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      亞麻籽環(huán)肽混合物抑制霉菌生長繁殖活性

      2018-04-12 09:51:58劉尊汪勇MARTINREANEYFIORENTYOCTAVIASUGIWANNANDAAYUYULISTYANITA張寧
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2018年3期
      關(guān)鍵詞:環(huán)肽亞麻黃曲霉

      劉尊, 汪勇, MARTIN J T REANEY, FIORENTY OCTAVIA SUGIWAN,NANDA AYU YULISTYANITA,張寧*

      1(廣東高校油脂生物煉制工程技術(shù)研究中心,暨南大學 食品科學與工程系,廣東 廣州,510632)2(暨南大學 薩斯喀切溫大學 “油料生物煉制與營養(yǎng)”聯(lián)合實驗室,廣東 廣州,510632)3(加拿大薩斯喀切溫大學 農(nóng)業(yè)與生物資源學院,加拿大 薩斯卡,S7N5A8)

      亞麻又稱胡麻,屬一年生或多年生草本植物,為我國重要油料經(jīng)濟作物。亞麻籽中含有多種生理活性物質(zhì),除了亞麻籽膠和木酚素外,還有一類疏水性環(huán)形多肽[1-4]。亞麻籽環(huán)肽(flaxseed cyclolinopeptide, FCLPs)主要由異亮氨基酸、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸組成[5]。已從植物、真菌、細菌以及海洋生物中分離得到具有生物活性的環(huán)肽[6-8]。相比普通直鏈小分子肽,環(huán)肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)更具穩(wěn)定性,高效的抗菌活性以及抗腫瘤、消炎等生理活性[9-12]。亞麻籽環(huán)肽A展現(xiàn)了一定的免疫抑制活性[13],亞麻籽環(huán)肽B和環(huán)肽E也被報道對細胞分裂素具有抑制作用[14-15]。但亞麻籽環(huán)肽對霉菌的抑制作用及機理尚未有報道。

      據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(Food and Agriculture Organization, FAO)統(tǒng)計,全球約有25%的糧作物受真菌毒素的污染[16-17]。岳淑麗等[18]研究了桉葉精油對酵母菌、細菌和霉菌的抑菌性能,桉葉精油具有良好的抑菌效果,且抑菌性與傘花烯、檸檬烯和桉葉素等抑菌成分有關(guān)。HOU等[19]研究了甘氨酸基本多肽在新鮮濕面的應用和抗真菌特性,結(jié)果表明隨著甘氨酸基本多肽濃度的提高,對黑曲霉和青霉菌的菌絲生長和孢子萌芽的抑制效果越好。

      本文主要通過對宛氏擬青霉和黃曲霉的菌落生長、孢子形成和孢子萌發(fā)的抑制作用來評價FCLPs的抗霉菌活性;FCLPs進行經(jīng)高溫滅菌和未加熱滅菌不同處理,探究環(huán)肽的熱穩(wěn)定性;并初步分析了霉菌培養(yǎng)后,培養(yǎng)基中FCLPs的變化。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      1.1.1試驗材料

      亞麻籽環(huán)肽標準品(環(huán)肽A、環(huán)肽C、環(huán)肽E、環(huán)肽D)、亞麻籽環(huán)肽混合物(純度>60%,其余成分主要為脂肪酸),Prairie Tide Chemical Inc.;無水乙醇(分析純),天津市富宇精細化工有限公司;甲醇(色譜純),MREDA TECHNOLOGY INC.。

      1.1.2培養(yǎng)基及試驗菌株

      培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA), 廣州環(huán)凱微生物科技有限公司。

      試驗菌株:宛氏擬青霉(AS 3.776),廣東省微生物菌種保藏中心;黃曲霉(CICC 2476),中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

      1.2 儀器與設(shè)備

      THZ-98A 型恒溫振蕩箱,上海一恒科技有限公司;HPS-280型生化培養(yǎng)箱,廣州萬寶特種制冷設(shè)備有限公司;高溫滅菌鍋,廣州合眾生物科技有限公司;超凈臺,蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;HC-2518高速離心機,科大創(chuàng)新股份有限公司;DZF-6020真空干燥機,上海博迅實業(yè)有限公司;LC-20AD 高效液相色譜儀,日本島津公司; Diamonsil C18分析柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),迪馬公司。

