余　波， 傅科鶴， 杜尚廣

(南昌師范學(xué)院生物系，江西南昌 330032)

植物內(nèi)生菌是一類廣泛分布在植物組織內(nèi)，對植物不產(chǎn)生明顯病理影響的微生物類群，而國內(nèi)外對植物內(nèi)生菌的詳細(xì)研究始于20世紀(jì)80年代[1]。絕大部分內(nèi)生菌的生活史都在植物體內(nèi)完成，而植物體內(nèi)是一個相對封閉的內(nèi)環(huán)境：充足的養(yǎng)分、適當(dāng)?shù)难鯕狻⑸倭康母偁帉κ?。在植?內(nèi)生菌長期共生過程中，內(nèi)生菌能夠利用環(huán)境中的前體物質(zhì)合成與植物相似的次生代謝產(chǎn)物，這種特性在一些重要的藥用植物中顯得尤其重要和有意義。如傅科鶴等從產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇的紅豆杉內(nèi)生真菌中分離得到1株曲霉屬內(nèi)生真菌，從其發(fā)酵產(chǎn)物中獲得5種化學(xué)成分，其中一種對腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制作用[2]。在我國，圍繞藥用植物內(nèi)生菌的生理活性物質(zhì)研究是當(dāng)前的熱點。

互葉白千層(Melaleucaleucadendron)是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(Melaleue)的一種多年生常綠小灌木，原產(chǎn)于澳大利亞東部的昆士蘭州和新南威爾士州的北部海岸一帶。20世紀(jì)80年代后，我國、印度和東南亞的一些國家開始引種?；ト~白千層新鮮枝葉提取得到的精油俗稱茶樹精油，它是一種廣譜的殺菌劑，其產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于化妝、醫(yī)藥、食品等行業(yè)，具有較高的經(jīng)濟價值[3]。茶樹精油的廣譜抑菌特性，使其在替代化學(xué)農(nóng)藥方面具有較大的應(yīng)用潛力[4]。目前，研究認(rèn)為茶樹精油通過破壞膜結(jié)構(gòu)[5]，抑制微生物呼吸途徑中線粒體酶、脫氫酶的活性，從而影響細(xì)胞呼吸作用[6]、干擾胞內(nèi)大分子物質(zhì)活性[7]等形式達(dá)到殺菌作用。然而，對于其詳細(xì)的殺菌機制研究還不足。由于長期與植物共生，互葉白千層內(nèi)生真菌對精油都具有一定的抗性。從中篩選高耐受精油的菌株具有更大的概率，可以縮短篩選周期，提高效率。因此，本研究從互葉白千層內(nèi)生真菌中篩選高耐受精油的真菌，并對互葉白千層內(nèi)生真菌的多樣性進(jìn)行初步分析。后期將挑選同屬內(nèi)抗性強弱有明顯差異的2株菌株進(jìn)行比較基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組的研究，從分子水平上解釋茶樹精油的抑菌機制，深化對茶樹精油抑菌作用機制的理解，為更高效地利用茶樹精油抑菌提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1植株及精油互葉白千層采自江西省撫州地區(qū)，4-松油醇型；互葉白千層精油經(jīng)蒸餾法提取所得。

1.1.2試劑氨芐青霉素、鏈霉素購自Amresco公司，配成100 mg/mL，0.45 μm濾膜無菌過濾，分裝成小管，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂15 g，水1 L。

馬丁氏培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，1%孟加拉紅水溶液 3.3 mL，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1.0 L。

查氏培養(yǎng)基：NaNO33.00 g，K2HPO4·3H2O 1.00 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，KCl 0.50 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖 30.00 g，瓊脂15.00 g，蒸餾水1.00 L。

1.2　方法

1.2.1內(nèi)生真菌分離、純化分別取互葉白千層的根、莖、葉部位，用清水洗凈后置于紗布上晾干；在無菌操作臺上，將根、莖、葉浸沒于裝有20%次氯酸鈉的培養(yǎng)皿中2 min，然后轉(zhuǎn)移至無菌水中漂洗1 min，再轉(zhuǎn)至70%乙醇中30 s，最后用無菌水漂洗1 min；表面消毒處理后的樣品轉(zhuǎn)至無菌濾紙上，吸干水分后剪成1 m3大小的組織塊，接種于含抗生素的孟加拉紅培養(yǎng)基上，每皿間隔放置10個樣品，28 ℃倒置培養(yǎng)，及時將生長的菌株轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基。

1.2.2抑菌試驗茶樹精油用甲醇稀釋到35%(體積分?jǐn)?shù))的濃度后，取200 μL涂布于PDA平板(直徑8.5 cm)上，晾干10 min后，接種內(nèi)生真菌菌餅(直徑0.5 cm)，每皿接5個，重復(fù)3次，28 ℃倒置培養(yǎng)，及時測量菌落直徑，以甲醇作為空白對照。

