桑亞通，沈丹，陳偉，產(chǎn)舒恒，顧浩，高波，宋成義

揚(yáng)州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州　225009

增強(qiáng)子是能強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄起始的一段DNA序列，最早是由Benerji在SV40DNA中發(fā)現(xiàn)[1]，隨后在病毒及真核生物基因組中均發(fā)現(xiàn)了增強(qiáng)子元件的存在。已有研究表明增強(qiáng)子在基因表達(dá)調(diào)控中通過介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子與靶基因的結(jié)合，參與基因的表達(dá)調(diào)控，發(fā)揮重要作用。與啟動(dòng)子不同的是，增強(qiáng)子對(duì)基因的調(diào)控不具有方向性，且不受兩者距離的影響，無(wú)論位于基因的上游或下游，甚至基因的內(nèi)含子中，均可調(diào)控靶基因的表達(dá)[2-3]。因此，增強(qiáng)子的獲得對(duì)于研究基因表達(dá)調(diào)控模式具有重要意義，但傳統(tǒng)方法進(jìn)行增強(qiáng)子注解效率低下。研究證實(shí)增強(qiáng)子捕獲技術(shù)是一種有效的增強(qiáng)子注釋方法[4]，最早在 1979年 Casadaban等以LacZ為目的基因，將一個(gè)啟動(dòng)子缺失的乳糖操縱子載體通過噬菌體感染隨機(jī)整合到大腸桿菌基因組上，最終獲得了一些特異性表達(dá)的基因[5]。受此研究啟發(fā)，研究人員對(duì)啟動(dòng)子捕獲載體進(jìn)行改造，將一個(gè)報(bào)告基因和最小啟動(dòng)子融合取代缺失啟動(dòng)子的報(bào)告基因，該啟動(dòng)子不能單獨(dú)驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，而當(dāng)插入位點(diǎn)附近存在增強(qiáng)子元件時(shí)，則啟動(dòng)子被激活從而驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，這種方法即為增強(qiáng)子捕獲。首個(gè)轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲載體是基于P轉(zhuǎn)座子設(shè)計(jì)的，以β-半乳糖苷酶基因?yàn)閳?bào)告基因，成功應(yīng)用于果蠅的增強(qiáng)子捕獲研究[6]。之后，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)增強(qiáng)子捕獲技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物的增強(qiáng)子研究。Grabher等[7]在青中成功應(yīng)用了以轉(zhuǎn)座子為介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)，Balciunas等[8]利用SB轉(zhuǎn)座子，在斑馬魚中進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲研究，獲得了9種具有不同的組織或器官特異性GFP表達(dá)模式的斑馬魚品系。除此之外，研究人員對(duì)增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)進(jìn)行改進(jìn)，利用酵母雙元雜交系統(tǒng) (Gal4-UAS) 進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲。目前，二元的Gal4-UAS系統(tǒng)也已經(jīng)成功應(yīng)用于斑馬魚和果蠅的增強(qiáng)子捕獲研究[9-11]。

斑馬魚作為研究脊椎動(dòng)物的模型，具有養(yǎng)殖方便、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、胚胎體外受精、體外發(fā)育、胚體透明等優(yōu)點(diǎn)，已成為生命科學(xué)研究的重要工具。近年來(lái)，Tol2轉(zhuǎn)座子已成功應(yīng)用于斑馬魚的增強(qiáng)子捕獲研究[12]。本研究通過sp-PCR、原位雜交和比較基因組學(xué)等技術(shù)手段對(duì)本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲品系 (TK4) 進(jìn)行鑒定，以期解析所捕獲的增強(qiáng)子。

1　材料與方法

1.1　材料

Tuebingen斑馬魚購(gòu)自國(guó)家斑馬魚資源中心；Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚 F1代TK4系為本實(shí)驗(yàn)室制備。