      1.3 方法

      1.3.1亞麻籽環(huán)肽混合物溶液制備

      稱取亞麻籽環(huán)肽混合物粉末溶解于95%的乙醇中,制備得到質(zhì)量濃度為100 mg/mL的溶液。

      1.3.2霉菌孢子懸浮液的配制

      將試驗菌株接種于PDA斜面培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d。量取10 mL無菌水于試管中,然后用無菌接種環(huán)輕輕刮下表面孢子,用無菌水稀釋,充分振蕩搖勻,顯微鏡計數(shù),使菌懸浮液濃度達106CFU/mL。

      1.3.3亞麻籽環(huán)肽混合物抑制菌落生長活性測定

      分別于121 ℃高溫15 min滅菌前、后向PDA平板中添加亞麻籽環(huán)肽混合物溶液,使質(zhì)量濃度梯度為2.4、1.2、0.6、0.3、0.15、0.075 mg/mL。對照組則添加等量等濃度乙醇溶液。用移液槍精確吸取5 μL試驗菌種孢子懸浮液在培養(yǎng)基平板上每120°點種,每組重復3次。待菌液風干后,于25 ℃的恒溫倒置培養(yǎng), 48 h或72 h十字交叉法測量菌落直徑,取平均值,計算抑制菌落生長活性:

      (1)

      式中:I為抑制菌落生長活性;d1為對照組菌落直徑;d2為亞麻籽環(huán)肽組菌落直徑。

      1.3.4亞麻籽環(huán)肽混合物抑制霉菌孢子形成測定

      取1.3.3 培養(yǎng)了72 h后的菌落平板,加入10 mL無菌水,用涂布棒將平板上孢子輕刮下來制成孢子懸浮液,孢子懸浮液經(jīng)過梯度稀釋,采用傾注法平板計數(shù),按公式(2)計算孢子形成抑制率,用EXCEL統(tǒng)計軟件求出亞麻籽環(huán)肽混合物對孢子形成的IC50值。

      (2)

      式中:I′為孢子形成抑制率;C1為對照組孢子數(shù);C2為亞麻籽環(huán)肽組孢子數(shù)。

      1.3.5亞麻籽環(huán)肽混合物抑制霉菌孢子萌芽率

      取50 mL的三角瓶加入20 mL的察氏液體培養(yǎng)基,加入適量的亞麻籽環(huán)肽混合物溶液配制最終質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL。隨后移取適量孢子懸浮液至察氏液體培養(yǎng)基中,置于30 ℃下振蕩恒溫培養(yǎng)48 h。取1滴培養(yǎng)液于載玻片上后在高倍鏡下觀察孢子發(fā)芽情況,取平均值。乙醇作為對照。按公式(3)計算亞麻籽環(huán)肽混合物對孢子萌發(fā)的抑制率。

      (3)

      1.3.6霉菌PDA中環(huán)肽的提取

      從抑菌試驗PDA平板培養(yǎng)物中提取亞麻籽環(huán)肽,對比亞麻籽環(huán)肽在培養(yǎng)霉菌前后的變化。培養(yǎng)霉菌的PDA平板取0.3 g培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)移至2 mL離心管,加入1.4 mL 100%無水乙醇溶液振蕩破碎獲均勻懸浮液。懸浮液以4 000 r/min,離心10 min,取上清液在真空干燥箱中放置6 h除去乙醇。干燥后樣品溶于1 mL色譜純甲醇,0.45 μL過濾膜過濾后作為高效液相色譜分析樣品待用。

