汪元浚　楊發(fā)滿　董慶玲　張培莉　劉　冀　李　蓉　李曉平　敬澤慧

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年科，青?！∥鲗帯?10001)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆，病因及病理生理改變受環(huán)境及遺傳等多種因素影響，其發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制尚未闡明〔1，2〕。miRNA是一類廣泛存在于哺乳動(dòng)物中高度保守的非編碼小RNA分子，能夠與靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，進(jìn)而抑制或降解靶基因mRNA，實(shí)現(xiàn)其在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。有研究表明超過70%的mRNA能夠表達(dá)于腦內(nèi)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮調(diào)控作用〔3〕。AD血清中存在著多種miRNA的異常表達(dá)，但具體的作用機(jī)制尚不明確〔4～6〕。本研究旨在探討miR-15a在AD中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1材料來源2016年 6 月至 2017年 4月經(jīng)青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年內(nèi)科診斷及治療的AD患者血液標(biāo)本30例為AD組，男20例，女10例，平均年齡(77.9±12.4)歲；正常健康血液樣本30例為對(duì)照組，男14例，女16例，平均年齡(73.4±11.8)歲。大鼠神經(jīng)細(xì)胞株(PC12)細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2主要試劑及儀器TRIZOL總RNA提取試劑、TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒均購自北京天根生物化學(xué)試劑公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒，Annexin V-FITC/PI流式雙染試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；兔抗B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2，c-myc，還原型輔酶Ⅱ(GAPDH)多克隆抗體均購自美國Abcam公司；天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及Caspase9活性檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；miR-15a NC及miR-15a mimics由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。168-1000XC型酶標(biāo)儀，F(xiàn)ACSCalibur型流式細(xì)胞儀購于美國BD公司；Labworks凝膠掃描成像系統(tǒng)購自美國UVP公司；PTC-250梯度PCR儀購自美國MJ Research 公司；DYY-Ⅲ穩(wěn)壓電泳儀購自北京六一儀器廠；5417R低溫高速離心機(jī)，Biophotometer核酸蛋白檢測(cè)儀購自德國Eppendorf。

1.3Realtime PCR檢測(cè)miR-15a表達(dá)水平TRIZOL試劑一步法提取血液白細(xì)胞層總RNA，紫外分光光度法測(cè)定總RNA的純度，根據(jù)吸光值計(jì)算樣品總RNA純度，當(dāng)RNA樣品純度在1.8～1.9，說明提取的總RNA純度好，能夠滿足下一步實(shí)驗(yàn)的要求。取焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的0.2 ml PCR反應(yīng)管，加入樣品總RNA 5 μg、隨機(jī)引物1 μg，再加DEPC dd H2O補(bǔ)足至20 μl，70℃變性5 min，進(jìn)行cDNA第一鏈合成?；赟YBR Green I熒光分析的Realtime PCR分析，預(yù)變性95℃，15 min；變性95℃，20 s；退火60℃，34 s；40個(gè)循環(huán)。用2-△△CT法鑒定miR-15a的表達(dá)量，其中△△CT=(待測(cè)組目的基因CT值-待測(cè)組內(nèi)參基因CT值)-(對(duì)照組目的基因CT值-對(duì)照組內(nèi)參基因CT值) 。

1.4實(shí)驗(yàn)分組采用20 μmol/L的淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導(dǎo)PC12細(xì)胞制作AD細(xì)胞模型，并將誘導(dǎo)成功的PC12細(xì)胞隨機(jī)分為模型組、陰性對(duì)照組、促進(jìn)組，其中陰性對(duì)照組及促進(jìn)組分別利用脂質(zhì)體LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染miR-15a NC及miR-15a mimics；另外選取不加任何藥物刺激的PC12細(xì)胞作為正常對(duì)照組。

1.5噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力將5×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于96孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，加入20 μl的MTT孵育4 h后，將上清液棄去，加入150 μl的二甲基亞砜使結(jié)晶物溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定OD570 nm值。

1.6Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡將8×103個(gè)PC12細(xì)胞接種到6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，每組收集1×105/ml個(gè)細(xì)胞，加入結(jié)合緩沖液吹打混勻后，依次加入5 μl的Annexin V-FITC及PI吹打混勻，并于室溫下避光孵育10 min，最后進(jìn)行流式檢測(cè)，對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析。

1.7細(xì)胞中Caspase3及Caspase9活性的檢測(cè)將8×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集，后按照Caspase3及Caspase9活性試劑盒說明書檢測(cè)活性，酶標(biāo)儀測(cè)定OD405 nm值，OD值即代表Caspase活性。

