杭柏林， 徐　軍， 胡建和

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

抗菌肽(antimicrobial peptides，簡(jiǎn)稱AMPs)是生物機(jī)體內(nèi)具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性的多肽，是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分[1-2]。抗菌肽具有低毒、高效、抗菌譜廣、低耐藥等特點(diǎn)，成為抗生素替代物研究中的佼佼者[3-4]。Krause等從人血液中分離到肝臟表達(dá)的抗菌肽LEAP-1、2，其中Ⅱ型肝臟表達(dá)抗菌肽(liver-expressed antimicrobial peptide 2，簡(jiǎn)稱LEAP-2)有較強(qiáng)的抗微生物活性，但肽的序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)和表達(dá)等方面與其他已知肽類有差異[5]。從雞體內(nèi)分離到的LEAP-2由76個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有抗微生物(如沙門氏菌)的活性[6]。但雞LEAP-2(cLEAP-2)的許多生物信息學(xué)內(nèi)容還不是很清楚。因此，本研究基于cLEAP-2的氨基酸序列利用在線生物軟件和程序進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入探討其抗菌作用機(jī)制提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

雞內(nèi)源性抗菌肽LEAP-2的氨基酸來(lái)自網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/，登錄號(hào)為NP_001001606，其序列為MHCLKIMAFLLFFSLLLSQVYCASLHQPQPLLRLKRMT PFWRGVSLRPVGASCRDNSECITMLCRKNRCFLRTASE。

1.2　方法

1.2.1抗菌肽理化性質(zhì)分析利用www.expasy.org/tools網(wǎng)站中的ProtParam工具對(duì)抗菌肽cLEAP-2進(jìn)行理化性質(zhì)參數(shù)的分析。

1.2.2抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)利用https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page= npsa_sopma.html網(wǎng)站的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.2.3抗菌肽的跨膜區(qū)分析利用http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html網(wǎng)站的TMpred網(wǎng)站的工具進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2的跨膜區(qū)分析。

1.2.4抗菌肽的信號(hào)肽預(yù)測(cè)利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP網(wǎng)站的Signal4.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的信號(hào)肽。

1.2.5抗菌肽細(xì)胞內(nèi)定位的預(yù)測(cè)利用http：//www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/eu_predict.htm網(wǎng)站的亞細(xì)胞定位分析工具Sublocal v1.0進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2的細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測(cè)。

1.2.6抗菌肽糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/網(wǎng)站的NetOGlyc 4.0 Server工具和http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/網(wǎng)站的NetPhos3.1Server工具分析抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點(diǎn)。

1.2.7抗菌肽的三維空間結(jié)構(gòu)分析利用http：//swissmodel.expasy.org/workspace/index.php?func=modelling_simple1網(wǎng)站的工具進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。

1.2.8抗菌肽保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)利用http：//smart.embl-heidelberg.de/網(wǎng)站中的工具進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)。

1.2.9抗菌肽的抗原表位分析利用DNAStar軟件中的Protean工具進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析。

1.2.10抗菌肽的氨基酸序列進(jìn)化分析在GenBank中檢索到雞和其他42個(gè)物種的LEAP-2的氨基酸序列。利用DNAstar軟件中的MegAlign工具，采用Jotun Hein算法進(jìn)行抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列進(jìn)化分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　抗菌肽cLEAP-2的理化性質(zhì)

雞內(nèi)源性抗菌肽cLEAP-2分子式為C392H635N113O99S10，有76個(gè)氨基酸殘基，由20種基本氨基酸組成，所含的氨基酸殘基數(shù)量和含量見表1。cLEAP-2的分子量為 8 835.65 u，等電點(diǎn)為9.86，帶負(fù)電的殘基(Asp+Glu)數(shù)為3個(gè)，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)數(shù)為11個(gè)。在體外，cLEAP-2 的半衰期在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中為30 h，在酵母中>20 h，在大腸桿菌中>10 h。經(jīng)軟件計(jì)算，不穩(wěn)定指數(shù)為57.27，表明cLEAP-2為不穩(wěn)定蛋白?？侴RAVY值為0.205，表明cLEAP-2為疏水蛋白。

表1　cLEAP-2的氨基酸組成

2.2　抗菌肽cLEAP-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)

經(jīng)軟件分析(參數(shù)：window width為17，similarity threshold為8，number of states為4)，cLEAP-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖1)中，α螺旋(36個(gè)氨基酸殘基參與)占47.31%，延伸鏈(9個(gè)氨基酸殘基參與)占11.84%，β轉(zhuǎn)角(6個(gè)氨基酸殘基參與)占7.89%，無(wú)規(guī)則卷曲(25個(gè)氨基酸殘基參與)占32.89%。