基因組提取試劑盒、純化試劑盒、切膠回收試劑盒購(gòu)自寶生物工程有限公司；限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ、T4 DNA連接酶、退火緩沖液均購(gòu)自NEB有限公司；無(wú)RNA酶DNaseⅠ、RNAsein、NaOH、鏈酶蛋白酶、多聚甲醛、PTU、HEPES、Tween20、tRNA、肝素鈉、苯酚、氯仿、HCl、BCIP、NBT等購(gòu)自Sigma公司；地高辛標(biāo)記RNA混合液、蛋白酶 K、羊抗地高辛標(biāo)記物抗體等購(gòu)自Roche公司；轉(zhuǎn)錄緩沖液、T7 RNA聚合酶等購(gòu)自Promega公司；去離子甲酰胺購(gòu)自CarloErba；羊血清、無(wú)水甲醇、NaCl、KCl、MgCl2、無(wú)水乙醇等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2　TK4系斑馬魚的來(lái)源與熒光檢測(cè)

TK4系由本實(shí)驗(yàn)室前期通過Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)制備的穩(wěn)定增強(qiáng)子捕獲品系F1代，該轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)子捕獲載體中含一個(gè) krt4 (keratin4) 迷你啟動(dòng)子和GFP表達(dá)盒 (圖1A)。將TK4系與TU系野生型斑馬魚進(jìn)行交配，獲得F2代胚胎，在E3溶液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時(shí)期以備熒光檢測(cè)。在體式熒光顯微鏡 (M165FC,Lecia,德國(guó)) 下觀察不同時(shí)期的胚胎GFP的表達(dá)并做好記錄。本實(shí)驗(yàn)中觀察的胚胎GFP的表達(dá)時(shí)期分別是6 hpf、24 hpf、48 hpf、3 dpf、4 dpf、5 dpf。

1.3　轉(zhuǎn)基因在基因組上插入位點(diǎn)鑒定

參照文獻(xiàn)[13]，通過sp-PCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因在基因組上插入位點(diǎn)鑒定。首先根據(jù)轉(zhuǎn)座元件序列設(shè)計(jì)兩輪PCR引物，接頭序列參考文獻(xiàn)[13]，引物序列及接頭序列如表1所示。然后進(jìn)行sp-PCR，具體步驟如下：采用 TaKaRa的基因組提取試劑盒提取飼養(yǎng) 20 d的 F2代斑馬魚的基因組，用Sau3AⅠ對(duì)基因組進(jìn)行酶切，以產(chǎn)生 GATC末端進(jìn)行后續(xù)接頭連接。50 μL反應(yīng)體系為：基因組DNA 5 μL，10×NEB 緩沖液 5 μL，Sau3AⅠ3 μL，雙蒸水補(bǔ)齊至50 μL。將反應(yīng)體系置于37 ℃過夜處理，之后用DNA片段純化試劑盒 (TaKaRa公司) 進(jìn)行純化并用45 μL雙蒸水洗脫。接頭連接50 μL 體系包括：基因組酶切 37 μL，10× T4 DNA連接酶緩沖液5 μL，接頭6 μL，T4 DNA連接酶(400 U/μL) 2 μL；連接反應(yīng)條件：16 ℃，16 h。其中，使用 SPLNK-BOT 2 μL，SPLNK-GATC-TOP 2 μL，退火緩沖液46 μL進(jìn)行接頭合成。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃、3 min；自然降至室溫。之后進(jìn)行兩輪PCR，其中第一輪PCR體系 (50 μL) 為：連接基因組 DNA 10 μL，雙蒸水 11 μL，2×Taqmix 25 μL，SPLINK 1 2 μL，Tol2/ SP1R 2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃2 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第二輪PCR體系 (50 μL) 為：第一輪 PCR 產(chǎn)物1 μL，雙蒸水 20 μL，2×Taqmix 25 μL，SPLINK 2 2 μL，Tol2/SP2R 2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35 個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min。反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物在 1.2%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行電泳檢測(cè)并切膠回收，測(cè)序。

