楊正久， 代建忠， 梁大敏， 毛朝坤， 董紅梅， 馬增鳳

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校醫(yī)學技術系，貴州遵義 563006； 2.廣西大學生命科學與技術學院，廣西南寧 530005)

黨參為桔?？泣h參屬植物，川黨參產于四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省，歷史悠久，品種較多，已大量人工栽種，不同品種間的性狀與藥用成分含量存在差異。洛龍黨參又名洛黨，產于貴州省道真仡佬族苗族自治縣東北部的洛龍山區(qū)而得名，是川黨參的生態(tài)變種[1]，以其肉質鮮嫩、藥用價值高而深受外界青睞。黨參主要成分有多糖、黨參苷、甾醇類、生物堿、內酯類、豆素類等，具有益氣生津、補脾養(yǎng)胃的功效，用于脾肺虛弱、氣短心悸、虛喘咳嗽、內熱消渴等病癥[2]。余蘭等研究表明，洛龍黨參的多糖含量達25.6%～27.75%，比其他川黨參高10.97%[3]。

目前分子標記用于黨參種質遺傳多樣性的研究較少，利用簡單重復序列區(qū)間(ISSR)分子標記技術對道真洛龍黨參種質資源遺傳多樣性方面的研究還尚未見報道。本研究利用ISSR技術對道真陽溪和壩羊的洛龍黨參與四川、重慶等地其他川黨參的種質遺傳多樣性進行研究，為貴州省遵義市種植黨參品種的鑒定、篩選利用及遺傳改良提供方法和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　試驗材料及來源

本研究共采用12個黨參品種(表1)，分別來自貴州省遵義道真縣、重慶、湖北及四川種植黨參種子萌發(fā)的嫩葉。選取成熟種子，脫粒去雜，催芽后，置于放有濾紙的培養(yǎng)皿上于 25 ℃ 萌發(fā)，發(fā)芽3～5 cm高時取幼苗嫩葉，置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2　儀器與試劑

主要儀器：GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD)，Eppendorf Mastercycler?普通PCR儀，Smart SpecTM3000型分光光度計(BIO-RAD)，VE-180型電泳槽(上海天能科技有限公司)，EPS-300型電泳儀(上海天能科技有限公司)，TGL-16G 臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)。主要試劑：丙烯酰胺、雙丙烯酰胺、硝酸銀、37%甲醛、四乙基乙二胺(TEMED)、ISSR引物(北京賽百盛基因技術有限公司)。

表1　試驗材料及來源

1.3　黨參基因組DNA的提取

取黨參試驗材料，采用經改進的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取DNA[4-5]，用瓊脂糖凝膠電泳測定其純度，用分光光度計測定其濃度，將提取的DNA稀釋到終濃度 40 ng/μL，用作PCR擴增的模板。

1.4　ISSR引物的篩選和PCR擴增

選用提取的黨參基因組DNA為模板，進行ISSR引物篩選和PCR反應擴增。PCR反應體系為20 μL：模板DNA 1 μL(約30～53 ng)，ISSR引物1 μL(約5 pmol)，PCR mix 18 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ min，56 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取擴增產物5 μL 在6%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，以0.5×TBE為緩沖液，穩(wěn)壓150 V，電泳至溴酚藍距凝膠邊緣2～3 cm處結束。采用銀染法進行染色。

1.5　數(shù)據(jù)處理與分析

ISSR-PCR擴增產物經電泳檢測后，得到電泳圖譜，用Quantity One 6. 0分析軟件結合人工讀帶，按條帶的有無(有記為1，沒有則記為0)記錄電泳條帶，同時將出現(xiàn)頻率超過99%的條帶視為共有帶，出現(xiàn)頻率低于1%的條帶，即被視為沒有條帶而不計入內。將讀出的數(shù)據(jù)錄入Excel，建立數(shù)據(jù)庫矩陣。

應用NTsys 2.10e軟件，利用ISSR分子標記數(shù)據(jù)計算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)，采用非加權組平均法(UPGMA)構建黨參品種間的遺傳關系聚類圖；將SM遺傳相似性矩陣進行Dcenter數(shù)據(jù)轉化，求其特征量和特征向量，生成主坐標二維、三維散點圖。

2　結果與分析

2.1　ISSR引物的篩選及擴增結果

以來自道真陽溪1號和2號黨參基因組DNA作為模板，從100條引物中篩選出10條引物。利用這10條引物能在12個黨參試驗材料中擴增出清晰的條帶，且多態(tài)性、穩(wěn)定性和重復性較好(表2)。