      1.3.7高效液相色譜分析亞麻籽環(huán)肽組分

      使用 Diamonsil C18色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm); 流動相A為乙腈,流動相B為蒸餾水,柱溫為35 ℃,紫外檢測波長為214 nm,進樣體積為10 μL,采用梯度洗脫,外標法定量。HPLC梯度洗脫程序如下[20]: 0 min,50%A-50%B;0~6 min,50%A-50%B;6~7 min,65%A+35%B;7~19 min,65%A+35%B;19~22 min,66%A+34%B;22~23 min,70%A+30%B;23~24 min,100%A; 24~31 min,50%A-50%B;31~41 min,50%A+50%B。0~23min內(nèi),流速均為0.5 mL/min,24~41 min內(nèi)的流速均為1 mL/min。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉的抑制作用

      表1和表2分別為不同質(zhì)量濃度的FCLPs對宛氏擬青霉的菌落生長和孢子形成的抑制結(jié)果。

      由表1可知,隨著FCLPs的增加,宛氏擬青霉菌落生長和孢子的抑制效果增強,未高溫滅菌的FCLPs在質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時,對菌落生長抑制率I(48.5%)和孢子形成抑制率I′(77.3%)均達最大抑制活性。72 h的抑制率I( 36.0%)相比48 h (48.5%)略有下降,表明培養(yǎng)時間的延長會減弱抑菌效果。FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的抑制率高于對菌落生長的抑制率,推測FCLPs可能抑制了菌絲的分化。經(jīng)高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對宛氏擬青霉孢子形成的半數(shù)抑制濃度IC50值分別為0.53 mg/mL和0.34 mg/mL。相同質(zhì)量濃度下,高溫滅菌后FCLPs對宛氏擬青霉的抑制率I和I′的抑制活性最多分別降低23.2%(0.15 mg/mL)和23.3%(0.6 mg/mL),說明高溫處理(121 ℃, 15 min)后的FCLPs仍可保持76.5%左右的抑菌活性。

      表1 不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉菌落生長的抑制效果Table 1 Inhibition of FCLPs on the radial growth ofPaecilomyces varioti Bainier

      表2 不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對宛氏擬青霉孢子形成的抑制效果Table 2 Inhibition of FCLPs on spores formation ofPaecilomyces varioti Bainier

      2.2 亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉的抑制作用

      亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉菌落生長和孢子形成的抑制作用見表3和4。未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉的抑制率I和I′都在2.4 mg/mL時最高,分別為32.9%和86.8%。48 h時抑制活性I(32.9%)高于72h (26.9%),同宛氏擬青霉實驗結(jié)果一致。經(jīng)高溫滅菌和未高溫滅菌的FCLPs對黃曲霉孢子形成的IC50值分別為0.31和0.24 mg/mL。與宛氏擬青霉的抑菌效果相比,F(xiàn)CLPs對黃曲霉的抑制率I遠低于宛氏擬青霉,但是抑制率I′略高于宛氏擬青霉??梢酝茰y,F(xiàn)CLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉的抑制機理,可能不是抑制營養(yǎng)菌絲體的生長,而是通過抑制氣生菌絲體的孢子分化,從而可以解釋FCLPs對2株霉菌的孢子生長抑制率要高于對菌落生長的抑制率。高溫滅菌處理使FCLPs的抑制活性部分喪失,最低可保持 41.7%(抑制孢子形成)的活性。

      表3 不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉菌落生長的抑制效果Table 3 Inhibition of FCLPs on the radial growth ofAspergillus flavus

      表4 不同質(zhì)量濃度的亞麻籽環(huán)肽混合物對黃曲霉孢子形成的抑制效果Table 4 Inhibition of FCLPs mixtures on spores formationof Aspergillus flavus

      2.3 亞麻籽環(huán)肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用

      未高溫滅菌的FCLPs(0.6 mg/mL),對宛氏擬青霉和黃曲霉的孢子萌芽的抑制作用結(jié)果見表5。相比對照組,F(xiàn)CLPs對宛氏擬青霉和黃曲霉都表現(xiàn)了對霉菌孢子萌芽的抑制效果,平均抑制率分別為8.22%和18.5%,黃曲霉組的孢子萌芽率要明顯高于宛氏擬青霉,說明FCLPs對宛氏擬青霉孢子發(fā)芽的抑制作用要強于對黃曲霉孢子。