1.4　增強(qiáng)子注解

將測(cè)序獲得的染色體側(cè)翼 DNA序列通過BLASTN與 ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(GRCz10) 進(jìn)行比對(duì)。為了檢測(cè)整合位點(diǎn)附近的增強(qiáng)子元件，再?gòu)腅nsembl瀏覽器上下載斑馬魚Danio rerio、青Oryzias latipes、東方紅鰭Takifugu rubripes、秀美花Poecilia formosa、羅非魚Oreochromis niloticus、矛尾魚 Latimeria chalumnae、非洲爪蟾Xenopus tropicalis、雞Gallus gallus、大鼠Rattus norvegicus、小鼠Mus musculus、人Homo sapiens的整合位點(diǎn)側(cè)翼序列上下游各50 kb區(qū)域的基因組序列 (www.ensembl.org)，并將所得到的序列進(jìn)行比對(duì)分析 (http://genome.lbl.gov/vista/mvista/submit.shtml)。

1.5　原位雜交

根據(jù)插入位點(diǎn)處的內(nèi)源基因rps26編碼序列設(shè)計(jì)反義RNA原位雜交探針，探針rps26-001以及探針rps26-201引物序列 (表2)。采用地高辛和T7 RNA聚合酶標(biāo)記合成反義RNA探針。參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行斑馬魚胚胎原位雜交，通過體式顯微鏡 (M165FC，Lecia，德國(guó)) 采集圖片。

2　結(jié)果與分析

2.1　F2代胚胎不同發(fā)育時(shí)期GFP表達(dá)

將 TK4系F1與TU系斑馬魚進(jìn)行雜交，收集胚胎于 E3培養(yǎng)液中培養(yǎng)至特定的發(fā)育時(shí)期進(jìn)行觀察并拍照記錄。結(jié)果如圖1所示，在胚胎發(fā)育至6 hpf未觀察到GFP表達(dá) (圖 1B)，在胚胎發(fā)育至24 hpf時(shí)觀察到GFP表達(dá)，表達(dá)部位主要集中于頭部和軀干 (圖 1C)。隨著發(fā)育時(shí)間的延長(zhǎng)，組織器官逐漸分化，48 hpf時(shí)GFP表達(dá)部位主要集中于頭部、眼睛、下頜、脊髓和肌肉等(圖 1D)。從 48 hpf發(fā)育至 5 dpf，GFP表達(dá)部位基本穩(wěn)定，主要集中于中腦、后腦、眼睛、下頜和脊髓，肌肉的GFP熒光表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱(圖 1E–G)。

表1　sp-PCR引物序列與接頭序列[13]Table 1　sp-PCR primers and linker sequences[13]

表2　探針rps26-001與rps26-201引物序列Table 2　Probe rps26-001and rps26-201 primer sequences

圖1　TK4增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的熒光表達(dá)情況 (A：TK4增強(qiáng)子捕獲品系轉(zhuǎn)基因構(gòu)件示意圖；B–G為不同發(fā)育階段胚胎熒光檢測(cè))Fig. 1　GFP-expression of TK4 enhancer trapping transgenic zebrafish at different developmental stages. (A)Transgenic components of TK4 enhancer trapping line. (B–G) GFP-expression at different developmental stages.

2.2　增強(qiáng)子捕獲轉(zhuǎn)基因斑馬魚的增強(qiáng)子注解

將測(cè)序結(jié)果中得到的Tol2轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼DNA序列在ENSEMBL的斑馬魚基因組數(shù)據(jù)庫(kù) (GRCz10) 中進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示捕獲載體插入23號(hào)染色體rps26基因的intron1中，且報(bào)告基因的插入方向與rps26基因的方向相反。從Ensembl瀏覽器上下載斑馬魚、青、東方紅鰭、秀美花、羅非魚、矛尾魚、非洲爪蟾、雞、大鼠、小鼠、人的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列上下游各 50 kb區(qū)域的同源基因組序列以及注解文件，并將所得到的序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖 2所示，載體插入位置為黑色箭頭所指。在100 kb的基因組范圍內(nèi)有 7個(gè)基因，分別為arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。在rps26基因的下游有2個(gè)CNS，其中CNS1較CNS2相似序列的保守度 (Identity)更高，相似序列的寬度 (Width) 更廣，并且這兩個(gè)元件在真骨魚類 (青、東方紅鰭、秀美花和羅非魚) 中高度保守，但是在兩棲類 (非洲爪蟾)、鳥類 (雞) 和哺乳類 (小鼠、大鼠和人)中均不保守。結(jié)果提示這兩個(gè)CNS可能為潛在的增強(qiáng)子。