表2　引物篩選及擴增結果

2.2　ISSR-PCR圖譜及多態(tài)性分析

本研究從100條引物中篩選出擴增條帶清晰、重復性好、多態(tài)性豐富的10條引物，對12份供試黨參樣品進行ISSR-PCR擴增，共擴增出136個可區(qū)分的DNA條帶，平均每條引物擴增出13.6條條帶(表2)。在擴增出的136條DNA條帶中，多態(tài)性條帶有114條，多態(tài)性條帶占比為83.82%，平均每條引物擴增11.4條多態(tài)性條帶。其中引物UBC807和UBC811擴增的條帶數(shù)及多態(tài)性條帶數(shù)較為豐富(圖1)，DNA總條帶數(shù)分別為16條和19條，多態(tài)性條帶數(shù)分別為14條和16條。這表明川黨參種質具有較為豐富的遺傳多樣性。

2.3　遺傳相似性分析

利用ISSR分子標記數(shù)據(jù)計算黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)(表3)。ISSR-PCR擴增結果表明，12個黨參品種之間的遺傳相似性系數(shù)均在0.5以上，平均為0.683 6，處于 0.518～0.908之間。其中道真陽溪洛龍黨參品種(1)和四川樂山黨參品種(12)之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.518，二者之間親緣關系最遠；四川樂山(12)和四川雅安(10)之間的遺傳相似性系數(shù)最大，表明二者之間的親緣關系最近。道真縣的3個洛龍黨參品種(1、2、3)之間的遺傳相似性系數(shù)均較大，在0.775以上，但道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)的6個品種(7～12)之間的遺傳相似性系數(shù)較小，在0.50～0.65之間，表明遵義道真洛龍黨參品種與四川地區(qū)黨參品種的親緣關系較遠。

表3　遺傳相似性分析結果

2.4　聚類分析

基于遺傳圖距，應用NTsys 2.10e軟件，對來自道真洛龍、四川、重慶及湖北的12個黨參品種進行UPGMA聚類分析。如圖2所示，12個黨參品種在0.591處分為A、B 2支，來自遵義道真、重慶及湖北的6個黨參品種(1～6)聚為A支，來自四川省的6個黨參品種(7～12)聚為B支，而A支中來自道真洛龍和重慶奉節(jié)與巫山的黨參品種又聚為A1支，A1支又分為A11(道真3個品種)和A12(重慶2個品種)2支，來自湖北的黨參品種(6)單獨成1支(A2支)，來自四川的6個黨參品種分為B1和B22支，但遺傳差距很小。結果表明，本研究中的12個黨參種植品種與地理分布有著明顯的相關性，來自同一地區(qū)的品種間遺傳差異較小，而不同地區(qū)的品種之間的遺傳差異最大。

2.5　主坐標分析

主坐標分析以黨參品種間的遺傳相似性系數(shù)矩陣為基礎，不同品種在主坐標圖中的位置能反映它們之間的親緣關系。品種間位置越接近，表明它們的遺傳相似性越大，親緣關系越近，反之，則表明遺傳差異越大，親緣關系越遠[6]。產生的主坐標二維、三維散點圖分別見圖3、圖4。不難看出，主坐標分析結果與聚類分析結果一致。來自道真洛龍的3個黨參品種(1～3)遺傳相似性較高，聚集在二維圖的右上角，來自重慶及湖北的3個黨參品種分布在二維圖的右下方；來自四川的6個黨參品種(7～12)遺傳距離較遠，分布在二維圖的左側，由于四川的6個黨參品種間的遺傳差異很小，因此密集地聚集在一起。從三維圖上更能看出品種間的分類很明顯。

3　結論與討論

DNA分子標記技術發(fā)展至今已有幾十種，ISSR分子標記技術由于具有成本低、可靠性及穩(wěn)定性高，試驗操作簡單、快速、高效等優(yōu)點，被廣泛應用到各類研究中，是理想的分子標記技術[7-8]。利用ISSR分子標記技術研究黨參遺傳多樣性的報道不多，陳大霞等用21條ISSR引物對18份川黨參材料擴增出223個DNA條帶，其中有166個多態(tài)性條帶，平均多態(tài)率為74.44%[9]；郭宏波從100條ISSR中篩選出13條引物，對來自山西和甘肅2省的150份黨參材料進行分析，擴增出127個清晰的DNA條帶，其中多態(tài)性條帶122個，平均多態(tài)率為95.77%[10]。以上研究表明，ISSR分子標記技術具有良好的穩(wěn)定性和準確性，適合用于種質資源遺傳多樣性的分析。