      2.4 霉菌培養(yǎng)基中殘留環(huán)肽的分析

      圖1為從培養(yǎng)宛氏擬青霉的PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs,圖2是從黃曲霉的PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs。參照左洋等[21-22]所做的標準品的HPLC結(jié)果,環(huán)肽C信號峰的保留時間為15 min左右,隨后出峰的是環(huán)肽E(19 min左右)、環(huán)肽D(20 min左右)、環(huán)肽A(27 min左右),其保留時間及出峰順序與標準樣品是基本一致的,結(jié)果表明經(jīng)過霉菌培養(yǎng)后,F(xiàn)CLPs的已知的4種環(huán)肽的比例沒有發(fā)現(xiàn)明顯的變化,也沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中環(huán)肽霉菌代謝物的產(chǎn)生。但是對比高溫滅菌和未經(jīng)高溫滅菌的FCLPs,可以看到熱處理過后的FCLPs中的4種環(huán)肽的峰面積較未經(jīng)熱處理的有所降低,這表明高溫熱處理降低了環(huán)肽C、E、D和A的含量,這可能影響了FCLPs的抑菌活性,這與前面發(fā)現(xiàn)的高溫處理導致FCLPs的抑菌活性下降的結(jié)果是一致。

      表5 亞麻籽環(huán)肽混合物對霉菌孢子萌芽的抑制作用Table 5 Inhibition of FCLPs against fungal spore germination

      圖1 1.2 mg/mL宛氏擬青霉PDA提取亞麻籽環(huán)肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)的HPLC譜圖Fig.1 HPLC of 1.2 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Paecilomyces variotibainier PDA

      圖2 2.4 mg/mL黃曲霉PDA提取亞麻籽環(huán)肽(未高溫滅菌和高溫滅菌)HPLC譜圖Fig.2 HPLC of 2.4 mg/mL FCLPs (not autoclaved andautoclaved) extracted from Aspergillus flavus PDA

      3 結(jié)論

      本文選取宛氏擬青霉和黃曲霉2株霉菌作為試驗菌株,通過菌落生長直徑、孢子計數(shù)和孢子萌芽率評價121 ℃高溫滅菌前后不同濃度的FCLPs對霉菌的抑制活性。結(jié)果表明,F(xiàn)CLPs的抑菌活性隨濃度升高而增強,對宛氏擬青霉的抑制活性最高達48.5% (菌落生長)和77.3% (孢子形成);對于黃曲霉,抑制活性最高分別為32.9% (菌落生長)和86.8% (孢子形成)。FCLPs對宛氏擬青霉孢子的IC50值分別為0.53 mg/mL(經(jīng)高溫滅菌)和0.34 mg/mL(未高溫滅菌);對黃曲霉孢子的IC50值則分別為0.31 mg/mL(經(jīng)高溫滅菌)和0.24 mg/mL(未高溫滅菌)。高溫滅菌后FCLPs保持了部分抑菌活性。通過孢子萌芽試驗發(fā)現(xiàn),F(xiàn)CLPs對2株霉菌的孢子萌芽都有明顯的抑制效果,且對宛氏擬青霉孢子萌芽的抑制率高于對黃曲霉孢子的抑制率。通過高效液相色譜對霉菌PDA培養(yǎng)基中提取的FCLPs的分析,發(fā)現(xiàn)對比已知的亞麻籽環(huán)肽標準樣品圖譜,環(huán)肽A、C、D和E在霉菌培養(yǎng)前后沒有產(chǎn)生新的環(huán)肽代謝物,但是高溫熱處理會降低環(huán)肽的含量,從而導致抑菌活性有所減弱。綜上所述,F(xiàn)CLPs具有抑制宛氏擬青霉和黃曲霉孢子形成、萌發(fā)和菌絲生長活性,高溫滅菌后還能保持部分活性,表明其具有良好的熱加工適應性,有潛力成為新型天然防腐劑。

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