圖2　插入位點(diǎn)側(cè)翼區(qū)比較基因組學(xué)分析Fig. 2　Comparative genomic analysis of the flank sequences of the insertion site. Dr: Danio rerio; Tr: Takifugu rubripes; Ol: Oryzias latipes; Pf: Poecilia formosa; On: Oreochromis niloticus; Lc: Latimeria chalumnae; Xt: Xenopus tropicalis; Gg: Gallus gallus; Rn: Rattus norvegicus; Mm: Mus musculus; Hs: Homo sapiens; UTR: untranslated region;CNS: conserved non-coding sequence.

2.3　原位雜交

由于載體的插入位點(diǎn)是在rps26基因的1號(hào)內(nèi)含子中，為了驗(yàn)證TK4的GFP表達(dá)模式是否與rps26基因表達(dá)模式一致，進(jìn)行了受精至3 dpf斑馬魚早期胚胎原位雜交實(shí)驗(yàn)。斑馬魚rps26基因存在兩個(gè)可變剪切轉(zhuǎn)錄本，分別為rps26-001和rps26-201，根據(jù)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別設(shè)計(jì)原位雜交探針，檢測(cè)rps26基因在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本在單細(xì)胞受精卵中 (0.2 hpf) 已經(jīng)啟動(dòng)表達(dá)，提示存在母源性表達(dá)；而rps26-001在0.75 hpf時(shí)表達(dá)有所減弱，至4 hpf時(shí)表達(dá)又開始增強(qiáng)，rps26-201在 0.75 hpf表達(dá)明顯高于rps26-001，表明rps26-201的表達(dá)啟動(dòng)要早于rps26-001；在4 hpf至48 hpf的發(fā)育過程中兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均有表達(dá)；在發(fā)育至24 hpf時(shí)，表達(dá)呈現(xiàn)全身性的特點(diǎn)，無(wú)明顯組織和細(xì)胞特異性，而發(fā)育至48 hpf時(shí)，表達(dá)部位主要集中于頭部及中腦，呈現(xiàn)明顯的組織特異性；發(fā)育至3 dpf時(shí)，組織特異性表達(dá)更加明顯，主要集中于中腦-后腦連接處、眼眶以及原腎管等部位表達(dá)，各階段rps26-201的表達(dá)信號(hào)要高于rps26-001。rps26-001和rps26-201的表達(dá)在早期胚胎 (受精至24 hpf)中呈現(xiàn)無(wú)明顯組織和細(xì)胞特異性，且啟動(dòng)較早，而GFP在6 hpf時(shí)尚無(wú)表達(dá)信號(hào)，至24 hpf則呈現(xiàn)一定的組織特異性，兩者并不一致，但后期rps26-001和rps26-201的表達(dá)與GFP表達(dá)模式部分相似，包括主要集中在腦部，特別是中腦信號(hào)比較強(qiáng)。

圖3　rps26-001和rps26-201轉(zhuǎn)錄本在不同發(fā)育階段斑馬魚胚胎中原位雜交Fig. 3　In situ hybridization for rps26-001和rps26-201 transcripts at different stages of zebrafish embryos.