本研究選用洛龍黨參和四川、重慶、湖南各產地種植黨參品種，以黨參的幼苗為材料，對CTAB法進行優(yōu)化改良，提取黨參基因組DNA。通過優(yōu)化PCR反應體系，從100條不列顛哥倫比亞大學(UBC)公布的ISSR引物中篩選，以不同產地種植黨參的基因組DNA為模板，用篩選的ISSR引物進行分子標記PCR擴增，用聚丙烯酰胺電泳對產物進行檢測，有利于擴增產物的分辨。本次篩選出的10條ISSR引物對12個黨參品種共擴增出136個清晰的DNA條帶，多態(tài)性條帶114條，平均多態(tài)性比例為83.82%，最高為92.86%，最低為71.43%。其中引物UBC811擴增出的DNA條帶總數(shù)和多態(tài)性DNA條帶數(shù)最多，分別為19條和16條；而引物UBC835擴增的DNA條帶數(shù)最少，只有8條，多態(tài)性DNA條帶數(shù)6條。ISSR標記DNA圖譜表明，洛龍黨參與其他川黨參具有豐富的基因資源。基因型是遺傳和生態(tài)2個因素長期復雜的相互作用的產物，土壤和地理環(huán)境對種內變異起重要作用[11]。黨參大面積的種植通常采用種子和種根2種繁殖方式[9]，零星種植也常采用野生種及半野生種的馴化栽培，因此黨參種源復雜，加上道真、四川、重慶及湖北等地不同土壤和地理環(huán)境以及氣候與光照的影響，造成了黨參品種具有豐富的遺傳多樣性。

遺傳相似性分析與基于遺傳距離的聚類分析及主坐標分析顯示，12個黨參品種遺傳距離與地理位置分布有著明顯的相關性。四川省的6個黨參品種遺傳距離較遠，形成1支，且品種間的遺傳距離很近，相似性高；道真洛龍黨參與重慶黨參品種遺傳相似性最高，與湖北黨參品種間的遺傳相似性次之，與四川省的黨參品種遺傳相似性最低。張建清等利用隨機擴增多態(tài)性DNA標記(RAPD)技術分析甘肅栽培黨參的遺傳多樣性時，也發(fā)現(xiàn)黨參栽培居群的遺傳距離與地理分布呈現(xiàn)一定的相關性[12]，這可能與地域間基因的流動受限有關，也與大面積黨參種植采用種根繁殖有關， 影響了黨參種質的遺傳多樣性。因此，建議在今后的黨參育種過程中，考慮開展不同優(yōu)良品種中種群間的雜交育種，以獲得更廣泛的遺傳基礎，培育出優(yōu)良的新品種。

參考文獻：

[1]陳璺，韓豐，楊建敏，等. 洛龍黨參貯藏保鮮技術研究[J]. 貴州農業(yè)科學，2009，37(9)：216-217.

[2]龔其海，趙萬，余蘭，等. 兩種黨參多糖對小鼠免疫功能影響的比較[J]. 遵義醫(yī)學院學報，2012，4(34)：268-270.

[3]余蘭，陳華，婁方明，等. 洛龍黨參的多糖含量測定[J]. 貴州農業(yè)科學，2010，38(7)：190-191.

[4]周東新，祁建民，吳為人，等. 黃麻DNA提取與RAPD反應體系的建立[J]. 福建農業(yè)大學學報，2001(3)：334-339.

[5]白風虎，李德芳，陳安國，等. 改良CTAB法用于提取紅麻成熟葉片高質量DNA的研究[J]. 中國麻業(yè)科學，2007，29(3)：158-161.

[6]何峰，唐燦，王子雯，等. 巴中梔子遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志，2014，10(34)：782-786.

[7]Nagaoka T O，Gl I Y. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers[J]. Theoretical and Applied Genetics，1997，94(5)：597-602.

[8]Gilbert J E，Levis R V，Wilkinson M J. Developing an appiopriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections[J]. Theoretical and Applied Genetics，1999，98(6/7)：1125-1131.

[9]陳大霞，彭銳，李隆云，等. 利用SRAP和ISSR標記分析川黨參的遺傳多樣性[J]. 中國中藥雜志，2009，3(34)：255-259.

[10]郭宏波. 野生與栽培黨參遺傳多樣性及其保存和保護策略研究[D]. 上海：復旦大學，2007.

[11]王曉明，謝碧霞，李俊彬，等. 金銀花ISSR分子標記及遺傳多樣性分析[J]. 中南林業(yè)科技大學學報，2008，28(6)：14-18.

[12]張建清，蘇雪，吳瓊，等. 藥用植物黨參的RAPD分析[J]. 中藥材，2006，29(5)：417-420.