(cè)，第3次是置于37 ℃培養(yǎng)箱第6天再進(jìn)行檢測(cè)，每次檢測(cè)6個(gè)濃度，分別編號(hào)A–F每個(gè)濃度檢測(cè)3次，取平均值后，比較3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.5　PCT試紙條的臨床樣品測(cè)試

利用進(jìn)口降鈣素原ELISA檢測(cè)試劑盒與本文所建立的熒光免疫試紙條方法，分別檢測(cè)從長(zhǎng)春461醫(yī)院帶回的血清樣本，共15例，其中3例為正常人血清即無(wú)細(xì)菌感染，12例為不同程度細(xì)菌感染的血清，初步分析測(cè)量的準(zhǔn)確性。將樣品血清標(biāo)記好，分別標(biāo)記為1–15號(hào)，逐個(gè)滴加到試紙條上，每個(gè)試紙條加 80 μL，每個(gè)樣品加 3個(gè)試紙條。用熒光檢測(cè)儀分別檢測(cè)出各個(gè)試紙條的熒光值，并計(jì)算平均值，將其代入建立出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求出血清樣品中PCT的含量。

3　結(jié)果與分析

3.1　PCT抗體效價(jià)測(cè)定

通過(guò)間接ELISA方法，PCT抗原以2 μg/mL進(jìn)行包被，測(cè)得PCT多克隆抗體效價(jià)可達(dá)5×105。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量6 mg/mL。經(jīng)過(guò)多次檢測(cè)篩選出陽(yáng)性單克隆的細(xì)胞株分別命名為2F5、5C9，制備腹水測(cè)效價(jià)結(jié)果如表1所示，表明得到的PCT單抗效價(jià)達(dá)107。

經(jīng)純化后濃縮的單抗，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白含量為4 mg/mL，純化后抗體的效價(jià)能達(dá)到1×105，SDS-PAGE分析結(jié)果見圖1。

3.2　PCT抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)檢測(cè)及試紙條制備

將EDC和NHS濃度分別稀釋至原來(lái)的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32進(jìn)行活化，抗體和量子點(diǎn)的偶聯(lián)時(shí)間為過(guò)夜，分別8 h、10 h、12 h、14 h、16 h。提示活化劑濃度為原來(lái)的1/32時(shí)，偶聯(lián)時(shí)間在10 h時(shí)形成較為均勻的溶液，鑒定結(jié)果見圖2，其中泳道2–6是在偶聯(lián)10 h且EDC和NHS濃度分別稀釋至原來(lái)的 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32時(shí)CdSe/ZnS-PCT的凝膠電泳圖，提示量子點(diǎn)同蛋白的偶聯(lián)分布均勻，得到彌散的條帶，其中泳道 1是量子點(diǎn)CdSe/ZnS。

表1　ELISA方法檢測(cè)單抗效價(jià)結(jié)果Table 1　Monoclonal antibody titer by ELISA

圖1　SDS-PAGE檢測(cè)PCT抗體Fig. 1　Detection of PCT antibody by SDS-PAGE. M:marker; 2: unpurified antibody; 3: purified antibody.

圖2　瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCT與量子點(diǎn)偶聯(lián)Fig. 2　Detection of PCT coupling with quantum dots by AGE.

3.3　PCT質(zhì)控線控制和特異性

干擾物質(zhì)膽紅素、三酰甘油和CGRP加入試紙條中，均沒有產(chǎn)生條帶，證明該試紙條特異性良好。實(shí)驗(yàn)圖3試紙條特異性良好，左上：PCT抗原，左下：膽紅素，右上：三酰甘油，右下：CGRP。

圖3　PCT熒光免疫試紙條特異性測(cè)定Fig. 3　Detection of the specificity of PCT fluorescent immumoassay strip.

3.4　PCT試紙條的性能測(cè)試結(jié)果

3.4.1　檢測(cè)范圍

利用制備的PCT單抗，與各個(gè)濃度的抗原重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)后，所加的PCT抗原濃度為橫坐標(biāo)，所測(cè)得的熒光值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 4所示，方程為y=30.322x+250.73，R2值為0.990 6。而在濃度達(dá)到0.15 μg/L時(shí)，熒光值趨近與0，PCT抗原濃度150 μg/L時(shí)，熒光值5 700，已不再該線性范圍內(nèi)，不再滿足線性方程。此方法的線性檢測(cè)范圍是 0.15–120 μg/L。

3.4.2　靈敏度

將PCT抗原從0.75 μg/L的濃度用PB液開始稀釋，做2倍濃度的稀釋，由于Deaou-308C熒光檢測(cè)儀的限制，直至儀器檢測(cè)不出熒光值為止，這時(shí)PCT抗原濃度0.007 μg/L (表2)。

3.4.3　回收率

采用基礎(chǔ)樣本PCT抗原濃度為5 μg/L，分別向其中加入10種不同樣品濃度的PCT抗原，檢測(cè)其回收濃度，并計(jì)算出回收率，結(jié)果如表3所示，該方法的回收率達(dá)91%–113%。

3.4.4　精密度

通過(guò)1個(gè)批次的熒光測(cè)定和10個(gè)批次的取樣測(cè)定熒光值并計(jì)算相關(guān)±s、AD、CV 值等，檢測(cè)結(jié)果見表4，批內(nèi)、批間的變異系數(shù)均在8.0%以下，P<0.05制備的試紙條精密度良好。

圖4　熒光免疫層析法所測(cè)得的PCT標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4　PCT standard curve by fluorescence immune chromatography.