3　討論

轉(zhuǎn)座子是在基因組內(nèi)可自主移動(dòng)的一段DNA序列，最早是由 McClintock在研究玉米籽粒顏色遺傳時(shí)發(fā)現(xiàn)的[15]。而Tol2轉(zhuǎn)座子則是由Koga等在研究白化青魚時(shí)發(fā)現(xiàn)[16]，屬于 hAT轉(zhuǎn)座子超家族。目前，Tol2轉(zhuǎn)座子因其可攜帶較長(zhǎng)的插入片段等優(yōu)勢(shì)，已廣泛應(yīng)用于斑馬魚、爪蟾、雞和小鼠等模式脊椎動(dòng)物的研究中[12,17–19]。最近研究表明，Tol2轉(zhuǎn)座子已成功應(yīng)用于斑馬魚的功能基因[20]和增強(qiáng)子捕獲[21-23]的研究中。傳統(tǒng)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)需要耗費(fèi)大量的人力物力，為了分離到單性狀的個(gè)體，需要制備大規(guī)模的G3代突變?nèi)后w，除此之外，傳統(tǒng)方法很難分離得到增強(qiáng)子。目前在斑馬魚上進(jìn)行增強(qiáng)子捕獲研究最有效的方法是利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)，這一技術(shù)為研究相關(guān)基因的調(diào)控模式提供了很好的工具。近年來(lái)，利用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)獲得插入突變體庫(kù)進(jìn)而對(duì)相關(guān)器官功能、疾病等的研究已取得較大進(jìn)展。Parinov等[12]利用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)斑馬魚增強(qiáng)子捕獲技術(shù)，建立突變品系，研究斑馬魚發(fā)育的相關(guān)功能基因。Xue等[24]通過Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的大規(guī)模增強(qiáng)子誘捕篩選到 26個(gè)血管特異表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP) 報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因斑馬魚系，其中有一些品系在胚胎的某些特異血管結(jié)構(gòu)中表達(dá)綠色熒光蛋白。最終獲得EGFP報(bào)告基因受hhex或ets1a基因增強(qiáng)子控制的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，而hhex和ets1a基因?qū)ρ芘c血細(xì)胞前體的發(fā)育具有重要作用，因此，該品系為深入研究這兩個(gè)基因在血管與血液發(fā)育中的作用機(jī)制提供了新的機(jī)遇。Huang等[25]利用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)構(gòu)建得到了心肌特異性表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，且在心房和房室管中觀察到了特異性表達(dá)的GFP。

本課題組采用Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲技術(shù)獲得了大量斑馬魚插入突變體，通過報(bào)告基因GFP可確定捕獲的增強(qiáng)子和內(nèi)源基因時(shí)空表達(dá)特性，大大提高了篩選效率。我們已通過表型篩選建立了若干個(gè)突變品系，本研究所用的TK4系斑馬魚表型為頭部和軀干具有較為明顯的GFP表達(dá)，通過 sp-PCR的方法成功地克隆到了Tol2轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的側(cè)翼基因組序列，揭示了TK4系的插入位點(diǎn)是rps26基因的1號(hào)內(nèi)含子，并且報(bào)告基因的插入方向與基因相反。同時(shí)結(jié)合比較基因組學(xué)手段，通過跟其他物種進(jìn)行同源比對(duì)，發(fā)現(xiàn)在rps26基因下游有2個(gè)潛在的增強(qiáng)子信號(hào)(CNS1和CNS2)，其中CNS1較為明顯，在魚類中保守性較強(qiáng)。在 CNS1的上下游有很多基因，包括arf3a、wnt10b、wnt1、rps26、IKZF4、dnajc22和lmbr1l。已有研究表明，Wnt1在小鼠的中腦和前后腦的形成中起重要作用，在斑馬魚中需要wnt1和wnt10b來(lái)維持中腦和后腦連接處的Pax2.1和Fgf8的閾值水平[26]。rps26基因編碼的核糖體蛋白就是核糖體小亞基40S的組成部分，該蛋白屬于rps26e核糖體蛋白家族[27]。IKZF4也稱轉(zhuǎn)錄因子Eos，是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子ikaros家族中的一員。作為負(fù)性調(diào)節(jié)因子可以參與許多基因的表達(dá)調(diào)控[28]。有研究表明，Eos位于細(xì)胞核中，在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中扮演重要角色[29]。Eos對(duì)淋巴系細(xì)胞發(fā)育和形成過程也有重要作用[30]。dnajc22作為果蠅wurst基因的同源物，目前研究較少，而果蠅wurst基因編碼一種 J結(jié)構(gòu)域跨膜蛋白，該蛋白是果蠅氣管尺寸和氣道清除的必要調(diào)節(jié)因子[31]。對(duì)于基因arf3a和lmbr1l的功能及其表達(dá)特性，目前尚未見報(bào)道。目前關(guān)于這些基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理也尚未見報(bào)道。而該品系的建立及注釋對(duì)于進(jìn)一步研究這些基因的功能特點(diǎn)及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制提供了很好的模式動(dòng)物。Gharbi等[32]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過原位雜交驗(yàn)證了捕獲的內(nèi)源性基因kctd15a與轉(zhuǎn)基因斑馬魚熒光蛋白表達(dá)模式基本一致，而且在后期的發(fā)育過程中也有著相似的時(shí)空表達(dá)特征。在 Liu等[4]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過對(duì)EGFP和捕獲的內(nèi)源性基因設(shè)計(jì)反義 RNA探針來(lái)檢測(cè)內(nèi)源性基因的表達(dá)模式比較，發(fā)現(xiàn)EGFP的表達(dá)模式與所捕獲到的內(nèi)源性基因基本一致。在劉帥軍等[33]所捕獲的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系中，通過原位雜交驗(yàn)證了捕獲的內(nèi)源性基因denraa與轉(zhuǎn)基因斑馬魚GFP表達(dá)模式基本一致。而本研究中通過比較TK4的GFP表達(dá)模式與rps26基因原位雜交結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩者表達(dá)模式存在相似之處，但也并不完全一致，提示兩者可能既接受共同的增強(qiáng)子調(diào)控，但也存在不同增強(qiáng)子調(diào)控，所獲得的 2個(gè)潛在的增強(qiáng)子 (CNS1和 CNS2) 可能對(duì)附近的基因 (包括rps26) 發(fā)揮差異的時(shí)空表達(dá)調(diào)控作用，但需進(jìn)一步深入研究驗(yàn)證。