2.3　抗菌肽cLEAP-2的跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

經(jīng)軟件分析(參數(shù)：跨膜螺旋長(zhǎng)度為17～33aa，得分>500)，cLEAP-2存在跨膜區(qū)(圖2)。從里(inside，簡(jiǎn)稱i)到外(outside，簡(jiǎn)稱o)，可能存在于第6～23位氨基酸殘基之間(得分為2 090)；從外到里，可能存在于第3～21位氨基酸殘基之間(得分為1 748)。

2.4　抗菌肽cLEAP-2的信號(hào)肽預(yù)測(cè)

經(jīng)軟件分析(Cutoff為0.45)，cLEAP-2存在信號(hào)肽(圖3)，位于第1～22位氨基酸殘基之間，得分為0.937。信號(hào)肽與成熟肽的剪切位點(diǎn)在第22位和第23位氨基酸殘基之間。

2.5　抗菌肽cLEAP-2的細(xì)胞內(nèi)定位

經(jīng)軟件分析，cLEAP-2主要定位于細(xì)胞核內(nèi)[可信度指數(shù)(reliability index)=4，預(yù)期準(zhǔn)確率(expected accurcy=91%)]。

2.6　抗菌肽cLEAP-2的糖基化和磷酸化位點(diǎn)

經(jīng)軟件分析，cLEAP-2存在糖基化位點(diǎn)(得分>0.5)，分別是第45、52位的絲氨酸殘基(得分分別為0.746、0.705)。對(duì)絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化進(jìn)行分析，結(jié)果見表2，有5個(gè)絲氨酸殘基和3個(gè)蘇氨酸殘基存在8個(gè)磷酸化位點(diǎn)(得分均>0.5)，但沒有酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。推測(cè)不同的位點(diǎn)可被不同的激酶引發(fā)磷酸化。

表2　cLEAP-2的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

注：PKC為蛋白激酶C，PKA為蛋白激酶A，PKG為蛋白激酶G，cdc2為細(xì)胞分裂周期蛋白2，cdk5為細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶5，RSK為核糖體S6激酶，CKⅡ?yàn)槔业鞍准っ?，unsp為某種非特異性蛋白激酶(即不在系統(tǒng)中的某種激酶)。

2.7　抗菌肽cLEAP-2的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)軟件分析，cLEAP-2的三級(jí)結(jié)構(gòu)見圖4。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與SWISS-MODEL TEMPLATE LIBRARY中模板[2L1qA](99.9 ?) HUMAN LIVER EXPRESSED ANTIMICROBIAL的序列相似度為80%，E值為9.02×10-11，預(yù)測(cè)結(jié)果的QMEAN Z值為-1.13。cLEAP-2由α螺旋、延伸鏈、β轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，與預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果一致。

2.8　抗菌肽cLEAP-2的功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

經(jīng)軟件分析，cLEAP-2與Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中LEAP-2的結(jié)構(gòu)相似(E值為7.8×10-44)。cLEAP-2的第37～76位氨基酸與PDB：2L1q│A相似(E值為1.0×10-17)，第1～22位氨基酸殘基為信號(hào)肽功能結(jié)構(gòu)域，這與前面的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。Low complexity region位于第9～18位氨基酸殘基(圖5)。

2.9　抗菌肽cLEAP-2的抗原表位分析

經(jīng)軟件分析，由圖6可知cLEAP-2的親水性、表面可及性、柔韌性和抗原性等指數(shù)。親水性指數(shù)>0、抗原性指數(shù)>0、可及性指數(shù)>1時(shí)，可能存在抗原表位。據(jù)此綜合分析，認(rèn)為cLEAP-2可能存在多個(gè)抗原表位。

2.10　抗菌肽cLEAP-2的氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化

將雞內(nèi)源性抗菌肽cLEAP-2的氨基酸序列與其他42個(gè)物種的LEAP-2的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，獲得系統(tǒng)樹。由圖7可知，雞(Gallusgallus)內(nèi)源性抗菌肽cLEAP-2與日本鵪鶉(Coturnixjaponica)LEAP-2的進(jìn)化關(guān)系最近，而與漠林鼠(Neotomalepida)LEAP-2的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。

3　討論

雞內(nèi)源性抗菌肽LEAP-2是陽(yáng)離子性抗菌肽[6]。本研究通過在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)cLEAP-2帶11個(gè)正電荷的氨基酸殘基和2個(gè)負(fù)電荷的氨基酸殘基，分析其總體帶正電荷，認(rèn)為cLEAP-2是陽(yáng)離子型抗菌肽。