1.2.3真菌鑒定

1.2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定挑取活化后的真菌菌絲，分別接種于PDA與察氏培養(yǎng)基中培養(yǎng)，肉眼觀察菌落正反面形態(tài)特征；采用插片法及玻璃紙法進(jìn)行孢子形態(tài)觀察，參照《真菌鑒定手冊》進(jìn)行菌種形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3.2分子生物學(xué)鑒定采用CTAB法提取真菌基因組DNA后，通過ITS1～I(xiàn)TS4引物對擴增后，測序，NCBI比對后鑒定菌種。

2　結(jié)果與分析

2.1　互葉白千層內(nèi)生真菌的分離鑒定

由表1可知，共分離純化獲得內(nèi)生真菌149株，其中根中分離到35株，莖中分離到102株，葉中分離到12株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定，共分為鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬、炭疽屬、鐮孢霉屬、木霉屬等6屬。其中根部主要是鐮孢霉屬、木霉屬等土壤習(xí)居種類占優(yōu)勢；莖部優(yōu)勢菌群為鏈格孢屬，且總體數(shù)量最多；葉部菌群種類較單一，數(shù)量很少，主要是炭疽屬與鏈格孢屬2類。

表1　互葉白千層內(nèi)生真菌鑒定

2.2　耐受茶樹精油內(nèi)生真菌篩選

2.2.1抑菌精油濃度的確定茶樹精油具有廣譜的抑菌效果，對細(xì)菌、真菌都有明顯的抑制能力。然而，不同來源及不同萃取手段獲得的精油抑菌IC50是不同的。為了確定合適的抑菌濃度，設(shè)置3種不同的精油濃度(甲醇溶解)——15%、35%、50%，隨機挑選40株內(nèi)生真菌進(jìn)行最佳濃度確定。表2結(jié)果表明，50%濃度過高，只有1株(2.5%)菌株能夠生長，獲得耐受菌株的數(shù)量過少，不利于后續(xù)研究；15%濃度偏低，32株菌株(80%)都能夠生長，與不加精油的培養(yǎng)基(對照)相比，只有3株受到10%以上的抑制；35%濃度有5株菌株(20%)能夠生長，完全不受抑制的有2株。綜合考慮篩選數(shù)量與濃度的關(guān)系，挑選35%的精油用于耐受菌株的篩選。

表2　抑菌精油濃度的確定

注：抑制率=(對照培養(yǎng)基菌落直徑-對應(yīng)的精油培養(yǎng)基菌落直徑)/對照培養(yǎng)基菌落直徑×100%。

2.2.2耐受精油內(nèi)生真菌篩選通過精油抗性篩選，從149株內(nèi)生真菌中篩選得到5株能夠在含35%精油的PDA平板上正常生長的菌株(表3)。其中編號為Ml10的菌株抗性最強，生長4 d后菌落直徑可達(dá)到5.30 cm，顯著高于其他4株菌株(P<0.05)。

表3　互葉白千層內(nèi)生真菌耐精油菌株篩選

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3　耐受精油菌株鑒定

2.3.1菌株Ml10形態(tài)學(xué)鑒定菌株Ml10在PDA平板上生長迅速，4 d即長滿平板并開始產(chǎn)孢。菌落初期為白色，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落中間由內(nèi)到外產(chǎn)綠色孢子，菌落背面無色。孢子梗環(huán)狀排列，主枝樹狀，分枝多，瓶梗短，基部細(xì)，分生孢子球形(圖1)。菌株Ml10初步鑒定為康寧木霉(Trichodemakonigii)。

2.3.2菌株18S rDNA鑒定通過CTAB法提取菌株Ml10的DNA(圖2-A)，然后以引物ITS1F/ITS4R擴增其ITS序列(圖2-B)。結(jié)果表明，擴增片段為610 bp；通過測序后NCBI比對分析，該菌株與康寧木霉的ITS序列100%配對，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌株為康寧木霉。

3　結(jié)論與討論

本研究分離獲得的菌株Ml10來自互葉白千層的根部，通過形態(tài)學(xué)鑒定后屬于木霉屬真菌。木霉菌屬于土壤常見的生防菌，在多種植物根部都有定植現(xiàn)象[8]。由于長期定植在互葉白千層根部，內(nèi)生菌對精油具有明顯的抗性[9]。后期研究將通過比較基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)技術(shù)，從DNA和蛋白質(zhì)水平分析這些菌株抗茶樹精油的機制，從而可以補充和完善茶樹精油抑制真菌機制理論，為更高效地利用茶樹精油提供理論依據(jù)[10]。

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