4　結(jié)論

本研究首次獲得了rps26基因的2個(gè)潛在增強(qiáng)子調(diào)控元件，揭示了rps26基因表達(dá)特性及其與潛在增強(qiáng)子調(diào)控的可能聯(lián)系。研究結(jié)果為深入理解和研究rps26基因調(diào)控機(jī)制提供重要參考；同時(shí)本研究所嘗試的增強(qiáng)子研究綜合技術(shù)手段(包括轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的增強(qiáng)子捕獲、sp-PCR、比較基因組學(xué)和原位雜交等) 也為后基因組學(xué)時(shí)代解析基因表達(dá)調(diào)控提供方法參考。

[1]Banerji J,Rusconi S,Schaffner W. Expression of a β-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences. Cell,1981,27(2): 299–308.

[2]Spilianakis CG,Lalioti MD,Town T,et al.Interchromosomal associations between alternatively expressed loci. Nature,2005,435(7042): 637–645.

[3]Lomvardas S,Barnea G,Pisapia DJ,et al.Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice. Cell,2006,126(2): 403–413.

[4]Liu CY,Song GL,Mao L,et al. Generation of an enhancer-trapping vector for insertional mutagenesis in zebrafish. PLoS ONE,2015,10(10): e0139612.

[5]Casadaban MJ,Cohen SN. Lactose genes fused to exogenous promoters in one step using a Mu-lac bacteriophage:in vivoprobe for transcriptional control sequences. Proc Natl Acad Sci USA,1979,76(9):4530–4533.

[6]Bellen HJ,O’Kane CJ,Wilson C,et al. P-elementmediated enhancer detection: a versatile method to study development inDrosophila. Genes Dev,1989,3(9):1288–1300.

[7]Grabher C,Henrich T,Sasado T,et al. Transposonmediated enhancer trapping in medaka. Gene,2003,322: 57–66.

[8]Balciunas D,Davidson AE,Sivasubbu S,et al. Enhancer trapping in zebra fi sh using the Sleeping Beauty transposon. BMC Genomics,2004,5(1): 62.

[9]Bellen HJ. Ten years of enhancer detection: lessons from the fly. Plant Cell,1999,11(12): 2271–2281.

[10]Distel M,Wullimann MF,K?ster RW. Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(32):13365–13370.

[11]Asakawa K,Kawakami K. TheTol2-mediated Gal4-UAS method for gene and enhancer trapping in zebrafish. Methods,2009,49(3): 275–281.

[12]Parinov S,Kondrichin I,Korzh V,et al.Tol2transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genesin vivo. Dev Dyn,2004,231(2): 449–459.

[13]Potter CJ,Luo LQ. Splinkerette PCR for mapping transposable elements inDrosophila. PLoS ONE,2010,5(4): e10168.