表2　熒光免疫層析法檢測(cè)PCT的靈敏度Table 2　Sensitivity of PCT by fluorescence immune chromatography

表3　熒光免疫層析法回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3　Recovery rate of the fluorescence immune chromatography

3.4.5　穩(wěn)定性

在第2天、第3天、第6天進(jìn)行不同濃度樣品檢測(cè)，結(jié)果相差相近，表明PCT熒光免疫層析試紙條在37 ℃下，6 d內(nèi)可保持穩(wěn)定，3次的熒光值相對(duì)均一，變化不大，試紙條 4℃可保持大約一年的生物穩(wěn)定性。檢測(cè)結(jié)果如表5所示。

3.5　PCT試紙條的臨床樣品測(cè)試結(jié)果

將樣品血清標(biāo)記好，分別標(biāo)記為 1–15號(hào)，逐個(gè)滴加到試紙條上，每個(gè)試紙條加80 μL，靜置5 min，每個(gè)樣品加3個(gè)試紙條。用熒光檢測(cè)儀分別檢測(cè)出各個(gè)試紙條的熒光值，并計(jì)算平均值，將其代入建立出的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出血清樣品中PCT的含量，計(jì)算結(jié)果見表6。

表4　熒光免疫層析法的批內(nèi)與批間變異Table 4　Result of coefficient of variation fluorescence immune chromatography

表5　PCT熒光試紙條的穩(wěn)定性檢測(cè)值Table 5　Stability test by PCT fluorescence immune chromatography

表6　熒光免疫層析方法檢測(cè)血清樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6　Result of serum samples test by fluorescence immune chromatography

根據(jù)購(gòu)買的某公司ELISA試劑盒提供的PCT標(biāo)準(zhǔn)品繪制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)各個(gè)濃度及其吸光度值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，為之后樣品濃度檢測(cè)做鋪墊，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.009 1x+0.321 71，其中R2=0.995 85。表7是樣品PCT濃度計(jì)算結(jié)果。

表7　ELISA方法檢測(cè)血清樣本實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7　The result of serum samples test by ELISA

從表6、7中可以看出，檢測(cè)的15個(gè)血清樣本結(jié)果與市售的進(jìn)口試劑盒檢測(cè)值相近，具有一定的相關(guān)性，有一定的臨床意義。而且建立的方法比市場(chǎng)上的 ELISA試劑盒的檢測(cè)方法更為方便、快捷，操作人員不需要任何專業(yè)技能，表明建立的PCT熒光免疫層析方法的初步應(yīng)用比較成功。但考慮到檢測(cè)的臨床樣品相對(duì)數(shù)量較少，與市售產(chǎn)品比較還需要更多的血清樣本，所以該方法臨床應(yīng)用還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4　討論

PCT作為一種具有更高的特異性和靈敏度的臨床診斷生物標(biāo)志物并且可以指導(dǎo)抗生素的臨床應(yīng)用，研究其定量檢測(cè)方法將具有廣闊的應(yīng)用前景[21-24]。通過(guò)制備出高特異性及高效價(jià)的抗體，并成功標(biāo)記量子點(diǎn)，建立得到PCT的熒光免疫層析方法。檢測(cè)范圍 0.15?120 μg/L，靈敏度 0.007 μg/L，回收率91%?113%，批內(nèi)批間變異系數(shù)小于0.1，與血清中其他蛋白沒有交叉反應(yīng)，特異性高，4 ℃放置一年穩(wěn)定性良好，并與市售的進(jìn)口降鈣素原ELISA試劑盒進(jìn)行對(duì)比，檢測(cè)結(jié)果表明兩種方法的檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，并且具有更寬的檢測(cè)范圍、更低的靈敏度及較高的便捷性。同時(shí)本方法所用的主要試劑均為國(guó)產(chǎn)和自制所得，生產(chǎn)成本低，未來(lái)在市場(chǎng)上的售價(jià)也將是低于其他診斷試劑，且熒光檢測(cè)儀器便攜，可在患者身旁20 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，臨床推廣應(yīng)用將具有廣闊的空間。但本試紙條的開發(fā)在于市售的產(chǎn)品比較中相對(duì)樣本較少，只有15個(gè)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)中還欠缺比較意義，還需要更多的臨床樣本進(jìn)行對(duì)照。本熒光檢測(cè)試紙條的開發(fā)旨在為PCT臨床上檢測(cè)提供更加簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法，對(duì)PCT的早期診斷及臨床檢驗(yàn)有應(yīng)用價(jià)值。

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