1.8Western印跡檢測(cè)Bcl-2及c-myc蛋白表達(dá)將8×103個(gè)PC12細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，按“1.4”分組及給藥后，冰浴條件下收集細(xì)胞并裂解，獲得的上清液即是總蛋白。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白樣品煮沸變性。制作濃縮膠及分離膠，并上樣，進(jìn)行凝膠電泳，聚偏氟乙烯(PVDF)轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，一抗4℃過夜，次日二抗孵育，最后在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1miR-15a在AD和對(duì)照組血液中的表達(dá)AD組miR-15a表達(dá)量(11.201±6.55)低于對(duì)照組(20.58±5.62)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-15a表達(dá)量的影響與正常對(duì)照組(4.89±0.48)比較，模型組及陰性對(duì)照組miR-15a表達(dá)量(1.95±0.20，1.94±0.19)顯著降低(P<0.01)；與模型組及陰性對(duì)照組比較，促進(jìn)組(4.78±0.48)顯著提高(P<0.01)。

2.3miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響如表1所示，與正常對(duì)照組比較，模型組及陰性對(duì)照組細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著提高(均P<0.01)；與模型組及陰性對(duì)照組比較，促進(jìn)組細(xì)胞活力顯著提高，細(xì)胞早期凋亡率及晚期凋亡率均顯著降低(均P<0.01)。

表1　miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力及細(xì)胞凋亡的影響

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與模型組及陰性對(duì)照組比較：2)P<0.01；下表同

2.4miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3及Caspase9活性的影響與正常對(duì)照組比較，模型組及陰性對(duì)照組細(xì)胞中Caspase3及Caspase9活性顯著提高，與模型組及陰性對(duì)照組比較，促進(jìn)組均顯著降低(均P<0.01)。見表2。

2.5miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，模型組及陰性對(duì)照組細(xì)胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達(dá)量顯著下調(diào)，與模型組及陰性對(duì)照組比較，促進(jìn)組均顯著上調(diào)(均P<0.01)。見表2，圖1。

表2　miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Caspase3、Caspase9活性及Bcl-2、c-myc蛋白表達(dá)的影響

圖1　miR-15a mimics對(duì)Aβ25～35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中Bcl-2及c-myc蛋白表達(dá)的影響

3　討　論

Hill等〔3〕發(fā)現(xiàn)了AD患者腦組織中存在著miRNA的異常表達(dá)，也在AD患者外周血及腦脊液中發(fā)現(xiàn)了miRNA(包括miR-29，miR-15，miR-107，miR-181及miR-146等)的差異性表達(dá)，這些miRNA可能直接或間接通過調(diào)控靶基因的表達(dá)或降解參與AD的發(fā)生發(fā)展〔3〕。miR-15家族包括miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-424、miR-497、miR-503及miR-646等。其中miR-15a位于人染色體13q14區(qū)域，是第一個(gè)被報(bào)道與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的miRNA，在眾多腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)甚至缺失〔7〕，Liu等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)AD新西蘭大白兔模型腦組織中miR-15a表達(dá)量下調(diào)。Satoh等〔5〕通過miRNA序列數(shù)據(jù)分析48例AD患者及22例正常對(duì)照血液中miRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-15a在AD血液中表達(dá)量下調(diào)。Bekris等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織、腦脊液及血液中miR-15a表達(dá)量下調(diào)。但miR-15a在AD發(fā)生發(fā)展過程中的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果與以往研究一致〔4～8〕，miR-15a在AD血液中低表達(dá)，提示miR-15a在AD發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。

AD患者海馬及皮層中Aβ的沉積能夠選擇性地?fù)p傷海馬神經(jīng)元或皮層的膽堿神經(jīng)元，是AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生過程中神經(jīng)元最終的結(jié)局，也是AD的主要病理特征。本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)〔8，9〕，結(jié)果表明miR-15a mimics能顯著提高Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞活力，且對(duì)Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有顯著的抵抗作用。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，細(xì)胞凋亡基因是其中一種，Bcl-2是最為常見的抑制細(xì)胞凋亡蛋白，能夠與促凋亡蛋白Bax形成異二聚體，阻斷凋亡信號(hào)傳遞到Caspase家族，促進(jìn)細(xì)胞存活與增殖。Caspase家族蛋白正常情況下以無活性酶原形式存在，在受到上游凋亡信號(hào)誘導(dǎo)后，Caspase9被活化，并通過級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，將凋亡信號(hào)傳遞到Caspase3，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外c-myc是原癌基因myb轉(zhuǎn)錄因子的一種，能夠調(diào)控多種基因表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期等。研究顯示Bcl-2及c-myc是miR-15a下游靶基因〔7〕，本研究結(jié)果表明miR-15a mimics能顯著降低Caspase3、9活性，并上調(diào)Bcl-2、c-myc表達(dá)，進(jìn)而抑制Aβ誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

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