[14]Thisse C,Thisse B. High-resolutionin situhybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nat Protoc,2008,3(1): 59–69.

[15]McClintock B. Chromosome organization and genic expression. Cold Spring Harb Symp Quant Biol,1951,16: 13–17.

[16]Koga A,Suzuki M,Inagaki H,et al. Transposable element in fish. Nature,1996,383(6595): 30.

[17]Hamlet MRJ,Yergeau DA,Kuliyev E,et al.Tol2transposon-mediated transgenesis inXenopustropicalis.Genesis,2006,44(9): 438–445.

[18]Sato Y,Kasai T,Nakagawa S,et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Dev Biol,2007,305(2): 616–624.

[19]Keng VW,Ryan BJ,Wangensteen KJ,et al. Efficient transposition ofTol2in the mouse germline. Genetics,2009,183(4): 1565–1573.

[20]Clark KJ,Urban MD,Skuster KJ,et al. Transgenic zebrafish using transposable elements. Methods Cell Biol,2011,104: 137–149.

[21]Asakawa K,Suster ML,Mizusawa K,et al. Genetic dissection of neural circuits byTol2transposonmediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish.Proc Natl Acad Sci USA,2008,105(4): 1255–1260.

[22]Fisher S,Grice EA,Vinton RM,et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers usingTol2transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat Protoc,2006,1(3): 1297–1305.

[23]Kondrychyn I,Teh C,Garcia-Lecea M,et al. Zebrafish Enhancer TRAP transgenic line database ZETRAP 2.0.Zebrafish,2011,8(4): 181–182.

[24]Xue YL,Xiao A,Wen L,et al. Generation and characterization of blood vessel specific EGFP transgenic zebrafishvia Tol2Transposon mediated enhancer trap screen. Prog Biochem Biophys,2010,37(7): 720–727.

[25]Huang W,Deng Y,Dong W,et al. The effect of excess expression of GFP in a novel heart-specific green fluorescence zebrafish regulated bynppaenhancer at early embryonic development. Mol Biol Rep,2011,38(2): 793–799.

[26]Lekven AC,Buckles GR,Kostakis N,et al.Wnt1andwnt10bfunction redundantly at the zebrafish midbrain-hindbrain boundary. Dev Biol,2003,254(2):172–187.

[27]Hou YL,Sun B,Hou WR. cDNA cloning and sequence analysis of ribosomal protein S26 gene (rps26) from the giant panda. J Beijing Norm Univ: Nat Sci,2010,46(2):177–181 (in Chinese).侯怡鈴,孫冰,侯萬(wàn)儒. 大熊貓核糖體蛋白 S26亞基基因 (rps26) 的cDNA克隆及序列分析. 北京師范大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版,2010,46(2): 177–181.

[28]Caballero R,Setien F,Lopez-Serra L,et al.Combinatorial effects of splice variants modulate function of Aiolos. J Cell Sci,2007,120(Pt 15):2619–2630.

[29]Bao JX,Lin HN,Ouyang YN,et al. Activity-dependent transcription regulation of PSD-95 by neuregulin-1 and Eos. Nat Neurosci,2004,7(11): 1250–1258.

[30]Pan F,Yu H,Dang EV,et al. Eos mediates Foxp3-dependent gene silencing in CD4+regulatory T cells. Science,2009,325(5944): 1142–1146.

[31]Behr M,Wingen C,Wolf C,et al. Wurst is essential for airway clearance and respiratory-tube size control. Nat Cell Biol,2007,9(7): 847–853.

[32]Gharbi N,Zhao XF,Ellingsen S,et al. Zebrafish enhancer trap line showing maternal and neural expression ofkctd15a. Dev Growth Differ,2012,54(2):241–252.

[33]Liu SJ,Shen D,Zhong JH,et al. The annotation of enhancer-trapping mediated by the SB transposon in zebrafish. Biotechnol Bull,2017,33(5): 153–158 (in Chinese).劉帥軍,沈丹,鐘繼漢,等. SB轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的斑馬魚增強(qiáng)子捕獲注解分析. 生物技術(shù)通報(bào),2017,33(5):153–158.