一般認(rèn)為，抗菌肽的分子量小，沒有免疫原性[7]，且免疫學(xué)中認(rèn)為分子量在10 000以上的物質(zhì)有較好的抗原性[8-9]。cLEAP-2由76個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為8 835.65 u。然而，分子量雖小，但分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的物質(zhì)也具有抗原性[8]?？乖砦豢捎?～17個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成[10]。經(jīng)DNAStar軟件分析，cLEAP-2可能存在幾個(gè)抗原表位。因此，cLEAP-2存在抗原表位可能與其存在三維空間結(jié)構(gòu)有關(guān)。但這還需要進(jìn)一步深入探討。

分析后發(fā)現(xiàn)cLEAP-2存在信號(hào)肽。這與高榮琨等的研究結(jié)果[11]相一致。信號(hào)肽可使新合成的多肽分泌到細(xì)胞外，從而發(fā)揮生理功能[12]。由此推測(cè)，cLEAP-2表達(dá)后，可到達(dá)細(xì)胞外發(fā)揮抗病原微生物等正常生理活性。同時(shí)，分析后發(fā)現(xiàn)，cLEAP-2定位于細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)該定位的生物學(xué)作用還有待深入研究。

螺旋結(jié)構(gòu)是抗菌肽發(fā)揮抗菌活性的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[13]。經(jīng)分析，cLEAP-2的二級(jí)結(jié)構(gòu)中存在多個(gè)α螺旋區(qū)及其他結(jié)構(gòu)?？梢酝茰y(cè)，這些α螺旋可能是cLEAP-2發(fā)揮抗菌作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這一點(diǎn)得到功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)的佐證。

蛋白的磷酸化和糖基化可以改變蛋白的構(gòu)象和增加蛋白的穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)蛋白的許多生物學(xué)功能[14-15]。經(jīng)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，cLEAP-2有2個(gè)糖基化位點(diǎn)和8個(gè)磷酸化位點(diǎn)。同時(shí)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)cLEAP-2是不穩(wěn)定的疏水蛋白。因此，糖基化和磷酸化可能使cLEAP-2變得穩(wěn)定，從而使得cLEAP-2能很好地發(fā)揮其功能。

從表11中可以看出：基于K-means算法的評(píng)選方法得到的結(jié)果都是2015級(jí)的班級(jí)，這是因?yàn)槠淠昙?jí)較高，評(píng)價(jià)班級(jí)的相關(guān)屬性基本都有取值，而傳統(tǒng)評(píng)選方法得到的結(jié)果也基本都是較高年級(jí)的班級(jí)，同時(shí)，其存在部分屬性取值較高的、發(fā)展失衡的情況。因此，采用基于K-means算法的優(yōu)秀班集體評(píng)選方法，選取不同年級(jí)內(nèi)均衡發(fā)展的優(yōu)秀班集體，比傳統(tǒng)評(píng)選方法更合理。

分子進(jìn)化依賴于核酸和蛋白質(zhì)的序列信息，是闡明物種間相互關(guān)系的分子基礎(chǔ)[16]。通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，雞源抗菌肽LEAP-2與日本鵪鶉的LEAP-2之間的關(guān)系最近，表明抗菌肽LEAP-2在雞和日本鵪鶉中相對(duì)保守。

耐藥性或多重耐藥性細(xì)菌與真菌的出現(xiàn)使得現(xiàn)有抗菌藥物的療效低下或無(wú)效，對(duì)人類和動(dòng)物健康的威脅日趨嚴(yán)重[7，17]，尋找新的抗菌物質(zhì)具有重要意義[18-19]，抗菌肽被認(rèn)為是理想的抗生素替代物[17]。雞體內(nèi)的抗菌肽類型主要有β-防御素、cathelicidin和LEAP-2[1]，這幾種抗菌肽在結(jié)構(gòu)和功能上均有差異。目前，對(duì)雞抗菌肽LEAP-2的研究還很少。因此，通過生物軟件分析雞抗菌肽LEAP-2的生物信息學(xué)內(nèi)容為深入研究其功能與應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

4　結(jié)論

本研究結(jié)果揭示，雞內(nèi)源性抗菌肽LEAP-2為不穩(wěn)定的、帶正電荷的疏水性蛋白，有1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)信號(hào)肽，有2個(gè)糖基化位點(diǎn)和8個(gè)磷酸化位點(diǎn)，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)成，三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域與人LEAP-2有很高的相似度，存在抗原表位，與日本鵪鶉有非常近的進(jìn)化關(guān)系。

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